실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. J. Vis. Exp. (105), e53314, doi:10.3791/53314 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

효율적인 면역 반응은 감염이나 부상의 사이트에 혈액 백혈구의 신속한 동원에 의존한다. 생체 내에서 백혈구의 이동을 조사하는 혈관 내피 세포와 백혈구의 transendothelial 마이그레이션 및 상호 작용의 분자 기초를 이해하는 데 매우 중요합니다. 하나의 강력한 접근 방식은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다.

여기에서 우리는 거꾸로 공 초점 현미경 오렌지 염료 표지 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스 IV에 영상 단핵구와 호중구을위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 영화는 모두 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 혈관에서 백혈구 행동의 분석을 허용 영상의 몇 시간이 30 분에서 모였다. 로컬 TLR2 / TLR1 효능 Pam3SK4과 혈관 염증을 유발하고 subseque을 모니터에 우리는 또한 단계를 설명호중구와 단핵구의 NT 모집.

제시된 기법은 또한 백혈구의 다른 개체군을 모니터링하고 다른 자극 또는 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 백혈구 보충 또는 거래에 관련 분자를 조사하는데 사용될 수있다.

Introduction

호중구와 단핵구는 지속적으로 혈액 순환 선천성 면역 체계의 세포이다. 부상이나 감염되면 염증 신호는 여기에 세포 면역 반응 1-3 시작, 손상 및 감염 조직으로 백혈구 diapedesis를 유도한다. 백혈구 동원의 신속성은 면역 반응의 긍정적 인 결과를 결정한다. 이러한 복잡한 프로세스는 백혈구에 연루 분자에 대한 통찰력을 얻을 .TO 순환 백혈구와 내피 1-3 사이의 접착제 접촉의 설립을 도와 염증이 내피 세포에 존재하는 특정 분자 (예를 들어, 셀렉틴, 내피 세포 결합 된 케모카인)에 의존 모집 캐스케이드, 그것은 세포의 모집 동력학을 시각화하고, 각 셀 / 인구의 동작을 추적하는 것이 중요하다. 효과적인 방법은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다.

현재까지 콘텐츠 ">, 생체 내에 현미경을 사용하여 여러 가지 방식은 화상에 개발 된 맥관 4,5-. 예를 들어, 귀 진피 혈관 또는 생체 내에 공 촛점 현미경으로 장간막 정맥 촬상 뮤린 Ly6C 낮은 단핵구 및 인간의 순찰 동작을 식별하는 데 사용 하였다 CD14는 정상 상태 조건 6-8 하에서 혈관의 내강 측에 CD16 + 단핵구 희미. 마우스 cremaster의 혈관 모델은 종종 트랜스 제닉 마우스에서의 염증 또는 허혈 조건 호중구 염증 Ly6C 높은 단구의 동작을 모니터링하기 위해 사용된다. 것을 경우, cremaster이 IL1β, CCL2, TNFβ 또는 fMLP의 intrascrotal 주입을 통해 자극한다. 2-4 시간 후, 조직은 수술 표면화되고, 생체 내에 공 초점 현미경 9-11으로 분석 하였다.

다음은 프로토콜과 동시에 단핵구 및 호중구를 모니터링하는 방법을 설명거꾸로 형광 공 초점 현미경. 또한, 우리의 방법은 백혈구 모집의 역학을 수행하는 방법에 대해 이전 이미지 같은 용기 (정상 상태)과 염증 후에 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 목적을 위해, 우리는 누구의 단핵구 eGFP는 표현, IV 오렌지 염료 표지 쥐의 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스를 사용합니다. 반전 된 공 초점 현미경을 사용하여, (1) 추적하고 정상 상태 조건 및 (2) 로컬 염증 후 동일한 용기에서 두 단핵구 및 호중구의 채용을 따르지하에 순찰 Ly6C 낮은 단핵구를 분석 할 수있다. 여기에서 우리는 TLR2 / TLR1 효능 Pam3CSK4 (12)를 사용하여 염증 상태를 만듭니다. 또한, 이러한 영상은 특정 녹아웃 마우스 또는 차단 항체 6,9,13의 존재 하에서 수행하는 경우 백혈구 모집 캐스케이드의 다양한 단계에 대한 관심의 특정 분자의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

참고 : 동물 절차는 스위스 제네바에서 동물 관리의 기관 윤리위원회와 분할 한 수의학 사무소에 따라 수행되었다. 인증 번호 GE / 14분의 63.

골수에서 단일 세포 현탁액 1. 준비

  1. 자궁 전위에 의해 희생 마우스 (구 8-12주). 70 % 에탄올로 뒷다리를 소독. 뒷다리에서 피부를 제거합니다.
  2. 마우스 대퇴골과 경골을 해부하고 메스와 다리에서 조직을 제거합니다. PBS로 가득 배양 접시에 90 %의 에탄올과 장소 다리를 씻어.
  3. 무릎 관절에 메스 분리와 대퇴골과 경골의 문화 후드, 깨끗한 조직에서. 뼈의 양쪽 끝을 잘라.
  4. 50 ㎖에 23G 바늘과 준비 매체 (페놀 레드가없는 DMEM / F12, 1 %의 쥐 혈청)로 채워진 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 뼈에서 플러시 골수 튜브 나사. 섬세 23G 북동 통해 계대에 의해 세포 집합체를 중단edle과 1 ML의 주사기. 준비 배지 25 ml의 총 부피를 가져와.
  5. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. 폐기 뜨는. 1 용액에 재현 탁 펠릿은 적혈구 용해 RBLC 버퍼 15 ㎖의 튜브 나사 (8.3 g NH 4 CL, 증류수 1 L에 완전한 1g의 수 NaHCO3, 1 ml의 EDTA (100 밀리미터), 0.22 μm의 필터링). 얼음에 30 초를 품어.
  6. 준비 매체와 원심 분리기 250 XG 10 ㎖, 5 분, 4 ° C를 추가합니다. 2 ml의 준비 매체에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오.

음의 선택 2. 호중구 심화

  1. 마우스 호중구 농축 칵테일 (전지 분리 플랫폼 키트 등 EasySep 등)의 150 μl를 추가합니다. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
  2. 페놀 레드없는 DMEM의 10 ML을 추가합니다. 한 번 반전 및 원심 분리기 250 XG, 3 분, 4 ℃.
  3. 폐기 뜨는. 바닥 튜브 라운드 5 ml의 폴리스티렌 1.75 ml의 준비 매체에 재현 탁 펠렛. 250 μL 비오 추가선택 칵테일. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
  4. 입자를 재현 탁 30 초 동안 (전지 분리 플랫폼 키트) 자성 입자를 소용돌이. 세포 현탁액 500 μL 자성 입자를 추가합니다. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
  5. 자석에 튜브를 놓습니다. 3 분을 기다립니다.
  6. 원하는 레이블이없는 세포를 수집하기 위해 바닥 튜브 라운드 새로운 5 ml의 폴리스티렌에 자석 전환. 튜브에 매달려 마지막 한 방울을하지 마십시오. 원하지 않는 세포는 자석 내부의 튜브에 남아있게됩니다. 생물 학적 폐기물로이 튜브를 폐기하십시오.
  7. 자석에 새 튜브를 놓습니다. 3 분을 기다립니다.
  8. 새로운 15 ml를 원하는 표지 된 세포를 수집하기 위해 관 나사에 자석을 전환. 튜브에 매달려 마지막 한 방울을하지 마십시오.
  9. 페놀 레드없는 DMEM 5 ml의 완전한 볼륨.

호중구 3. 라벨링

  1. 휴대 추적기 오렌지으로 오렌지 염료의 0.5 μl를 추가 (작업 농도1 μM, CMRA - 클로로 메틸 rodol 아세테이트, 주식 DMSO 10 mm)이다. 37 ℃에서 2 분을 품어.
  2. 준비 매체의 2.​​5 ML을 추가합니다. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃.
  3. 폐기 뜨는. 1.5 ML 튜브에 1 ㎖의 준비 매체에 재현 탁 펠렛.
  4. hematocytometer를 함께 계산하는 나누어지는 가져 가라.
  5. 37 ℃에서 5 분을 품어. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃.
  6. 폐기 뜨는. 1 ml의 PBS에 재현 탁 펠렛. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 세척 4 ° C.
  7. 폐기 뜨는. 100 μL PBS 당 10 × 10 6 세포 등을 Resuspend 펠렛. IV 주입까지 얼음에 보관하십시오. 참고 : 세포가 IV는 가능한 한 빨리 주입해야한다. 6-12x10 6 호중구 / 마우스는 일반적으로 얻을 수있다.

생체 내에 현미경 4. 마우스 준비

주 :.. 단계 4.1) 및 4.2)에 IC 표지 호중구 오랜 대기 시간을 방지하기 위해 실험의 시작에서 수행되어야이자형.

  1. CX 3 (CR1)의 GFP 마우스 (구 8~12주)를 달아.
  2. (PBS에 1.75 ㎎ / ㎏ acepromazone 케타민 60 ㎎ / ㎏, 자일 라진 4.5 ㎎ / ㎏) 마취제의 800 μl를 준비합니다.
  3. 마우스를 마취. 마우스의 200 μL / 20g와 사출 IP. 곤란 발가락으로하고 호흡을 확인하여 제어 마취.
  4. 호중구 (100 μL PBS에 10 × 10 6 세포) 정맥 실험자의 편의에, 측면 꼬리 정맥 또는 역 궤도 동을 사용하여 주입한다.
  5. 가열 패드에 마우스를 놓고 눈 젤 눈을 보호 할 수 있습니다.
  6. 유리 커버 슬립 (35mm 직경)는 직경 30mm의 구멍을 갖는 10cm 조직 배양 접시에 넣고있다. 사용 된 오일과 접촉하는 커버 슬립 조직 배양 접시를 유지하는 것이다.
  7. 복막을 노출 가위로 복부 피부를 절개. 소장을 노출 가위로 복막을 절개.
  8. 200 ㎕의 PBS로는 P (37 ℃에서 예비 가열)를 추가eritoneal 공동. 당신의 손에 마우스를 가지고 소장은 부드러운 압력으로 복강에서 얻을 수 있도록이 아래를 향십시오. 조직 배양 접시에 마우스를 놓습니다.
  9. 조심스럽게 장간막 혈관을 노출하기 위해 커버 슬립에 멸균 면봉으로 장을 deroll.
  10. 대역에서 종이 조직을 잘라 37 ℃ 가열 PBS로 그들을 젖은. 연동 운동에 의한 운동을 감소 종이 조직의 조각을 고정 부위.
  11. 거꾸로 현미경의 맞춤형 트레이 무대에 37 ° C 온도 조절 챔버 내부의 조직 배양 접시와 마우스를 넣습니다. 뒷다리에 마취제 사우스 캐롤라이나를 포함하는 주사기를 소개합니다. 참고 : 또한, 마우스 마스크와 산소 (0.5 L / 분)를받을 수 있습니다.
  12. 발가락이 곤란 및 호흡마다 30 분을 확인하여 마취에 대한 제어 마우스. 필요한 경우, 적절하게 마취를 유지하기 위해 마취의 향상 (20 μl를) 제공합니다. 아니E : 혈관의 건조는 피해야한다. 따라서, 그 습도 정기적 37 ° C-PBS로 가온 부위를 고정하기 위해 사용 된 종이 조직 습윤에 의해 유지된다.

생체 내에 현미경을 사용하여 생체 내에서 염증 선박 5. 측정 호중구와 단핵구 행동

  1. 설정 레이저는 488- 레이저에 의한 광독성을 방지하기 위해 필요한 최저 전력에서 561-합니다. 실험에서는, 0.5 % 미만이다. 호중구에서 단핵 세포에서 GFP와 오렌지 염료의 강도는 일반적으로 0.3 %가 충분 너무 밝습니다. 참고 :이 우리의 체제와 0.15 mW의 0.25의 레이저 출력을 나타냅니다.
  2. 거꾸로 현미경의 20X 건조 목표를 사용하여 오픈 핀홀 2.2 초에 512 X 512 픽셀 (즉, 635 μm의)의 이미지를 획득. 낮은 레이저 파워와 충분한 신호를 보장 20 μm의 10 ~ Z-깊이를 사용합니다.
    참고 : 우리는 보통 12 ~ 16 사이의 Z-깊이 실험을 수행(56); M. 제시된 도면 및 동영상의 경우, Z-20 μm의 깊이이다. 위상차 내피 벽의 식별이 가능하고 촬상은 장간막 정맥상에서 수행된다. 순찰 세포가 관심 분야를 기록, 5-10 μm의 / 분 (6)의 속도가 매우 느리게 이동 이후 매 20 초 만족 스럽다. 설명 된 설정으로, 전동 스테이지 동시에 관심 최대 7 필드의 기록을 허용한다.
  3. 이를 첫 번째 동영상의 획득 전에 30 분 동안 제제로부터 복구 할 수있는 마우스 및 현미경의 서모 스탯 실 장간막 혈관을 놓는다. 이 기간 동안 관심의 여러 필드를 선택합니다. 목적에 가장 가까운 혈관의 내강 표면에 초점을 맞 춥니 다. 필요한 경우, 포커스를 설정할 내피 약간 자동 형광 활용.
    참고 : 마우스를 준비하는 동안 수술은 약간 내피을 강조하고있다. 결과적으로 호중구의 압연/ 또는 단핵 세포는 처음 15 분 다음 마우스 제제에서 관찰 될 수있다.
  4. 정상 상태의 조건에서 30 분, 하나의 이미지 매 20 초 동안 첫 번째 영화를 기록합니다.
    참고 :이 소프트웨어는 2.2 초에 대한 관심의 각 필드를 취득하고, 모터 단계는 자동으로 다른 하나의 필드에서 이동합니다. 그것은 영화의 기록을 30 분 동안 다시 20 초 이내에 제 1 위치로 간다.
  5. 혈관 염증을 개시, TLR2 100㎍을 함유 PBS 20 μL의 방울을 추가 / TLR1 작용제 Pam3CSK4 12 직접 묘화 혈관 상.
  6. 관심의 각 필드에 대해 초점을 제어 할 수 있습니다.
    참고 : 인수하는 과정에서 항상 존재 z 축에 초점이 약간 변경됩니다. 10 ~ 20 μm의 z의 깊이에도 불구하고,이 형광 강도의 감소가 발생할 수 있습니다. 필요에 따라서, 수동으로 각 영화의 끝에서 관심있는 각각의 필드를 집중할. 30 분 - 기간과 3 시간까지 기록 영화탈 염증의 개시 후.
  7. 실험의 마지막에, 경부 탈구에 의해 마취 된 마우스를 희생.

동영상 파일과 백혈구의 추적의 6 세대

참고 : 니콘 수집 소프트웨어는 파일을 .nd2 발생하지만 다음 절차는 다른 소프트웨어 및 브랜드와 유사하다.

  1. 티파니 시리즈로 내보내기 파일.
  2. ImageJ에 소프트웨어 (이동 http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). TIFF 시리즈를 가져옵니다. 다른 파일로 각 채널.
  3. 배경 잡음을 줄일 수있는 녹색과 적색 채널 (공정> 필터> 중간 ...) 2.0 픽셀의 반경과 중간 필터를 적용합니다.
  4. (이진 만들기> 프로세스> 이진) 바이너리로 파일을 변환 할 수 있습니다. 각각의 이미지에 대한 임계치를 계산하는 소프트웨어를 사용.
  5. 하나의 이미지 시리즈 (이미지> 색상> ... 채널 병합)에 채널을 병합합니다. 초에서 단핵구를 선택N 채널, 적색 채널 및 채널에 회색 투과광에서 호중구.
  6. RGB 색상에 쌓인 이미지 변환 (이미지> 색상> RGB로 스택).
  7. .AVI와 같은 파일을 저장
  8. 데이터를 가져 와서 Imaris 소프트웨어 (비트 평면)에서 컴파일됩니다. 단핵구와 호중구의 운동은 스팟 추적 마법사를 사용하여 추적됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

원고를 쉽게 실시간으로 마취 된 마우스의 장간막 정맥 단구와 호중구의 동작을 모니터링하기위한 최적화 된 프로토콜을 설명한다. 37 ° C-온도 조절 챔버의 사용은, 마우스의 온도를 유지하기 위해 필수적으로 인해 또한 백혈구의 온도 의존 움직임이다. 마우스의 제조는도 1에 표시되는도 2는 현미경으로 보이는 모든 영역을 나타낸다. 전송 된 빛은 장간막 정맥 (빨간색 화살표) 및 동맥 (파란색 화살표)의 식별을 할 수 있습니다.

같은 영화 1, 영화 2와 ImageJ에 소프트웨어 생성 된 동영상 파일과 획득 된 영상의 치료. 3 표시에게 영화의 처음 지점에 대한 이미지 처리의 여러 단계를 그림 1. 영화 1은 정상 상태 조건에서 Ly6C 낮은 단핵구의 순찰을 보여줍니다 이전에 해제로모든 호중구가 혈액에서 순환되는 반면 6,8,14를 스크라이브. 어떤 호중구는 내피 벽을 순찰하지 않습니다. 영화 2 로컬 염증을 시작 TLR2 / TLR1 효능 Pam3CSK4의 추가 후 관심 90 분의 동일한 필드를 보여줍니다. 이 경우, 호중구와 단핵구가 다량으로 그들이 꼼꼼하게 검사 내피 벽에 채용된다. 그것은 TLR 작용제의 첨가는 내피 폭의 변화를 유도하고 결과적으로 z 축을의 초점을 변경하는 것이 중요하다. 따라서, 포커스 신중 작용제 첨가 후 제어되어야한다. Imaris 소프트웨어 (비트 플레인)에있는 데이터의 편집은 스팟 추적 마법사를 사용하여 개별 백혈구의 추적을 할 수 있습니다. 그림 4는 내피를 따라 순찰 단핵 세포 (녹색) 및 호중구 (적색)의 정확한 트랙 경로를 보여줍니다. 데이터 즉, INF 90 분의 개시 후, 무비의 2 분석에서 얻은lammation. 백혈구 경로의 추적은 트랙 길이, 변위, 시간 또는 속도와 같은 다양한 통계를 얻을 수 TIFF 파일이나 XLS 파일로 내보낼 수 있습니다.

이 기법은 이전과 염증 후 동시에 단구와 호중구의 동작을 모니터링하는 좋은 방법을 제공한다. 그것은 내피 벽 초과 근무에 이러한 세포의 채용을 추적 할 수 있습니다. Z 축 또는 X / Y 변위 초점의 손실을 파괴 실험 장 운동의 결과로서 발생할 수있다. (3)는 영화와 같은 제제 및 획득 실패를 나타낸다.

그림 1
1. 마우스 준비 그림.
검은 색 화살표는 소장을 고정하는 데 사용 PBS​​-젖은 조직을 나타냅니다. 흰색 화살표는 10cm 조직 배양 접시를 나타냅니다. T는 현미경에 맞는 알루미늄 맞춤형 트레이 단계를 나타냅니다. 장간막 혈관이 잘 커버 슬립에 중심에 노출되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
장간막 정맥과 동맥의 2 가지 그림.
10X 목표로 촬영 한 이미지는 (20 × 10) 가능한 영역의 하나의 큰 이미지를 구성하는 스티치했다. 관심있는 여러 분야이어서 20X 목적으로 백혈구 이동을 모니터링하기 위해 선택된다. 빨간색 화살표는 장간막 정맥을 나타냅니다. 파란색 화살표는 장간막 동맥을 나타냅니다. 녹색 화살표는 혈관을 둘러싸고있는 지방 조직을 나타냅니다. 습윤 티슈의 면전에서 화상 결과의 양쪽에 어두운 영역 부위를 고정하기 위해 사용. 흰색 눈금 막대는 1mm를 나타냅니다.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
ImageJ에 3. 이미지 처리를 그림.
화상 처리의 다른 단계들은 개별적으로 처리되는 영화 1 그린 (단핵구)과 빨강 (호중구) 채널의 첫번째 이미지에 도시되어있다. 원래의 원시 데이터 (A)로, 중앙값 필터 (B)인가하고 이진 영상 (C)로 전환. (D) 채널은 최종 이미지로 병합됩니다. 원시 데이터에서 관찰 녹색 또는 빨간색 선은 현미경이 전적으로을 취득 할 수없는 것을 너무 빨리 이동하는 세포이다. 화이트 스케일 바는 40 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 개인백혈구 트랙.
단핵 세포 (A)와 내피를 순찰 호중구 (B)의 트랙 Imaris 소프트웨어 (비트 평면)로 처리됩니다. 화이트 스케일 바는 40 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1
영화 정상 상태에서 내피 벽을 스캔 1. 백혈구. 정상 상태에서, Ly6C 낮은 단핵 세포는 내피를 순찰. 호중구가 혈액 흐름에 따라 순환된다. 호중구는 빨간색에있는 단핵 세포는 녹색에 있습니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 20X의 목적으로 생성됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

GE = "항상"> 영화 2
2 :. 백혈구가 TLR2 매개 염증 후 내피 벽을 스캔 관심의 동일한 필드를 영화 1에서와 같이이 영화는 90 분 직접 용기 위에 Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 작용제)의 100 μg의를 포함하는 PBS의 20 μL를 첨가 한 후 시작합니다. 모집 단핵구와 호중구 꼼꼼하게 내피 벽을 스캔. 호중구는 빨간색에있는 단핵 세포는 녹색에 있습니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 3
영화 3 : 잘못된 마우스 준비에서 얻은 결과 마취 또는 소장의 고정이 잘못된 경우 얻을 선박의 움직임.. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi"대상 = "_ 빈">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 논문에서 설명하는 방법을 효율적으로 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 정맥에서 단핵구와 호중구의 행동을 연구하는 일관성있는 접근 방식을 제공한다.

준비의 중요한 단계는 PBS-젖은 조직과 소장의 고정입니다. 제대로 수행 한 경우, 장간막 혈관 멋지게 이미지 수집에 대한 커버 슬립에 노출되어있다. 이는 장간막 혈관에서 백혈구의 동작을 모니터링하는 관심 여러 필드의 선택을 가능하게한다.

우리의 프로토콜은 (1) 직접 모니터링 혈관에 염증을 유도하고, (2) 자극 이후에 이른 시점을 기록하고, (3)의 반응 속도를 따를 수 있도록, 실험 시작 전 장간막 혈관 exteriorization 포함 백혈구의 모집과 전 염증의 유도 후 동일 선박에 자신의 행동.

우리는 TRANSF더 많은 셀 (0.5-2x10 6 / 6 마우스 대 6-12x10) 마리당 얻어 질 수 ER 호중구 같은 유전 배경 뮤린 골수로부터 정제하지 혈액. 혈액 호중구의 사용이 바람직한 경우, 동일한 프로토콜은 세포의 정제에 대해 수행 될 수있다.

생체 내에 이미징, 혈관의 시각화 장간막 혈관의 경우의 투과광에 의해 활성화된다. 대안 적으로, PECAM1 대 형광 항체 (클론 390) 또는 형광 고 분자량의 덱스 트란 (70kDa 또는 2 MDA) 6,14은 혈관을 검출 IV 주입 될 수있다. 예를 들어, 3 μg의 안티 PECAM1 (클론 390)의 인트라 음낭 주사 낮은 배경 혈관 검출을 가능하게하고 cremaster 모델 9 백혈구 활성에 영향을 미치지 않도록보고되었다. 투과광에 비해 항체 또는 형광 염료의 사용은 특히 vascu의 3D 재구성 가능성을 소개lature하지만 채널은 그 라벨에 희생되고 획득 시간이 증가된다. 여기에 설명 된 바와 같이 전송 된 빛은 혈관의 투명성에 mesenter 모델 덕분에 충분하다. 반면에, 혈관의 형광 표식은 귀 진피 또는 불투명 기관에 필수적이다.

백혈구 인구의 검출은 특정 세포 유형에 내생 형광을 나타내는 형질 전환 동물 (; 단핵구와 호중구리스 eGFP는 9, 혈소판 CD41 YFP (17) 단핵구 CX 3 (CR1) eGFP는 / 중량 6 cd115 CFP 15 cd68의 GFP 16)를 사용하여 달성 될 수있다 . CX3CR1가, CX (3) 모든 단핵 세포 및 NK와 T 세포의 일부 부분 집합에 CR1 eGFP는 / 중량 마우스를 표현하고 있지만 염증 Ly6C <구별하는 것이 재미있다SUP> 주민 Ly6C 낮은 단핵구 6 이하 GFP의 형광을 나타내는 높은 단구. CD115는 단핵 라인의 특정이므로, MacBlue 마우스 cd115 CFP 흥미로운 모델입니다. 그러나 그것은 Ly6C 높고 낮은 Ly6C 단핵구를 구별하는 것은 불가능하다.

트랜스 제닉 마우스에 형광 대안 실시간 백혈구 집단에 레이블 형광 항체의 정맥 내 주사한다. 예를 들어, 단핵 세포는 항 CD115 (복제 AFS98), 안티 CD49b (복제 HMα2)와 안티 Ly6G (클론 1A8)와 호중구 및 혈소판으로 표시 할 수 있습니다. 일반적으로, 모든 이들 항체는 고농도에서 파괴된다. 따라서, 그들은 시간의 짧은 기간 동안 낮은 수준에서주의를 요합니다. 심지어는 낮은 투여 량으로, 세포 기능에 영향을 배제 할 수 없다는 것을 주목해야한다. 소량 (1-2 μg의)와 개인 경험은 CD115 +의 월의 표시를 할 수 있습니다고갈없이 ocytes 및 Ly6G +의 호중구 (데이터는 공개하지 않음).

귀 온전히 그대로 이어 진피 혈관의 모델은 비 침습적이지만, 귀 진피의 깊이를 만드는, 관심은 2- 광자 현미경 (13)에 더 적합한 모델. 또한, 물리적으로 직접 제조를 방해하지 않고 귀 모델에서 혈관을 자극하는 것은 불가능하다.

우리 프로토콜은 어떠한 반전 공 촛점 현미경으로 적용될 수있다. 스캔 속도와 레이저 전원이 기계에 의존, 때문에 하나의 Z 평면에서 하나의 프레임 (512 X 512 픽셀, 즉, 635 μm의)의 인수는 니콘 A1R의 갈바 노 스캐너에 대한 우리의 설정을 약 2.2 초를 필요로한다. 불행히도, 이러한 속도는 낮은 품질의 손실없이 장간막 정맥 네 차원 동영상을 녹화 할 수있는 가능성을 제한한다. A1R의 공진 스캐너는 있지만, 높은 취득 속도를 제공이미지의 품질이 강하게 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스로 우리의 실험 (특정 신호 대 배경) 감소한다. 그것은 레이저가 광독성 및 표백을 방지하기 위해보다 낮은 0.5 % (<0.25 MW)로 설정되어 명심해야한다.

Woodfin 등은 라이카 TCS-SP5 (9)를 사용하여 cremaster의 정맥의 (40 초 60 Z 스택 이미지) 4D 영화 관람을 획득 할 수 있었다. 직경이 20 ~ 40 μm의의 저자 이미지 값으로, 그들은 아마도 우리의 모델 (200 ~ 400 μm의의 장간막 정맥의 모니터링)보다 초점의 변화에​​ 덜 민감하다. 살아있는 조직을 이미징하는 경우, 초점의 제어는 몇 시간 지속 독특한 동영상을 기록 할 수있는 가능성을 제한하는 가장 중요한 문제이다. 우리는 30 분 (45 분) 지속 동영상을 녹화하는 장간막 모델에서 가장 실용적인 것을 고려합니다.

TLR 작용제의 첨가는 선박 폭 따라서 포커스를 변경한다. 따라서,혈관을 안정화 할 때까지 자극 후에 적절히 영상 제 10-15 분간하는 것은 매우 어렵다.

또 다른 한계는 실험 기간이다. 장기간에 걸쳐 적절하게 마취 마우스를 유지하기 곤란하기 때문에, 염증 후 4 시간 이상 이미지 어렵다. (우리가 테스트하지 않지만) 등의 연속 이소 플루 란 흡입과 같은 다른 마취제의 사용은 옵션이 될 수 있습니다.

늙은 쥐 (생후 16 주 이상), 혈관 주위에 지방 예금의 증가 금액은 장간막 혈관의 시각화의 품질을 낮 춥니 다. 따라서, 8-12 주 된 쥐 실험을 실행하는 것이 좋습니다.

이 기술은 관심있는 분자를 차단 또는 백혈구 보충 또는 동작에 관련 분자의 중요도를 판별 할 수 있도록, 특정 백혈구 집단을 고갈 항체의 정맥 내 주입과 결합 될 수있다. 또한,다른 백혈구의 부분 집합은 관심의 세포 집단에 형광 단백질을 발현하는 다른 유전자 변형 마우스 균주를 사용하여 추적 할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes  Beckton Dickinson 352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm  Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm  Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye Life Technologies C34551
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit Stem Cell Technologies 19762
EDTA Sigma Aldrich E6758
FCS PAA A15-042
Immersion Oil Type A Nikon any viscous oil 
Life Box Temperature Control System Life Imaging
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NH4Cl Sigma Aldrich A9434
Nikon A1R confocal microscope Nikon A1R inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS Life Technologies D8537
phenol red free DMEM/F12 Life Technologies 21041-025 any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4 Invivogen tlrl-pms reconstitute in PBS
Rat serum Stem Cell Technologies included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100 TPP 93100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics