، أشار الطولي Eyeblink تكييف الكلاسيكية في الفئران ثابت رئيس

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice. J. Vis. Exp. (109), e53310, doi:10.3791/53310 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

تكييف Eyeblink هو شكل من أشكال تكييف بافلوف ونظام نموذجي للتحقيق في الآليات العصبية للتعلم النقابي والذاكرة. وقد تم التحقيق فيها في مختلف الأنواع، بما في ذلك البشر، والأرانب والقطط والفئران، والفئران. ويشمل نموذج تقديم اثنين من المحفزات المقترنة: حافزا محايد مشروط (CS؛ على سبيل المثال، لهجة، ومضة من الضوء، أو التحفيز الطولي)، والمثير غير الشرطي البارزة (الولايات المتحدة، على سبيل المثال، وهي نفخة الهواء للعين، أو صدمة الحجاج). الولايات المتحدة يتسبب في غير المشروطة، والاستجابة eyeblink انعكاسية (أي اور). في نهاية المطاف، بعد عدة عروض من تقرن CS-الولايات المتحدة، موضوع يتعلم لربط CS مع الولايات المتحدة. هذا التعلم يتجلى في شكل استجابة مشروطة (CR)، وهو eyeblink التي تسببها خدمات العملاء وحدها التي تسبق تقديم الولايات المتحدة.

يتضمن تكييف Eyeblink في شكل أثر فاصل خالية من التحفيز من عدد قليل من حميلي ثانية undred الذي يفصل بين CS والولايات المتحدة (الشكل 1). تكييف أثر هو شكل من أشكال التعلم التعريفي لأنه يتطلب الوعي الطارئة التحفيز 1. الفجوة الزمنية تتطلب الحيوان للحفاظ على العصبية "أثر" من CS في مناطق الدماغ المقدم مثل الحصين من أجل الولايات المتحدة وCS لتصبح المرتبطة 1-6. جنبا إلى جنب مع المناطق الدماغ المقدم، تكييف أثر يعتمد أيضا على المخيخ 7.

تكييف Eyeblink هو، بالتالي، نموذجا مفيدا للتحقيق في جوانب متعددة من الذاكرة، بما في ذلك الاستحواذ، وتوحيد، واسترجاعها. خلال تكييف eyeblink، يتم تقديم مجموعة مراقبة من الحيوانات مع المثيرات المفردة في ترتيب عشوائي لاختبار pseudoconditioning أو محسسة الردود على CS التي قد تكون ناجمة عن عرض الولايات المتحدة وحدها بدلا من جمعية CS-الولايات المتحدة المستفادة.

وappara يشيع استخدامهاطوس للتحقيق في تكييف eyeblink في القوارض هو المجلس الذي يسمح للقوارض على التحرك بحرية أثناء عملية التدريب 8-10. مع هذا النوع من الأجهزة، ويرد على حبل عادة إلى خوذة وهذا هو الملصقة على جمجمة القوارض. حبل يسمح لتسليم الولايات المتحدة (وأحيانا CS) ولنقل استجابة الحيوان إلى تلك المحفزات (أي استجابة eyeblink) 10. ويمكن تعديل حبل نفسها على أساس نوع من المحفزات تسليمها وكيف يتم تسجيل استجابة eyeblink.

سبب استخدام "الحركة بحرية" الفئران المربوطة لتكييف eyeblink هو أن الفئران النضال ضد ضبط النفس. على الرغم من الأنواع الأخرى قد تكون أكثر قابلية للضبط النفس، والميزة الرئيسية لاستخدام الفئران في التجارب تكييف eyeblink هي أن معظم سلالات متحولة المعدلة وراثيا المتاحة هي سلالات الفئران. بالإضافة إلى تكافح، الدقة الكاملةtraint من الفئران يؤدي إلى اكتئاب حاد. ومن شأن إعداد الماوس ثابت رئيس أن يقلل من الإجهاد زيادة المعلومات الفسيولوجية التي يمكن الحصول عليها خلال تكييف eyeblink. على سبيل المثال، أن هذا النظام يسمح التصوير من الخلايا العصبية القشرية مع 2-الفوتون المجهري 11.

وقد استخدمت الاستعدادات الثابتة الرأس في التجارب السابقة للتصوير الضوئي من القشرة من خلال زرع في الجمجمة القابلة للإزالة، في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من المخ القوارض مع المصفوفات صمام رباعي، واثنين من الفوتون التصوير الكالسيوم، وأيضا كمنصة للتكييف eyeblink في الفئران 11 -16.

في نظام ثابت الرأس، وضمان تحفيز موثوقة والتسجيلات دون ضبط النفس الكامل من الفأرة (الشكل 2). يتم تثبيتها ونقش مثل تلك المستخدمة في نظام التنقل بحرية لجمجمة الفأر. خلال التدريب، ويتم تثبيتها على خوذة إلى الموصل التي تعلق على القضبان على حلقة مفرغة أسطواني من أجل استقرار رأس القوارض (الشكل 2A). مطحنة أسطواني يسمح الماوس للراحة بشكل مريح، ولكن إذا كان الماوس يريد ذلك، يسمح أيضا لتشغيل أو المشي. مع استخدام هذا النظام، والفئران يمكن تدريب مع اهتزاز الطولي كما CS وصدمة كهربائية خفيفة الحجاج مثل الولايات المتحدة (الشكل 1). يتم تسليم الولايات المتحدة من خلال الأسلاك توضع جراحيا تحت الجلد الجانبي للعين. يتم تسليم CS عبر مشط التي يتم تركيبها على 2-طبقة مستطيلة الانحناء المحرك (الشكل 2B). ثم يتم إرفاق مشط والانحناء المحرك إلى قاعدة المغناطيسية التي يتم نقلها إلى الموقف الصحيح خلال التدريب ويتم تعديل لتسليم الأمثل لكل حيوان على حدة. يتم وضع مشط لتنتشر على شعيرات المحدد. خلال تسليم CS، يتم إرسال إشارة إلى المحرك الانحناء أن يزيح المشط ويؤدي إلى اهتزاز شعيرات 17.

وقد استخدمت = "jove_content"> المحفزات الأخرى مثل نغمة أو ومضة من الضوء والمحفزات مشروطة فعالة في الفئران في 16،18،19 الماضي. يتم اختيار الخط الطولي التحفيز سبب CS في هذا النموذج التجريبي هو اعتماد الحيوانات الفئران على vibrissae من أجل إدخال المعلومات جسدي حسي خلال الاستكشاف. وقد تبين الطولي التحفيز لتكون موثوقة وفعالة CS 20. وعلاوة على ذلك، وبالنظر إلى الركيزة القشرية راسخة والمنظم للنظام vibrissae (أي القشرة برميل)، وتحفيز الطولي كما يوفر CS أداة أنيقة لرسم خرائط التغييرات القشرية واللدونة المرتبط بتعلم تكييف eyeblink 20،21. ويسمح نظام ثابت رئيس لتحفيز الدقيق للشعيرات المحدد إلى مقارنة الاستجابات بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية تلقي المدخلات من شعيرات غير حفز حفز. وأخيرا، فإن العديد من سلالات من الفئران يحمل المرتبطة بالعمر فقدان السمع في سن نسبيا الكبار 16). لا يتأثر الطولي التحفيز عن طريق أي من هذه المضاعفات.

المقدمة هنا هي تعديلات فريدة وهامة على الاستعدادات الثابتة رأس أخرى لتكييف eyeblink، بما في ذلك أساليب CS والولايات المتحدة تسليم، والاستحواذ على استجابة eyeblink. وتتجلى مصداقية هذا الجهاز ونموذج التدريب في تكييف eyeblink من منحنيات من الفئران مكيفة ومنحنى التعلم مسطح نسبيا من الحيوانات السيطرة pseudoconditioned (الشكل 7A) التعلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان جامعة نورث وسترن واستخدام اللجنة استنادا إلى المبادئ التوجيهية الصادرة عن المعهد الوطني للصحة.

1. اسطوانة (الشكل 2A)

  1. بناء الاسطوانة كما وصفها Chettih وآخرون. وHeiney وآخرون من رغوة اسطوانة طويلة 14-15. قطع طول 10 سم من اسطوانة وحفر حفرة من خلال مركز لتتناسب مع المحور، وهو قضيب معدني 12.7 ملم (0.5 بوصة) في قطر. جبل اسطوانة مع المحور لها على اللوح المعدني البصرية كما وصفها Heiney آخرون أو دعم آخر (على سبيل المثال، زجاجي) 15.
  2. إقامة اثنين من قضبان معدنية رأسية من 12.7 ملم وقطرها على جانبي الاسطوانة.
  3. نعلق اثنين يتصاعد الزاوية اليمنى على قضبان معدنية.
  4. تأمين اثنين من أكثر قضبان (5 سم، 12.7 ملم في القطر) من خلال يتصاعد الزاوية اليمنى. عشر شطبةالبريد ينتهي من هذه القضبان ومستوى غاياتهم فوق مركز الاسطوانة (الشكل 2G).
  5. حفر والاستفادة من خلال ثقب الغايات الموجهة من قضبان لتتناسب مع اثنين من 4-40 مسامير الجهاز الذي سيعقد أجنحة الموصل في مكان (الشكل 2G).

2. تجميع نظام تحفيز الشارب (الشكل 2B)

  1. قطع شريحة 10-أسنان المشط من تمشيط الشعر بانتظام.
  2. قطع فتحة حوالي 2-3 ملم واسعة، وحوالي 5 ملم عميق على الجزء العلوي من مشط لقبول 2-طبقة الانحناء مستطيلة المحرك.
  3. لحام سلك واحد على كل سطح من المحرك الانحناء. استخدام لحام وتدفق المقدمة من قبل الشركة المصنعة. تغطية المحرك ولحام مع الشريط الكهربائي لحماية الماوس والمستخدم من التيار الكهربائي.
  4. زلة الشريط المحرك في شق يقتطع من مشط بحيث يجلس الانحناء الشريط المحرك عمودي على الطائرة من المشط. زاوية المشط بحيث يتم إمالتها في 45 درجة وأكثر طبيعية يتبع منحنى وجه الفأر.
  5. تأمين نهاية الشريط المحرك إلى أعلى المشط مع الايبوكسي الإعداد السريع.
    ملاحظة: الأسلاك ملحوم على الانحناء الشريط المحرك يجب أن تكون متصلا إلى مقاومة متغيرة من شأنها أن توفر 40 فولت إلى المحرك. وقد أظهرت التجارب السابقة أن 40 فولت فعالة لتكييف ولكنها لا تثير أي ردود جفل.
  6. وضع المحرك الانحناء والمشط على جبل متحرك. حامل ماصة تعلق على قاعدة مغناطيسية تستخدم عادة لفي المختبر منصات الكهربية يعمل بشكل جيد.

3. تجميع الموصل أن يتصاعد إلى قضبان فوق اسطوانة (الشكل 2C، 2E)

ملاحظة: الرابط هو 3-D المطبوعة الشريط 7 حفرة على غرار من AMPHENOL 221 سلسلة الشريط النايلون المستخدمة في حبل من فايس وDisterhoft وجالفيز آخرون 10،17.

  1. اضغط على أول حفرة في الشريط ل0-80 س 1"آلة المسمار، وهذا سيكون بمثابة المسمار تأمين لترسيخ خوذة إلى الموصل. يلصق جوز 0-80 لرئيس المسمار قفل مع الغراء cyanoacrylic من أجل تسهيل تحول المسمار باليد.
  2. ترك حفرة واحدة فارغة بعد ثقب استغلالها (للسماح غرفة للالجوز 0-80 الجهاز)، ودفع خمسة مآخذ relia تاك مطلية بالذهب من خلال الثقوب الخمسة المتبقية.
  3. تجريد الطلاء من خمسة أسلاك طويلة (الأسلاك التي تم الحصول عليها من كابل إيثرنت) وحام لينتهي من مآخذ.
    ملاحظة: سيتم استخدام الأسلاك الأولين لتسجيل electromyographic إشارات (EMG) التي من شأنها كشف استجابة eyeblink التالية تصفية إشارة والتضخيم من مكبر للصوت. ثاني اثنين سيلقي إشارة صدمة من المعزل التحفيز. سوف السلك الماضي بمثابة اتصال الأرض. وسيتم ربط هذه الأسلاك إلى النظم المستخدمة لتوقيت تسليم CS-الولايات المتحدة.
  4. ضمان الربط الكهربائي بين الأسلاك ومآخذ مع ... المزيد الصورةimeter. وضع المتعدد على الإعداد الاستمرارية وعقد واحد من تحقيقات للدبوس والتحقيق آخرين لينتهي تجريده من السلك. دبابيس والأسلاك هي متصلة كهربائيا عندما المقاومة منخفضة والمتعدد تنبعث هجة.
    1. بدلا من ذلك، إذا لم يكن المتعدد إعداد الاستمرارية، وقياس المقاومة بين المسامير والأسلاك. هناك استمرارية الكهربائية إذا كان هناك مقاومة تذكر جدا قياسها.
  5. إعداد أجنحة للموصل من اثنين TO-220 الترانزستورات الاسلوب. قطع الخيوط باعث، وقاعدة، وجمع من الترانزستور ومستوى السطح حتى أنه يمكن اضافته إلى الموصل.
  6. قطع حافة علامة التبويب متزايدة لاختراق حفرة ذلك علامة التبويب يمكن ان تنزلق تحت رأس المسمار.
  7. الايبوكسي الترانزستورات إلى الموصل. سيتم استخدام ثقب في التبويب متزايدة لتأمين الموصل إلى قضبان فوق الاسطوانة.
  8. تطبيق الايبوكسي لقاعدة الأسلاك العلاقات العامةotruding من مآخذ، والسماح للالايبوكسي لتجف. سوف الايبوكسي عزل وحماية الاتصالات.

4. إعداد غطاء الرأس (الشكل 2D، 2E)

ملاحظة: شريط خوذة هو 3-D المطبوعة الشريط 7 حفرة على غرار من قطاع سلسلة من النايلون AMPHENOL 221 تستخدم لنقش من قبل وايس وDisterhoft وجالفيز آخرون 10،17. لم تعد تصنع هذه القطعة تجاريا. ملف طابعة يمكن تحميلها من موقع هذه المجلة.

  1. اضغط على أول حفرة في الشريط ل0-80 س 1 "آلة المسمار وترك حفرة واحدة فارغة بعد أول حفرة.
  2. دفع خمسة دبابيس مطلية بالذهب من خلال الجزء السفلي من الثقوب الخمسة الباقية (من خلال نهايات أضيق). استخدام ملزمة لتسهيل دفع المسامير في قطاع بالتساوي.
  3. باستخدام متجرد الحراري، وإزالة حوالي 0.5 سم من طلاء بوليميد قبالة نهاية أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ (0.005 في. قطر)، لحام نهاية تجريده من ثغضب لافتتاح واحد من المسامير وقطع الأسلاك إلى 0،6-0،7 سم.
  4. تجريد حوالي 0.2 سم من نهاية السلك للسماح الحالية لتمريرها إلى الحيوان.
  5. كرر الخطوات من 4،3-4،4 للأسلاك الثلاثة المتبقية.
    ملاحظة: سوف السلكين أول تسجيل ردود EMG في حين أن اثنين من الثاني سيعمل على تقديم صدمة للحيوان.
  6. باسم الماضي (الخامس) سلك سيكون بمثابة سلك الأرض، وقطع حوالي 5 سم من غير المصقول أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ (0.005 في. القطر)، وحام إلى دبوس المتبقية.
  7. ضمان استمرارية بين الأسلاك والمسامير مع المتعدد. (في حالة سلك الأرض، وهو غير المصقول، والتحقيق متعدد يمكن وضعها في أي مكان على طول السلك.)

5. إعداد الجراحي (الشكل 2F)

  1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية، بما في ذلك خوذة. تعقيم نقش عن طريق نقع في الكحول ثم الشطف بمحلول ملحي معقم.
  2. تخدير الماوس في غرفة الاستقراء مع 3-4٪ ضدaporized الأيزوفلورين مختلطة مع معدل تدفق 1-2 لتر من الأوكسجين في الدقيقة الواحدة.
  3. تأكد من أن هذا الحيوان هو تخدير كامل مع قليل أخمص قدميه. الفأر هو تخدير تماما عندما لا يستجيب بالغريزة لقرصة أخمص قدميه.
  4. وبمجرد أن الحيوان قد تم تخدير كامل، وضخ جرعة من هيدروكلوريد البوبرينورفين بمثابة مسكن (،05-2 ملغم / كغم، SC)، حلاقة الجزء العلوي من رأس الحيوان، وضعه على وسادة التدفئة غطت على قاعدة من الإطار التجسيمي ، والتأكد من أن الحيوان هو تخدير كامل، وتأمين الرأس إلى الإطار. الحفاظ على تدفق الأيزوفلورين تبخيرها للحيوان، والتحول إلى 2٪ في معدل تدفق 1-2 لتر من الأوكسجين في الدقيقة الواحدة. تنطبق على كمية صغيرة من مرهم للعين للقرنية العين.
  5. تطهير فروة الرأس مع بوفيدون اليود والكحول ثلاث مرات لكل منهما، بالتناوب بين البلدين.
  6. بشفرة رقم 10 أو 15 مشرط، وجعل شق على طول خط الوسط من فروة الرأس، كاشفة عن الجمجمة من الأمام رانه العينين إلى الماضي العظم الجداري (~ 1.5-2 سم).
  7. كبح اللوحات من الجلد مع مقاطع صغيرة. وضع مقطع واحد فوق العين، واحدة على طول وسط محور منقاري الذيلية، واحدة في الجزء الخلفي من الجمجمة بشكل ثنائي (أي استخدام ستة مقاطع في كل شيء). من أجل منع خوذة قلعي، كشف أكبر قدر من الجمجمة ممكن، بما في ذلك الجوانب والخلف. سيؤدي هذا إلى زيادة المساحة السطحية للتطبيق الاسمنت لاصقة الملاط.
  8. باستخدام مشرط، كشط على طول الجزء العلوي من الجمجمة لإزالة السمحاق وضمان سطح العمل نظيفة وجافة. تنظيف الجزء العلوي من الجمجمة مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين ثلاث مرات.
  9. حفر اثنين من الثقوب في الجمجمة بحجم 34 مقلوب لدغ مخروط أو 1.6 ملم النقش القاطع مثقاب لقبول 00-90 مسامير (0.0625 في. لفترة طويلة). ومسامير توفر اتصال الأرض الكهربائي. وضع فتحة واحدة أمام Bregma، والآخر أمام لامبدا، يسار خط الوسط عندما تكييف وrighر العين. وضع المسمار واحد في كل حفرة. خفض المسمار 0.28 ملم في الجمجمة لكل بدوره الكامل. لفتين كاملة كافية.
  10. إنشاء عدة ديفوتس صغيرة من حوالي 0.75 ملم في القطر على الجمجمة من أجل زيادة مساحة السطح وقوة قبضة للأسمنت.
  11. اتخاذ خوذة المنجزة والرياح سلك الأرض في تكوين الرقم ثمانية حول المسمارين. تسمح بعض الركود (~ 1.5 سم بين الخوذة والمسمار) في سلك الأرض حتى خوذة يمكن وضعه بشكل صحيح في وقت لاحق.
    ملاحظة: الرقم ثمانية عادة يضمن الربط الكهربائي جيد بين الأسلاك والمسامير الأرض. ويمكن أيضا السلك يكون ملحوم على المسمار لضمان الربط الكهربائي.
  12. تطبيق الاسمنت لاصقة الملاط. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لخلط الاسمنت طين لاصق أو مزيج 4 تغرف من مزيج L-مسحوق، 8 قطرات من القاعدة، و 2 قطرات من المحفز في صحن خلط السيراميك البارد (ضمان الشريط درجة الحرارة سن طبق خلط سوداء تماما.) درجة الحرارة الباردة تمتد ساعات العمل من الاسمنت.
    1. معطف الجمجمة ومسامير تحرري مع الاسمنت الملاط وتسمح الاسمنت لتجف. وهذا ينبغي أن يستغرق سوى بضع دقائق.
  13. بعد أن يجف الأسمنت، ووضع خوذة عموديا، مع دبابيس واقفا، فوق الجمجمة. عقد خوذة في مكان مع حامل مشابهة للموصل
    ملاحظة: انظر "3. تجميع رابط" -The حامل تحتاج فقط أن يكون قطاع خمس ثقب مع مآخذ مطلية بالذهب من أجل الحصول على دبابيس من خوذة. يتم إرفاق حامل لذراع على الإطار التجسيمي. استخدام حامل والذراع يسهل تحديد المواقع من خوذة والأسلاك.
  14. بعد أن تم وضع الخوذة، قشر يعود الجلد حول منطقة الحجاج ووضع السلكين صدمة للسماح 0.2 سم تجريده نهاية للراحة تحت الجلد، وحوالي 2-4 ملم الذيلية مباشرة إلى إرنست و يونغه. لا تسمح لطرفي السلكين للمس بعضهم البعض. ضع السلكين EMG على العضلية العين الدويرية فوق محجر العين.
    1. إذا لزم الأمر، وقطع أطراف الأسلاك إذا كانت طويلة جدا ويبدو كما لو أنها قد تخدش مباشرة المدار ويؤدي إلى عدوى. إذا قطع طرفي السلك، تأكد من أن هناك ما يكفي من الأسلاك العارية المكشوفة. بدلا من ذلك، إذا يبدو أن أسلاك طويلة جدا، ثني الأسلاك الظهر في القاعدة، حيث أنها تمتد من خوذة.
    2. تدعيم قاعدة من الأسلاك (أي نهاية قرب خوذة) في مكان على الجمجمة مع انتشار صغير من الاسمنت طين لاصق وتسمح لتجف (استخدام نصف جزء وصفه سابقا).
  15. إزالة مقاطع صغيرة وبلطف أضعاف اللوحات من الجلد إلى أكثر من الاسمنت. سماح للجلد ليستقر بشكل طبيعي لمنع التوتر على أي جزء من الجلد وذلك لتجنب تشويه جفن، والوقاية من الاستجابة eyeblink،والضيق للحيوان.
  16. اغلاق منطقة مكشوفة مع الاسمنت الأسنان، والتي تغطي كل شيء من الجلد المنقوش إلى حافة الجزء العلوي من خوذة مع الاسمنت. اتخاذ مزيد من الحذر لتجنب يقطر الاسمنت على العينين أو دبابيس من خوذة. جزئيا الاسمنت علاجه يمكن ممهدة والتلاعب مع مسحة القطن التي المبلل المذيبات الاسمنت الأسنان. السماح للأسمنت حتى يجف تماما قبل إزالة حامل خوذة.
  17. السماح للحيوان للتعافي من التخدير على سطح استعد قبل استبدال الحيوان مرة أخرى في قفصه. إدارة Metacam (1 ملغ / كغ، SQ) ثم ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
  18. السماح للحيوان 5-7 أيام من التعافي قبل إجراء الاختبار أو التدريب. الحفاظ على الرعاية القياسية بعد العمليات الجراحية للحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية مؤسستكم. يجب فحص الحيوان مرة واحدة يوميا على الأقل بعد أن تعافى من عملية جراحية. لمشاهدة علامات سوء الأكل و / أو الشرب وسلوك فاتر. إذا ألمويشتبه، وتوفير Metacam كل 24 ساعة (الجرعة نفسها كما في نهاية مرحلة ما بعد الجراحة) حتى التخفيف. يدوكائين يمكن تطبيقها محليا على الجرح إذا كان الحيوان هو خدش أو تظهر علامات الانزعاج.

6. وضع الماوس على اسطوانة والتدريب (الشكل 2G)

  1. لوضع الماوس على الاسطوانة، وكبح جماح الماوس مع يد لفترة وجيزة خلال عقد من قبل الذيل مع يد واحدة وبعد ذلك يمسك الماوس وراء الكتفين مع السبابة والإبهام مع الآخر. التفاف الأصابع المتبقية حول البطن الماوس، والجذع.
  2. مع اليد لا يقيد الماوس، ونعلق موصل إلى خوذة على رأسه الماوس، وتحويل المسمار تأمين.
  3. ضع الماوس بلطف على اسطوانة والاحتفاظ بها في المكان في حين ربط موصل إلى الإطار. استخدام المسمارين لربط موصل إلى الحانات فوق الاسطوانة.
  4. مرة واحدة وقد تم تأمين الموصل إلى الإطار اسطوانة، releبورصة عمان قبضتها على الماوس. يعطي الماوس يوم واحد من دورتين من التعود على الاسطوانة. السماح لكل دورة التعود نفس مدة كل دورة تكييف.
    1. سجل معدل وميض عفوية خلال التعود وقبل فضح الفئران إلى اهتزاز الطولي CS من أجل تقليل حدوث ردود إجفالية. تطبيق CS كما حدث خلال جلسة تكييف الفعلية، ولكن من دون الصدمات الكهربائية في الولايات المتحدة.
    2. تطبيق التحفيز الطولي CS عن طريق وضع وثيقة النظام بيزو (حوالي 0.5 سم) إلى جانب مكيفة (الجانب الأيمن) من الفأرة، بينما الانزلاق أسنان المشط على شعيرات فردية. تأكد من أن نفس شعيرات يتم تحفيز يوما بعد يوم من خلال وضع نظام بيزو في نفس الموقف من يوم لآخر.
  5. بدء تدريب الماوس على الإشراط الكلاسيكي. تقديم دورتين للتدريب في اليوم لمدة خمسة أيام. ترك حوالي ساعتين بين كل دورة تدريبية.
    1. إلى مكيفة مجموعة، أطعمة لذيذةالنسخة الثلاثين محاكمات في كل دورة من اهتزاز الطولي 250 ميللي ثانية طويلة CS (60 هرتز) يقترن مع نبضة كهربية 100 ميللي ثانية طويلة في الولايات المتحدة (0.3 مللي أمبير - 3 مللي أمبير، وسلمت من WPI A385R المعزل التحفيز). فصل CS والولايات المتحدة مع 250 مللي ثانية طويلة خالية من التحفيز فترة التتبع لجعل هذه المهمة تعتمد على الحصين (الشكل 1) 23.
    2. ضبط شدة الصدمة الكهربائية لكل حيوان بحيث يتم أثار لمح البصر. محاكمات منفصلة مع فاصل زمني intertrial عشوائي من 30-60 ثانية (المتوسط ​​من 45 ثانية، وإجمالي مدة 30 دقيقة لكل جلسة).
    3. تقديم ثلاثين أونبايريد CS وحده، والتجارب وحدها الولايات المتحدة كل (أي ما مجموعه ستين تجارب) إلى مجموعة pseudoconditioned، باستخدام المعلمات التحفيز نفسها كما جاء لمجموعة مكيفة. ضمان pseudorandomized خدمات العملاء وحده، والولايات المتحدة التجارب وحدها بحيث لا التحفيز يتم تقديم أكثر من مرتين على التوالي. فصل كل محاكمة بمتوسط ​​فترة intertrial 22.5 ثانية.
  6. ديضجيج في الخلفية الكبد في ديسيبل 65 في جميع أنحاء التعود والتدريب من أجل تخفي أي ضجيج والاهتزاز الناتجة عن التحفيز والتشجيع والطولي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تدريب 8-10 أسبوع من العمر من الذكور C57Bl6 / J الفئران على تكييف أثر eyeblink على جهاز مطحنة أسطواني الثابتة الرأس. تم تدريب 8 الفئران مع إرفاقها العروض CS-الولايات المتحدة (مجموعة مكيفة) و 9 الفئران تم تدريب مع المفردة العروض CS والولايات المتحدة (مجموعة pseudoconditioned).

وتظهر التسجيلات سبيل المثال EMG من استجابة مشروطة من ماوس مشروط في أرقام 3 و 4. تم تصحيح التسجيلات EMG لكل محاكمة ودمجها مع 10 ثابت وقت مللي ثانية. ويبين الشكل (5) وتصحيح ودمج آثار استجابة EMG متوسط ​​في جميع المحاكمات لكل من 10 جلسات لكل ومكيفة (A) وpseudoconditioned (B) الماوس. ويمكن رؤية تطور ردود مشروطة في الشكل 5A، مع ردود الحصول على أكبر أقرب إلى ظهور الولايات المتحدة. لا ينظر هذا التطور طن الردود في الشكل 5B pseudoconditioned.

تطور جيدا توقيت، ويمكن أيضا أن ينظر إليه هكذا، تعلمت جيدا ردود مكيفة في الشكل (6). ويبين الشكل (6) ورسوم بيانية من الوقت إلى ذروة الرد التالي CS بداية. هناك ذروة الأولية في الرسم البياني بين 0-150 ميللي ثانية بعد CS بداية. هذه الذروة الأولية يمكن أن ينظر إليه في أقرب وقت في جلسة 1. مع المزيد من الدورات التدريبية، وهناك تطوير الذروة الثانية في الرسم البياني بين 400-500 مللي ثانية بين الحيوانات مكيفة، مما يدل على تطوير استجابات مكيفة توقيت أفضل.

ويبين الشكل 7A في المئة التكيف الفعل المكيفة بلغ متوسط ​​تسجيله من الفئران مشروطة وpseudoconditioned. تعتبر الاستجابات التكيفية مكيفة أن يكون النشاط الكبير الذي هو الحاضر لا يقل عن 20 ميللي ثانية فرنكابداية خام الأمريكي (أي لا يقل عن 4 SD أكبر من النشاط متوسط ​​الحالية 250 مللي ثانية قبل CS بداية). خلال دورات تدريبية، وأظهرت الفئران مكيفة التعلم التدريجي للنموذج تكييف طريق عرض الاستجابات التكيفية أكثر مشروطة مع كل دورة تدريبية بحيث الفئران مشروط أظهرت استجابات أكثر بكثير التكيف مكيفة من الفئران pseudoconditioned (مجموعات، F (1،15) = 20.62، ص <0.0005؛ والاجتماعات، F (1،9) = 9.987، P <0.0001، والمجموعات * جلسات، F (1،9) = 5.977، P <0.0001). لاحظ أن مجموعة pseudoconditioned عادة عرضت الردود الجاهزة الزائفة على أقل من 20٪ من المحاكمات.

ويبين الشكل 7B وبلغ متوسط ​​مساحة استجابة مشروطة (المنطقة تحت منحنى استجابة EMG تصحيحه ومتكاملة) لكل من الفئران مكيفة وpseudoconditioned خلال دورات تدريبية عشر. مقارنات المخطط مع تدابير أنوفا المتكررة على مدى لاسر أربع جلسات (أي جلسات 7-10، وبمجرد أن مجموعة مكيفة وصلت إلى معيار التعلم من 60٪ CR) تظهر التأثير الرئيسي كبيرا من المجموعة، مشيرا إلى أن منطقة CR كانت أكبر في المجموعة مكيفة مما كان عليه في آخر مجموعة pseudoconditioned التعلم المعيار (مجموعات، F (1،14) = 5.733، ف <0.05؛ الدورة، F (1،3) = 0.486، NS، والمجموعات * الدورة، F (1،3) = 0.432، م).

ويبين الشكل 7C في المتوسط ​​في المئة ألفا (جفل) ردود المسجلة من الفئران مكيفة وpseudoconditioned. ردود ألفا النشاط ضمن 50 مللي من CS بداية تكون على الأقل 4SD فوق النشاط الأساسي نفسه. خلال الدورات التدريبية ومكيفة وpseudoconditioned الفئران عادة عرضت الردود ألفا على أقل من 25٪ من التجارب، مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين الفئران مشروطة وpseudoconditioned (مجموعات، (F 1،15) = 2.502، م). عشرالبريد التدابير المتكررة أنوفا، مع ذلك، تكشف عن وجود تفاعل كبير من المجموعات والدورات ويرجع ذلك إلى انخفاض في الاستجابات pseudoconditioned والحفاظ على ردود ألفا في نحو 25٪ بالنسبة للفئران مشروط (مجموعات * جلسات، F (1،9) = 2.074، ف <0.05). ومن المرجح أن الزيادة في ردود ألفا خلال جلسة 10 بسبب الكمون بداية قصير من CR متطورة.

ويبين الشكل 7D في المتوسط ​​في المئة استجابة قصيرة الكمون المسجلة من كلا المجموعتين من الفئران. عكست ردود الكمون قصيرة النشاط بين 50-70 مللي ثانية بعد ظهور CS التي كانت 4SD فوق النشاط الأساسي نفسه. وكشفت التدابير المتكررة أنوفا أن الحيوانات مشروطة أظهرت استجابات الكمون أكثر قصيرة من الحيوانات pseudoconditioned خلال عشر جلسات التدريب (مجموعات، F (1،15) = 5.377، ف <0.05؛ الدورة، F (1،9) = 3.920، ع <0.0005، والمجموعات * الدورة، F (1،9) = 3.158، P <0.005). ت له قد تعكس مرة يصيب سابق من السجل التجاري، وكما أظهرت مجموعة مكيفة الردود الجاهزة أكبر مع كل دورة تدريبية.

الشكل 1
الشكل 1: وتتبع Eyeblink تكييف النموذج في تكييف eyeblink أثر، يقترن حافز مشروط حميدة (CS) مع المثير غير الشرطي الضارة أقل ما يقال (US) يعني للحث على الاستجابة eyeblink. يتم فصل CS والولايات المتحدة من خلال وجود فجوة زمنية خالية من التحفيز، مما يجعل من نموذج الحصين التي تعتمد على 23. في نموذج الموصوفة هنا، يقترن 250 مللي ثانية الاهتزاز الطولي طويل CS مع 100 ميللي ثانية صدمة طويلة محيط بالحجاج الولايات المتحدة. يتم فصل CS والولايات المتحدة من خلال وجود فجوة الزمنية 250 ميللي ثانية طويلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العمر = "1"> الشكل 2
الشكل 2: وثابتة رئيس التحضير لذلك، الثابتة وجها لانشاء لتكييف eyeblink مع الاسطوانة، ومشجعا على الخط الطولي، وموصل أشار ومشجعا على الخط الطولي مع اثنين من طبقة الانحناء المحرك ومشط المشار إليها.. موصل مع الأجزاء الفردية أشار: قفل المسمار، الشريط 7 حفرة، الأسلاك ملحوم على مآخذ والايبوكسي للحفاظ على الأسلاك، وأجنحة تحويلها من TO-220 طراز الترانزستور وخوذة مع الفرد. وأشارت أجزاء: الشريط 7 حفرة، ودبابيس، والأسلاك ملحوم إلى دبابيس، بما في ذلك الفولاذ المقاوم للصدأ سلك الأرض غير المصقول، والصدمة الفردية وEMG أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ، مع 0.2 سم من طلاء بوليميد خلع نهاية E. ، والتكوين لكل حفرة في قطاع 7 حفرة لكل من الموصل وخوذة. فأر مع خوذة جراحيا. يتم وضع الماوس على الاسطوانة، وعلى استعداد لتدريبهم. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: مثال EMG تسجيل خطوط زرقاء ترسم العرض CS (250 ميللي ثانية طويلة). خطوط حمراء ترسم العرض الولايات المتحدة، مما يدل على القطع الأثرية التي تأتي من الصدمة الكهربائية (100 مللي ثانية). يتم فصل CS والولايات المتحدة قبل فترة خالية من التحفيز 250 مللي ثانية. ضمن هذا الفاصل الزمني خالية من التحفيز هو النشاط EMG أعلى سعة (نسبة إلى خط الأساس) الذي يحدد مسؤولية الشركات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>

الشكل (4)
الشكل 4: مثال EMG والبصرية التسجيلات انعكاس الأشعة تحت الحمراء المقابلة وتسجيل EMG هو مجرد دقيقة مثل بصري استشعار بالأشعة تحت الحمراء انعكاس في الكشف عن بداية مشروط استجابة (الخط الأزرق)، الكمون إلى ذروة الاستجابة (خط أحمر)، وeyeblink من دون شروط استجابة بداية ( خط الوردي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: بلغ متوسط ​​آثار Eyeblink بلغ متوسط ​​تصحيح وآثار متكاملة للاستجابة eyeblink للماوس واحدة مكيفة (A) والفأرة pseudoconditioned واحد (B). ويمثل كل أثر المتوسطاستجابة الماوس لجميع المحاكمات أكثر من جلسة واحدة. يمثل الجزء الأزرق إلى الاستجابة خلال اهتزاز الطولي عرض CS. يمثل الجزء الأحمر الاستجابة أثناء الفاصل الزمني أثر خالية من التحفيز. في صدمة الولايات المتحدة التي يسببها قطعة أثرية التي هي موجودة خلال المنطقة الرمادية الداكنة بعد الفاصل أثر. ويظهر ب الردود على الاهتزاز الطولي CS فقط. وقد pseudorandomized عرض CS وحده، والولايات المتحدة التجارب وحدها في pseudoconditioning. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
. الشكل 6: المدرج الإحصائي من الاستجابة أوقات الذروة المدرج الإحصائي الوقت إلى الذروة استجابة لجميع مشروطة (ن = 8؛ أشرطة زرقاء) و 8 pseudoconditioned (الحانات الحمراء) الحيوانات لجميع آرأمية في جميع الدورات (تم استبعاد البيانات من الماوس pseudoconditioned واحد للسماح للمقارنة مباشرة لعدد من الردود بين مجموعات). وتشير القضبان الأرجواني حيث تتداخل الحيوانات مكيفة وpseudoconditioned. يتم احتساب أوقات الذروة استجابة كوقت من أكبر ذروة تسجيل EMG تصحيحه ومتكامل بين CS والولايات المتحدة بداية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الشكل 7: منحنيات استجابة الحيوانات مكيفة (ن = 8؛ المنحنيات الزرقاء) والحيوانات pseudoconditioned (ن = 9؛ المنحنيات الحمراء). A، نسبة المتوسطات الردود مكيفة التكيفية (± SEM) للحيوانات مشروطة وpseudoconditioned أكثر من 10 دورات تدريبية باء، منطقة وبلغ متوسط ​​(± SEM) من CR للمشروطوpseudoconditioned الحيوانات أكثر من 10 دورة تدريبية. نسبة المتوسطات ألفا الاستجابة (± SEM) للحيوانات مشروطة وpseudoconditioned أكثر من 10 دورة تدريبية. النسبة المئوية للمتوسط ​​الردود الكمون القصير (± SEM) للهواء وpseudoconditioned أكثر من 10 جلسات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تكييف eyeblink الكلاسيكي هو شكل من أشكال التعلم النقابي الذي هو أداة مفيدة لفهم ركائز العصبية الكامنة وراء التعلم والذاكرة. الطرق السابقة المستخدمة لتكييف eyeblink في القوارض مثل الفئران تشارك غرفة التي سمحت لهذا الحيوان للتحرك بحرية. وإعداد ثابت رئيس لتكييف eyeblink في الفئران، وذلك باستخدام جهاز من Chettih وآخرون. وHeiney وآخرون. والأكثر استخداما في الآونة الأخيرة وصفها في تكييف eyeblink أثر أثار خفيفة في سيجل وآخرون، ويقدم العديد من المزايا، مثل السماح لبعض الإجراءات والتجارب التي يتعين القيام بها خلال تكييف eyeblink التي لم يكن ممكنا أو كان محدودا في الماضي (على سبيل المثال، في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير الكالسيوم) 14-16. هذا النوع من إعداد يسهل أيضا استخدام تقنيات أخرى مثل في الجسم الحي الكهربية مع صفائف صمام رباعي. كما تظهر الفئران لتصبح distressed من ضبط النفس، وقد تم تطوير هذا التحضير ثابتة الرأس للحفاظ على رؤساء آمنة مع تقليل مقدار من ضبط النفس المطلوبة. في حين أن هذا الإعداد يسمح الفئران لambulate في حلقة مفرغة أسطواني، وغيرها أيضا جمع البيانات بنجاح السلوكية من الفئران ثابت رئيس على منصة ثابتة 24.

هناك، ومع ذلك، بعض القضايا التي تنشأ مع استخدام نظام اسطوانة ثابتة الرأس. واحد قلق هو أنه عندما واحد يضع في البداية الماوس غير مدربين على اسطوانة، فقد تحتاج إلى بعض الوقت لتعلم للراحة، والمشي، أو الجري على جهاز الرواية. معظم الفئران تتعلم بسرعة إلى الراحة، والمشي، أو الجري على الاسطوانة بشكل مريح. دورتين التعود تساعد على تعويد الفئران إلى الاسطوانة وبحلول منتصف الدورة الثانية، ومعظم الفئران مريحة على الاسطوانة. قلق آخر الذي يطرح نفسه هو خوذة قوع الإصابة. كان هناك بعض المشاكل مع هذا في الماضي من خلال دورات تدريبية اليوم متعددة، ولكن استخدام لاصقة الملاط جوقد تحسينها ement القضايا مع قلع خوذة. وقد أدى استخدام الاسمنت لاصقة الملاط في 0 avulsions٪ خوذة من أكثر من 50 عملية جراحية منذ باستخدام هذه التقنية. مع الاستخدام الصحيح وانتشار كافية من الاسمنت في الجمجمة، يجب على الباحثين أن تواجه أي مشكلة مع قلع خوذة. وأخيرا، من خلال تقديم خدمات العملاء خلال جلسات التعود، قد يكون هناك بعض القلق حول كبت كامن. ومن الواضح، مع ذلك، أن الفئران كانت مكيفة بنجاح (انظر الشكل 7). لاحظ أن شدة الاهتزاز الطولي يمكن تعديلها عن طريق تغيير كمية الجهد الذي أقره مقاومة متغيرة. إذا الفئران غير قادرة على معرفة، والجهد ويمكن زيادة لدعم تكييف الناجح مع التقليل أيضا ردود إجفالية. يمكن للباحثين أيضا تغيير نوع من الصدمة الكهربائية الولايات المتحدة التي يتم تسليمها للحيوان. الصدمة الكهربائية الولايات المتحدة يمكن أن تكون نبضة كهربية مفردة دائم 100 مللي ثانية كما ذكرت هنا. بدلا من ذلك، كما الالمعزل ه التحفيز المستخدمة في هذا البروتوكول هو قادر على نقل النبضات ثنائي الطور، يمكن للباحثين أيضا توظف 120 هرتز 6 أزواج نبض ثنائي الطور في 1 ميللي ثانية لكل نبضة لصدمة كهربائية فعالة الولايات المتحدة كذلك.

وأشار Boele وآخرون من احتمال أن بعض "الفعل المكيفة" قد تنشأ من جفل (ألفا) الردود على CS أو ردود الكمون قصيرة (SLR) 25. تعتبر ردود ألفا ليكون إغلاق الجفن السريعة داخل الكمون مللي ثانية 50 بعد CS بداية. الفئران في كثير من الأحيان إبقاء عيونهم مغلقة لمدة المحاكمة، وبعد هذا الرد ألفا. إس إل آر إس، من ناحية أخرى، لديها الكمون من 50-70 ميللي ثانية من CS بداية وتنشأ عادة بعد سوى عدد قليل من يعرف حدودا CS-الولايات المتحدة. الكمون قصيرة إلى بداية كل من ألفا وإس إل آر إس، وحقيقة أن إس إل آر إس يمكن أن تنشأ بعد سوى عدد قليل من يعرف حدودا CS-الولايات المتحدة تشير إلى أن من المحتمل ليس مدفوعا من قبل الدوائر-الحصين الدماغي. هذه الملاحظات التي استعرضتها Boele وآخرون. رالتسول herefore مسألة ما إذا كانت تعلم الردود الجاهزة سجلت هنا الردود. كما الشكل 7C و7D المعرض، لا ردود ألفا ولا إس إل آر إس تمثل أغلبية الردود الجاهزة مسجلة، مما يشير إلى أن الردود الجاهزة على التكيف وبوساطة الدماغ الأمامي والمخيخ. رسوم بيانية في الشكل (6) والتي تظهر الكمون إلى ذروة الاستجابة eyeblink التالية CS بداية يشير أيضا إلى أنه في حين قد تشمل بعض التجارب ألفا بداية مبكرة أو استجابة الكمون قصيرة، مع المزيد من التجارب والتدريب، وذروة استجابة eyeblink يحدث فعلا في وقت لاحق و أقرب إلى ظهور الولايات المتحدة، مما يدل على تطوير استجابات مشروطة في توقيت جيد. كما ذكر سابقا، والموهن التحفيز الطولي وشدة الصدمة إلى المستوى الذي لم يكن مذهلة أو مكره أكثر من اللازم، ولكن بقيت فعالة في إنتاج الاستجابات التكيفية مكيفة. أخيرا، وكما يبين الشكل 7B، حجم CR (التي تقاس على أنها منطقة خاضعة للمنحنى في الاستجابة تصحيحه ومتكاملة، كما في الشكل 5) أكبر في المجموعة مكيفة مما كانت عليه في مجموعة pseudoconditioned مرة واحدة وصلت مجموعة مكيفة معيار التعلم من 60٪، مما يدل على أن هذه الاستجابات تتطلب عدة جلسات للتعلم، على عكس إس إل آر إس وألفا الردود.

وأشار Boele آخرون أيضا إلى أن القياسات EMG، في حين أن أسلوب دقيق لبرمشة كشف في الحيوانات الكبيرة مثل الأرانب، ليست كما عملي في القوارض الصغيرة مثل الفئران 25. وأوصوا باستخدام تقنية قياس المسافة المغناطيسية (MDMT) لتجنب الكشف عن الإشارات الإيجابية الكاذبة التي قد تشير EMG تسجيل. تقنية MDMT، في حين مؤثرة في حساسيتها ونوعية الكشف طرفة، ويعرض أيضا الحرمان من الحاجة إلى تخدير الحيوان كل يوم من أيام التدريب من أجل إرفاق رقاقة 26. هذا في حد ذاته قد اربكت معدلات التعلم. نجد أن الإشارات EMGسجلت مع الإجراءات الموضحة هنا يتم الحصول عليها بسهولة من قرار زمنية عالية وموثوق بها وسهلة نسبيا لقياس وتحليل.

ويبين الشكل 4 إشارة EMG تمثيلية كشف يومض مع إشارة المقابلة من جهاز استشعار بصري عاكس الأشعة تحت الحمراء وضعت على مقربة من العين الماوس، أثناء التدريب. هناك ارتباط واضح في برمشة كشف بين إشارة EMG وأجهزة الاستشعار البصرية، تدل على دقة الكشف طرفة باستخدام التسجيلات EMG. ميزة من التسجيلات EMG هو أنه يتيح لأكبر القرار الزماني. وعلى الرغم من تدهور القرار من خلال دمج أكثر من 10 مرة مللي ثانية ثابتة، يمكن للمرء أيضا تحليل البيانات EMG الخام للكشف عن النشاط طرفة عين. عدد سنبلة معلمة واحدة التي يمكن استخدامها للكشف عن الردود الجاهزة 18. عيب واحد مع التسجيلات EMG هو أن الإشارات مما لا شك فيه أن تكون ملوثة القطع الأثرية الكهربائية القادمة من الصدمة الكهربائية الولايات المتحدة (انظر مكيفة، أي تلك التي تحدث قبل ظهور الولايات المتحدة. وثمة عيب آخر في توظيف التسجيلات EMG غير ذلك، باستخدام المعيار الحالي للكشف عن CR، وهو الأساس صاخبة قد يخفي ما قد خلاف ذلك تم الكشف عن مسؤولية الشركات.

إعداد ثابت رئيس الموصوفة هنا هي مماثلة لتلك التي قدمها Heiney وآخرون. 15 هناك، ومع ذلك، بعض الاختلافات الملحوظة من نظامهم أنيقة. على سبيل المثال، وصفت طريقة هنا لتسجيل استجابات eyeblink هي الأسلاك وضعت subdermally فوق العين لتسجيل نشاط EMG. هذا الأسلوب يسمح للتسجيلات موثوقة ومستقرة من النشاط جفن، وبالتالي، الرد eyeblink. تحديد المكان المناسب وتثبيت من هذه الأسلاك يضمن جودة التسجيلات التي تستمر لمدة أسبوعين على الأقل، ومدة التجربة. ميزة استخدام أسلاك EMG بدلا من أعلى مستوىكاميرا -speed كما يستخدمه Heiney آخرون أن التسجيلات EMG لها قرار زمنية عالية للغاية، ولا تتطلب تحديد المواقع اليومي ومعايرة الكاميرا يتطلب 15. الكاميرا لا، ومع ذلك، تقديم تقرير المرئي المباشر من إغلاق الجفن.

وثمة فرق آخر بين النظامين هو طريقة للتسليم CS. هذا المستحضر الماوس معين ثابت رئيس يستخدم التحفيز الطولي كما الحافز مكيفة. وتظهر النتائج أن الفئران يمكن أن تكون مشروطة بشكل فعال مع التحفيز الطولي مثل CS، تماما كما الأرانب الثابتة الرأس يمكن أن تكون مشروطة مع اهتزاز الطولي 27. Heiney وآخرون أظهرت التحفيز لوحة الطولي باعتبارها CS فعال عن طريق توجيه نفخة ضعيفة من الهواء إلى لوحة الطولي 15. على الرغم من أن كلا تقنيات تثبت تكييف فعال، ووضع المشط على شعيرات المختارة وتهتز المشط يسمح القدرة على تحفيز whiske فردالصفوف ص أو حتى شعيرات فردية. وقد استخدمت هذه التقنية في الدراسات السابقة للسماح للحيوانات لتكون بمثابة سيطرتهم (أي تم مقارنة الصف الطولي حفز إلى صف من شعيرات unstimulated) 20.

وباختصار، استعدادا ثابت رئيس لتكييف eyeblink-أشار الطولي يسمح لمنصة الجمجمة المضمونة لأداء التقنيات المتقدمة والتجارب التي كانت سابقا من المستحيل أو من الصعب القيام بها. تم استخدام التحفيز الطولي معتدل كما الحافز مكيفة واستخدام الصدمات الكهربائية الخفيفة كما المثير غير الشرطي. سجلت ردود Eyeblink مع الأسلاك وضعت subdermally خلف الجفن. وقد تجلى التعلم موثوق بها في الفئران مع التحفيز المباشر للشعيرات اختياره خدمات العملاء والصدمة الكهربائية الحجاج مثل الولايات المتحدة، وكان لا تعلم واضحا في الفئران التي أعطيت العروض عشوائية من CS والولايات المتحدة. قدمت التسجيلات EMG الاعتماد عليها ويختلططريقة بسيطة atively لتسجيل استجابات eyeblink ومراقبة كيف تغيرت الردود عبر دورات تدريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع (W81XWH-13-01-0243)، والمعاهد الوطنية للصحة (R37 AG008796). نشكر آلان بيكر في ورشة ميكانيكا جامعة نورث وسترن لبناء جهاز أسطوانات ثابتة الرأس. نشكر الدكتور Shoai هاتوري لقيادته في MATLAB وسوليدووركس. نشكر الدكتور جون الطاقة للبرنامج ابفيف التي تسيطر على التجربة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"  Amazon B002ONUM0E For cylinder
Plexiglas Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7 mm diameter) Custom-made
4-40 machine screw (.25 in. long) Amazon Supply B00F33Q8QO For cylinder
Classic Design Hair Comb Conair 93505WG-320 For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator Piezo Systems T220-A4-303X  For whisker stimulation
Solder and Flux Kit Piezo Systems MSF-003-NI For whisker stimulation
Magnetic Base Thor Labs MB175 For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor Amazon Supply B0002ZPZYO  For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets Electronic Connector Corp. 220-S02 For connector
Relia-Tac Pins Electronic Connector Corp. 220-P02 For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) Amazon Supply B000FN68EE Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) Amazon Supply B000N2TK7Y Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid Loctite 1365896 Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy Ace Hardware 18613 For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) PlasticsOne 005sw/2.0 37365 S-S  For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) AM Systems 792800 For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer Tenma 72-110 For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier A-M Systems 1700 Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator World Precision Instruments 31405 For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein: Animal Health 50031 For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc NDC 12496-0757-1 For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment  Akorn NDC 17478-062-35 Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads PDI NDC 10819-3883-1 For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) Integra Miltex  4-7. For surgery
Stainless steel surgical scalpel blades Integra Miltex 4-310 or 4-315 For surgery; number 10 or 15 scalpel blade
3% Hydrogen Peroxide May be purchased from any standard pharmacy
Micro Clip Roboz RS-5459 For surgery, to hold back skin
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) Amazon Supply B002SG89X4  For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool Walnut Hollow 29637 Hand drill for surgery, to drill holes in skull
Inverted Cone Burr Roboz RS-6282C-34 Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull
Engraving Cutter Drill Bit Dremel 106 Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base Parkell S398 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder Parkell S399 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml Parkell S371 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip Parkell S387 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5 World Precision Instruments 504506 For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators VWR International 10806-005  For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit Dentsply 675570 For surgery; dental cement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280, (5360), 77-81 (1998).
  2. Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93, (24), 13438-13444 (1996).
  3. Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100, (5), 729-744 (1986).
  4. Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104, (2), 243-252 (1990).
  5. Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99, (2), 123-132 (1999).
  6. Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125, (3), 318-326 (2011).
  7. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, (2), 377-388 (1994).
  8. Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102, (4), 586-590 (1988).
  9. Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951, (2), 183-190 (2002).
  10. Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
  11. Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15, (5), 769-775 (2012).
  12. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9, (11), 2515-2538 (2014).
  13. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343, (6173), 857-863 (2014).
  14. Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5, (72), (2011).
  15. Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34, (45), 14845-14853 (2014).
  16. Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. (2015).
  17. Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177, (2), 434-439 (2009).
  18. Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. (2014).
  19. Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11, (3), 425-433 (2002).
  20. Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26, (22), 6062-6068 (2006).
  21. Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14, (1), 94-100 (2007).
  22. Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70, (2), 171-180 (2000).
  23. Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14, (1), 58-65 (2004).
  24. Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35, (9), 3772-3781 (2015).
  25. Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3, (19), (2010).
  26. Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88, (4), 2124-2133 (2002).
  27. Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108, (5), 1278-1287 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics