Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Immunology and Infection

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Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. J. Vis. Exp. (105), e53314, doi:10.3791/53314 (2015).

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Abstract

Réponse immunitaire efficace dépend de mobilisation rapide des leucocytes du sang vers le site de l'infection ou de blessure. Enquêter la migration des leucocytes in vivo est cruciale pour la compréhension de la base moléculaire de la migration des leucocytes transendotheliale et l'interaction avec l'endothélium vasculaire. Une approche puissante implique microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.

Ici, nous présentons un protocole pour les monocytes et les neutrophiles d'imagerie dans la gfp CR1 / poids iv de la souris injectée avec CX 3 oranges neutrophiles marqués par un colorant avec un microscope confocal inversé. Films time-lapse recueillies auprès de 30 minutes à plusieurs heures d'imagerie permettre à l'analyse du comportement des leucocytes dans les veines mésentériques sous les deux conditions stables et inflammatoires. Nous décrivons également les étapes pour induire localement inflammation des vaisseaux sanguins avec TLR2 / TLR1 agoniste Pam3SK4 et surveiller la subsequent recrutement des neutrophiles et des monocytes.

La technique présentée peut également être utilisé pour contrôler d'autres populations de leucocytes et étudier molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou la traite à l'aide d'autres stimuli ou des souris transgéniques.

Introduction

Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d'infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire 3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur ​​des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l'endothélium lié) présents sur l'endothélium enflammé qui aident à l'établissement de contacts entre les adhésifs leucocytes circulants et l'endothélium 1-3 .Pour obtenir un aperçu sur les molécules impliquées dans le leucocyte recrutement cascade, il est important de visualiser la cinétique de recrutement de cellules et de suivre le comportement de chaque cellule / population. Une méthode efficace consiste à microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.

contenu "> À ce jour, plusieurs approches en utilisant la microscopie intravitale ont été développés à l'image du système vasculaire 4,5. Par exemple, l'imagerie du derme de l'oreille vasculaire ou des veines mésentériques par microscopie confocale intravitale a été utilisé pour identifier le comportement de patrouille de Ly6C murin faibles monocytes et humaine CD14 dim CD16 + monocytes sur la face luminale de vaisseaux sanguins dans des conditions d'état d'équilibre de 6-8. Le modèle de système vasculaire crémaster de la souris est souvent utilisé pour surveiller le comportement des neutrophiles ou Ly6C inflammatoire élevés monocytes dans des conditions inflammatoires ou ischémiques chez les souris transgéniques. Dans ce cas, crémaster est stimulée par injection de intrascrotale IL1β, CCL2, TNFß ou fMLP. Après 2-4 heures, les tissus sont ensuite chirurgicalement extériorisés et analysés par microscopie confocale intravitale 9-11.

Le protocole suivant décrit un procédé pour surveiller les monocytes et neutrophiles dans le même temps à toutefluorescence inversé de microscope confocal. En outre, notre méthode en détail comment l'image du même navire avant (d'état d'équilibre) et après l'inflammation et comment suivre la cinétique de recrutement des leucocytes. A cet effet, nous utilisons le CX 3 CR1 souris GFP / poids, dont les monocytes expriment eGFP, iv injecté avec une orange neutrophiles murins marqués par un colorant. En utilisant un microscope confocal inversé, il est possible (1) pour suivre et analyser les patrouilles Ly6C faibles monocytes dans des conditions stables et (2) de suivre le recrutement de deux monocytes et neutrophiles dans le même navire après une inflammation locale. Ici, nous créons les conditions inflammatoires en utilisant l'agoniste TLR2 / TLR1 PAM3CSK4 12. En outre, comme l'imagerie peut aider à déterminer le rôle de molécules spécifiques d'intérêt dans les différentes étapes de la cascade de recrutement des leucocytes si elle est effectuée sur des souris knock-out spécifiques ou en présence d'anticorps bloquants 6,9,13.

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Protocol

Nota: Les procédures animaux ont été effectuées en conformité avec le comité d'éthique institutionnel de protection des animaux à Genève, la Suisse et l'Office vétérinaire cantonal. Numéro d'autorisation GE / 63/14.

1. Préparation d'une seule cellule Suspension de la moelle osseuse

  1. Sacrifice des souris (8 à 12 semaines de old) par dislocation cervicale. Stériliser pattes de derrière avec 70% d'éthanol. Enlever la peau des pattes postérieures.
  2. Disséquer les fémurs de souris et les tibias et enlever les tissus des jambes avec un scalpel. Rincer les jambes avec 90% d'éthanol et le placer dans une boîte de culture rempli de PBS.
  3. Sous le capot de la culture, le tissu propre à partir de fémurs et tibias avec un scalpel et séparé à l'articulation du genou. Couper chaque extrémité de l'os.
  4. Rincer la moelle osseuse de l'os à l'aide d'une aiguille de 23G et une seringue de 1 ml avec du milieu rempli de préparation (rouge de phénol libre de DMEM / F12, le sérum de rat à 1%), en une vis 50 ml tube. Perturber agrégats de cellules par passage à travers la délicatesse ne 23Gedle et une seringue de 1 ml. Amener le volume total à 25 ml avec du milieu de préparation.
  5. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de globules rouges tampon de lyse RBLC (8,3 g NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml d'EDTA (100 mM), complète à 1 L avec de l'eau distillée, filtre de 0,22 um) dans un 15 ml vis tube. Incuber 30 secondes sur la glace.
  6. Ajouter 10 ml de milieu de préparation et centrifuger à 250 x g, 5 min, 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu de préparation.

2. neutrophiles enrichissement par sélection négative

  1. Ajouter 150 pi de souris enrichissement de neutrophiles cocktail (isolement des cellules de kit de plate-forme tels que EasySep). Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  2. Ajouter 10 ml de phénol DMEM sans rouge. Inversez fois centrifugeuse 250 xg, 3 min, 4 ° C.
  3. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1,75 ml de milieu de préparation dans 5 ml polystyrène tubes ronds de fond. Ajouter 250 ul BiotSélection en cocktail. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  4. Vortex les particules magnétiques (du kit de plate-forme d'isolement cellulaire) pendant 30 secondes pour remettre en suspension des particules. Ajouter 500 pi de particules magnétiques à la suspension cellulaire. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  5. Placer le tube dans l'aimant. Attendre 3 min.
  6. Inversez l'aimant sur un nouveau 5 ml polystyrène tubes ronds en bas pour recueillir les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube. Les cellules non désirées restent dans le tube à l'intérieur de l'aimant. Jeter ce tube en déchets biologiques dangereux.
  7. Placez le nouveau tube dans l'aimant. Attendre 3 min.
  8. Inverser l'aimant sur un nouveau tube de 15 ml à vis pour collecter les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube.
  9. Complète le volume à 5 ml avec du DMEM sans rouge de phénol.

3. L'étiquetage des neutrophiles

  1. Ajouter 0,5 pi d'un colorant orange, tels que téléphone mobile Tracker Orange (concentration de travail1 pm, SACSM - chlorométhyl-rodol-acétate, stock 10 mM dans le DMSO). Incuber 2 min à 37 ° C.
  2. Ajouter 2,5 ml de milieu de préparation. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C.
  3. Surnageant défausse. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de préparation, dans un tube de 1,5 ml.
  4. Prendre une aliquote de compter avec hématocytomètre.
  5. Incuber 5 min à 37 ° C. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C.
  6. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de PBS. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C à laver.
  7. Surnageant défausse. Resuspendre le culot que 10x10 6 cellules par 100 pi de PBS. Garder sur la glace jusqu'à ce que l'injection intraveineuse. REMARQUE: les cellules doivent être iv injecté le plus rapidement possible. 6-12x10 6 neutrophiles / souris sont habituellement obtenue.

4. Préparation de la souris pour Microscopie intravitale

REMARQUE:.. Etape 4.1) et 4.2) doit être effectué au début de l'expérience, afin d'éviter le temps d'attente prolongée des neutrophiles marqués sur ice.

  1. Peser le CR1 GFP souris CX 3 (8-12 semaine ancienne).
  2. Préparer 800 ul d'anesthésiques kétamine (60 mg / kg, xylazine 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg dans du PBS).
  3. Anesthésier la souris. Ip d'injection avec 200 pl / 20 g de souris. Anesthésie de contrôle par l'orteil pincement et en cochant la fréquence respiratoire.
  4. Injecter neutrophiles (10x10 6 cellules dans 100 pi de PBS) par voie intraveineuse en utilisant les veines de la queue latérales ou le sinus rétro-orbitaire, à la convenance de l'expérimentateur.
  5. Placez la souris sur le coussin chauffant et protéger les yeux avec du gel oculaire.
  6. Une lamelle de verre (diamètre 35 mm) est placé dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm, qui a un trou 30 mm de diamètre. Utiliser l'huile est de maintenir la boîte de culture de tissu en contact avec la lamelle.
  7. Inciser la peau abdominale avec des ciseaux pour exposer le péritoine. Inciser péritoine avec des ciseaux pour exposer intestin.
  8. Ajouter 200 ul de PBS (pré-chauffée à 37 ° C) dans la peritoneal cavité. Prenez la souris dans votre main et tournez face vers le bas, de sorte que l'intestin sort de la cavité péritonéale avec une légère pression. Placer la souris dans la boîte de culture tissulaire.
  9. Deroll doucement l'intestin avec des cotons-tiges stériles sur la lamelle afin d'exposer les vaisseaux mésentériques.
  10. Couper des mouchoirs en papier dans les bandes et les mouiller avec 37 ° C chauffé PBS. Immobiliser l'intestin avec les morceaux de tissus en papier pour diminuer les mouvements résultant de péristaltisme.
  11. Mettre le plat de culture de tissus et de la souris à l'intérieur de la chambre thermostatée 37 ° C sur la scène du microscope inversé plateau sur mesure. Présentez une seringue contenant des anesthésiques sc dans la patte arrière. NOTE: En outre, la souris peut recevoir de l'oxygène (0,5 L / min) avec un masque.
  12. La souris de contrôle pour l'anesthésie par orteil pincement et la vérification de la fréquence respiratoire toutes les 30 min. Si nécessaire, fournir un coup de pouce d'anesthésiques (20 pi) de bien entretenir l'anesthésie. NE PASE: Le séchage de la vascularisation doit être évitée. Par conséquent, son humidité est maintenue en mouillant régulièrement les mouchoirs en papier utilisés pour immobiliser l'intestin à 37 ° C et réchauffé PBS.

5. Mesure des neutrophiles et des monocytes Comportement dans les navires enflammées in vivo en utilisant Microscopie intravitale

  1. Set lasers à 488- 561- et à la puissance la plus faible nécessaire pour éviter la phototoxicité induite par laser. Dans nos expériences, il est inférieur à 0,5%. Intensité de la GFP dans les monocytes et colorant orange dans les neutrophiles est si brillante que d'habitude 0,3% est suffisant. NOTE: Cela représente une puissance laser de 0,15 à 0,25 mW avec notre système.
  2. Acquérir des images de 512 x 512 pixels (soit 635 um) à 2.2 sec avec un sténopé ouverte en utilisant l'objectif sèche du microscope inversé 20X. Utilisez un z-profondeur comprise entre 10 à 20 um, qui assure un signal suffisamment avec les puissances laser faible.
    REMARQUE: Nous effectuons habituellement des expériences avec un z-profondeur comprise entre 12 à 1656; m. Dans le cas des chiffres et des films présentés, la profondeur z-est de 20 um. Le contraste de phase permet l'identification des parois endothéliales et l'imagerie est effectuée sur les veines mésentériques. Comme les cellules de patrouille se déplacent assez lentement à une vitesse de 5 à 10 um / min 6, l'enregistrement d'un champ d'intérêt toutes les 20 secondes est satisfaisant. Avec les réglages décrits, la platine motorisée permet l'enregistrement de jusqu'à 7 domaines d'intérêt dans le même temps.
  3. Placez la souris et les vaisseaux mésentériques dans la chambre de thermostat du microscope sont de leur permettre de se remettre de la préparation pendant 30 minutes avant l'acquisition du premier film. Pendant ce temps, choisir plusieurs domaines d'intérêt. Focus sur la surface luminale du vaisseau la plus proche de l'objectif. Si nécessaire, profiter de la légère auto-fluorescence de l'endothélium pour définir le focus.
    REMARQUE: Chirurgie lors de la préparation de la souris souligne légèrement l'endothélium. Par conséquent, le produit laminé de neutrophiles et/ ou des monocytes peuvent être observés dans la première préparation suivante de 15 min de la souris.
  4. Enregistrer un premier film pendant 30 min dans des conditions d'état stable, une image toutes les 20 secondes.
    REMARQUE: Le logiciel acquiert chaque champ d'intérêt en 2.2 sec et la platine motorisée se déplace automatiquement d'un champ à l'autre. Elle remonte à la première position dans les 20 secondes pendant les 30 min de l'enregistrement du film.
  5. Pour lancer inflammation des vaisseaux sanguins, ajouter une goutte de 20 pi de PBS contenant 100 ug de TLR2 / TLR1 agoniste PAM3CSK4 12 directement sur ​​les vaisseaux imagées.
  6. Contrôler la mise au point pour chaque domaine d'intérêt.
    NOTE: Dans le cadre de l'acquisition, il ya toujours de légers changements de focalisation sur l'axe z. Malgré le 10-20 um z profondeur, ce qui peut entraîner une diminution de l'intensité de fluorescence. Par conséquent, recentrer manuellement chaque champ d'intérêt à la fin de chaque film, si nécessaire. Enregistrez des vidéos pendant 30 min-périodes et jusqu'à 3 h pourtal après l'initiation de l'inflammation.
  7. A la fin de l'expérience, les souris anesthésiée sacrifice par dislocation cervicale.

6. génération de fichiers vidéo et de suivi des leucocytes

REMARQUE: Le logiciel d'acquisition Nikon génère .nd2 fichiers, mais la procédure suivante serait similaire avec d'autres logiciels et les marques.

  1. Exportation de fichiers que la série TIFF.
  2. Accédez au logiciel ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importez la série de tiff. Chaque canal dans un fichier différent.
  3. Appliquer un filtre médian avec un rayon de 2.0 pixel pour les canaux vert et rouge pour réduire le bruit de fond (Processus> Filtres> médians ...).
  4. Convertir des fichiers en binaire (Processus> Binary> Faire binaire). Activer le logiciel pour calculer le seuil pour chaque image.
  5. Fusionner canaux dans un seul séries d'images (Image> Couleur> Fusionner les couches ...). Sélectionnez les monocytes dans le degrécanal n, les neutrophiles dans le canal rouge et la lumière transmise dans le canal gris.
  6. Convertir images empilées en couleurs RVB (Image> Couleur> pile pour RGB).
  7. Enregistrer le fichier .avi que
  8. Les données sont importées et compilées dans un logiciel Imaris (Bitplane). Mouvements de monocytes et les neutrophiles sont ensuite suivis à l'aide de l'Assistant Suivi Spot.

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Representative Results

Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour contrôler facilement le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées en temps réel. L'utilisation d'une chambre de 37 ° C-thermostatée est impératif de maintenir la température de la souris et également en raison du mouvement des leucocytes dépendant de la température. Préparation de la souris est affiché sur la figure 1. La figure 2 montre l'ensemble de la zone vu au microscope. Lumière transmise permet l'identification des veines mésentériques (flèche rouge) et les artères (flèche bleue).

Traitement des images acquises avec les fichiers vidéo de ImageJ logiciels générés, tels que Film 1 et Film 2. La figure 3 montre les différentes étapes du traitement de l'image pour le premier point de Movie temps 1. Film 1 montre la patrouille de Ly6C faibles monocytes dans des conditions d'état stable comme précédemment dédécrit 6,8,14 alors que tous les neutrophiles circulent dans le sang. Pas de neutrophiles est de patrouiller la paroi endothéliale. Movie 2 montre le même domaine d'intérêt de 90 minutes après l'ajout de la TLR2 / TLR1 agoniste PAM3CSK4 pour initier localement l'inflammation. Dans ce cas, neutrophiles et des monocytes sont massivement recrutés à la paroi endothéliale, qui ils scannent méticuleusement. Il est important de noter que l'addition d'un agoniste TLR induit des changements dans la largeur de l'endothélium et modifie l'orientation de l'axe des z, par conséquent. Par conséquent, la concentration doit être contrôlée avec soin après l'addition de l'agoniste. Compilation de données dans le logiciel Imaris (Bitplane) permet le suivi des leucocytes individuels en utilisant l'assistant de suivi Spot. La figure 4 montre les chemins de piste exactes de monocytes (vert) et les neutrophiles (rouge) qui patrouillent le long de l'endothélium. Les données sont obtenues à partir de l'analyse de film 2, soit 90 minutes après l'ouverture d'inflammation. Suivi des chemins de leucocytes peut être exporté sous forme de fichiers TIFF ou fichiers xls pour obtenir diverses statistiques telles que la longueur de la piste, le déplacement, la durée ou de la vitesse.

Cette technique offre une belle façon de surveiller le comportement des monocytes et des neutrophiles dans le même temps, avant et après l'inflammation. Il est possible de suivre le recrutement de ces cellules sur la paroi endothéliale des heures supplémentaires. La perte de focalisation sur l'axe des z ou encore x / y de déplacement peut se produire à la suite de mouvements intestinaux qui ruine l'expérience. Film 3 illustre une telle préparation échoué et acquisition.

Figure 1
Figure 1. Préparation de la souris.
Les flèches noires indiquent tissus PBS-mouillé utilisé pour immobiliser l'intestin. Flèche blanche indique la boîte de culture de tissu de 10 cm. T indique l'étape de plateau sur mesure qui correspond à l'aluminium dans le microscope. Mésentérique les vaisseaux sanguins sont joliment exposés au centre sur la lamelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. branches des veines et des artères mésentériques.
Images (20 x 10) prises avec un objectif 10X ont été cousues pour constituer une grande image de la surface disponible. Plusieurs domaines d'intérêt sont alors choisis pour surveiller les mouvements de leucocytes avec un objectif 20X. La flèche rouge indique une veine mésentérique. La flèche bleue indique une artère mésentérique. La flèche verte indique le tissu adipeux entourant les vaisseaux. La zone sombre sur les côtés des résultats de l'image de la présence de tissu mouillé utilisé pour immobiliser l'intestin. Blanc barre d'échelle représente 1 mm.k "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Le traitement d'image avec ImageJ.
Les différentes étapes du traitement de l'image sont illustrés pour la première image du film 1. verts (monocytes) et rouges (neutrophiles) canaux sont traités séparément. Pour les données brutes d'origine (A), un filtre médian est appliqué (B) et ensuite converti en une image binaire (C). (D) les voies sont fusionnés en une image finale. Lignes vertes ou rouges observées dans les données brutes sont des cellules qui se déplacent si vite que le microscope ne sont pas en mesure d'acquérir en totalité eux. Blanc barre d'échelle représente 40 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. individuellepistes de leucocytes.
Pistes de monocytes (A) et (B) neutrophiles patrouillant l'endothélium sont traitées avec Imaris Software (Bitplane). Blanc barre d'échelle représente 40 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1
Film 1. leucocytes balayant la paroi endothéliale à l'état d'équilibre. A l'état stationnaire, Ly6C faibles monocytes patrouillent l'endothélium. Les neutrophiles circulent en fonction du débit sanguin. Les neutrophiles sont en rouge et les monocytes sont en vert. La barre d'échelle représente 50 um. Généré avec l'objectif 20X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

GE = "always"> Film 2
2:. Leukocytes balayage de la paroi endothéliale après inflammation TLR2 médiée même domaine d'intérêt que dans Film 1. film commence 90 minutes après l'addition de 20 ul de PBS contenant 100 pg de PAM3CSK4 (TLR2 / TLR1 agoniste) directement sur ​​le récipient. Monocytes et neutrophiles recrutés sont méticuleusement la numérisation de la paroi endothéliale. Les neutrophiles sont en rouge et les monocytes sont en vert. La barre d'échelle représente 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo.

Film 3
Film 3: Résultats obtenus à partir de la préparation de la souris incorrecte mouvements de bateaux obtenus lorsque l'anesthésie ou l'immobilisation de l'intestin sont incorrectes.. La barre d'échelle représente 50 um.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

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Discussion

Les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement monocytes et le comportement des neutrophiles dans les veines mésentériques dans des conditions stables et inflammatoires.

L'étape cruciale de la préparation est l'immobilisation de l'intestin avec des tissus PBS-mouillées. Si effectué correctement, les vaisseaux mésentériques sont joliment exposés sur la lamelle pour l'acquisition d'image. Cela permet la sélection de plusieurs domaines d'intérêt pour surveiller le comportement des leucocytes dans les veines mésentériques.

Notre protocole implique l'extériorisation de vaisseaux mésentériques avant le début des expériences, permettant (1) pour induire directement l'inflammation sur les navires suivis, et (2) pour enregistrer les points de temps précoces après stimulation et (3) de suivre la cinétique de recrutement des leucocytes et leur comportement dans le même récipient avant et après l'induction de l'inflammation.

Nous transfer neutrophiles purifiés à partir de moelle osseuse de souris du même fond génétique et non à partir de sang que plusieurs cellules peuvent être obtenues par animal (6-12x10 6 vs 6 0.5-2x10 / souris). Si l'utilisation de neutrophiles du sang est préférée, le même protocole peut être effectuée pour la purification de cellules.

Dans l'imagerie intravitale, la visualisation de la vascularisation est activé par la lumière transmise dans le cas des navires mésentériques. En variante, des anticorps fluorescents contre PECAM1 (clone 390) ou le dextrane fluorescent de haut poids moléculaire (70 kDa ou 2 MDa) 6,14 iv peuvent être injectés pour détecter le système vasculaire. Par exemple, l'injection intra-scrotale de 3 pg anti-PECAM1 (clone 390) a été signalée pour permettre la détection de la vascularisation avec faible bruit de fond et de ne pas affecter l'activité des leucocytes dans le modèle de crémaster 9. Par rapport à la lumière transmise, l'utilisation d'anticorps ou de colorants fluorescents introduit notamment la possibilité d'une reconstruction en 3D de la Vasculateur, mais un canal est sacrifié à son étiquetage et le temps d'acquisition est majoré. Lumière transmise est suffisante dans le modèle de mesenter grâce à la transparence du système vasculaire, comme décrit ici. Au contraire, un marquage fluorescent de la vascularisation est obligatoire dans le derme de l'oreille ou des organes opaques.

Détection d'une population de leucocytes peut être obtenue en utilisant des animaux transgéniques qui présentent une fluorescence endogène dans des types cellulaires spécifiques (monocytes CX 3 CR1 eGFP / poids 6 ou PCP 15 ou CD68 gfp 16 CD115, monocytes et neutrophiles Lys eGFP 9; et les plaquettes CD41 YFP 17) . Bien que CX3CR1 est exprimée dans toutes les monocytes et certains sous-ensembles de cellules NK et T, le CX 3 CR1 eGFP / souris de poids est intéressant de distinguer entre Ly6C inflammatoire <sup> élevées monocytes qui présentent moins de fluorescence de la GFP que Ly6C résident faibles monocytes 6. Comme CD115 est spécifique de la ligne monocytaire, l'MacBlue souris CD115 PCP est un modèle intéressant. Toutefois, il est impossible de distinguer Ly6C haute et basse Ly6C monocytes.

Une alternative à des souris transgéniques fluorescentes est l'injection intraveineuse d'anticorps fluorescents pour marquer les populations de leucocytes en temps réel. Par exemple, les monocytes peuvent être étiquetés avec anti-CD115 (clone AFS98), les neutrophiles avec anti-Ly6G (clone 1A8) et les plaquettes avec anti-CD49b (clone HMα2). En général, toutes ces anticorps sont épuisent à haute dose. Par conséquent, ils doivent être utilisés avec prudence pour une courte période de temps et à des niveaux faibles. Il convient de noter que, même à faible dose, un impact sur la fonction de la cellule ne peut pas être exclu. L'expérience personnelle avec de faibles quantités (1-2 ug) permet l'étiquetage des CD115 + monocytes et les neutrophiles Ly6G + sans appauvrissement (données non publiées).

Bien que le modèle de derme de l'oreille le système vasculaire est non-invasive que l'oreille est intacte, la profondeur du derme de l'oreille est une préoccupation, ce qui en fait un modèle plus approprié pour la microscopie photonique 2-13. En outre, il est possible de stimuler directement la cuve dans le modèle de l'oreille sans perturber physiquement la préparation.

Notre protocole peut être appliqué avec n'importe quel confocal microscope inversé. Depuis vitesse de balayage et de la puissance du laser sont dépendant de la machine, l'acquisition d'une trame (512 x 512 pixels, soit 635 um) sur un seul plan z nécessite environ 2.2 sec avec nos réglages pour le scanner de galvano du Nikon A1R. Malheureusement, cette faible vitesse limite la possibilité d'enregistrer des films de quatre dimensions de veines mésentériques sans perte de qualité. Dispositif de balayage de résonance du A1R offre une grande vitesse d'acquisition, même si laqualité des images est fortement réduite (fond par rapport signal spécifique) pour nos expériences avec le CR1 GFP souris CX 3 / poids. Il faut garder à l'esprit que les lasers sont fixés à moins de 0,5% (<0,25 mW) pour éviter la phototoxicité et de blanchiment.

Woodfin et al réussi à acquérir des films en 4D (60 images z-stack en 40 sec) des veinules crémasters utilisant un Leica TCS SP5-9. Comme les auteurs des valeurs d'image de 20-40 m de diamètre, ils sont probablement moins sensible aux changements d'orientation que dans notre modèle (suivi des veines mésentériques de 200-400 um). Lorsque l'imagerie des tissus vivants, le contrôle de mise au point est la préoccupation la plus importante, ce qui limite la possibilité d'enregistrer un film unique, qui dure plusieurs heures. Nous considérons que l'enregistrement de films d'une durée de 30 min (ou 45 min) est la plus pratique dans le modèle de mésentérique.

L'addition des agonistes TLR modifie la largeur de la cuve et donc le focus. Par conséquent,il est très difficile à l'image correctement 10-15 premières minutes après stimulation jusqu'à ce que les navires se stabilisent.

Une autre limite est la durée de l'expérience. En raison de la difficulté de maintenir la souris anesthésiée correctement sur une longue période de temps, il est difficile de l'image de plus de 4 heures après l'inflammation. L'utilisation d'autres anesthésiques, comme l'inhalation isoflurane continue, pourrait être une option (mais pas testé par nos soins).

Chez les souris âgées (plus de 16 semaines d'âge), augmentation de la quantité des dépôts de graisse autour des vaisseaux diminue la qualité de visualisation des vaisseaux mésentériques. Par conséquent, il est préférable d'exécuter des expériences avec des souris 8-12 semaines d'âge.

Cette technique peut être combinée avec l'injection intraveineuse d'anticorps pour bloquer des molécules d'intérêt ou épuiser populations leucocytaires donnés, de sorte que l'importance de molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou le comportement peut être déterminée. En outre,autres sous-ensembles de leucocytes peuvent être suivis en utilisant d'autres souches de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des populations de cellules d'intérêt.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes  Beckton Dickinson 352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm  Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm  Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye Life Technologies C34551
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit Stem Cell Technologies 19762
EDTA Sigma Aldrich E6758
FCS PAA A15-042
Immersion Oil Type A Nikon any viscous oil 
Life Box Temperature Control System Life Imaging
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NH4Cl Sigma Aldrich A9434
Nikon A1R confocal microscope Nikon A1R inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS Life Technologies D8537
phenol red free DMEM/F12 Life Technologies 21041-025 any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4 Invivogen tlrl-pms reconstitute in PBS
Rat serum Stem Cell Technologies included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100 TPP 93100

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References

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