Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

Neuroscience

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Liu, F., Liu, N. Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals. J. Vis. Exp. (107), e53337, doi:10.3791/53337 (2016).

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Abstract

El sistema olfativo insecto desempeña un papel importante en la detección de semioquímicos en el ambiente. En particular, la sensilla antenal que alojan las neuronas individuales o múltiples en el interior, se consideran para hacer la mayor contribución en la respuesta a los estímulos químicos. Al registrar directamente potencial de acción en el sensillum olfatoria después de la exposición a los estímulos, grabación sensillum sola técnica (SSR) ofrece un enfoque poderoso para investigar las respuestas neurales de los insectos a los estímulos químicos. Para el insecto de la cama, que es un conocido parásito humano, se han caracterizado múltiples tipos de sensillum olfativo. En este estudio, hemos demostrado respuestas neurales de chinches sensilla olfativa a dos estímulos químicos y las respuestas dependientes de la dosis a una de ellas por el método de la RSS. Este enfoque permite a los investigadores para llevar a cabo la detección temprana de los estímulos químicos individuales en el olfativo sensilla chinches, que proporcionarían información valiosa para el desarrollo de nuevos atrayentes o repelentes de chinches y los beneficios de los esfuerzos de control de chinches.

Introduction

La chinche de cama común Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), como un ectoparásito temporal, es un insecto hematófago obligado, lo que significa su supervivencia, desarrollo y reproducción requieren fuentes de sangre de los ejércitos, incluidos los seres humanos y los animales 1,2. Aunque la transmisión del virus rara vez ha sido reportado por C. lectularius, las molestias morder generada por una infestación afecta gravemente a los ejércitos, tanto física como psicológicamente 3. La introducción y el uso generalizado de insecticidas químicos, especialmente DDT, bajaron el riesgo de plagas y para el final de las infestaciones de 1950 se encontraban en un nivel tan bajo que ya no eran una grave preocupación pública. Sin embargo, una serie de posibles factores han llevado a resurgimiento en las poblaciones de chinches en todo el mundo, como la reducción del uso de insecticidas, una disminución de la conciencia pública, el aumento de la actividad de los viajes, y el desarrollo de resistencia a los insecticidas 4-9. </ p>

Señales químicas en el medio ambiente son detectados y reconocidos por los insectos a través de órganos olfativos, como antenas y palpos maxilares. El olfativo sensilla en las antenas de insectos juegan un papel crucial en la detección de estas señales químicas. Las moléculas químicas entran en la cutícula antenal través de los poros en la superficie de la cutícula. Odorante proteínas de unión en el enlace linfático antenal a estas moléculas químicas y transportarlos a los receptores de olor 10. Los receptores de olor y su co-receptor desde el canal iónico de cationes no selectivo en la membrana neuronal, que se despolariza una vez que estas moléculas químicas son reconocidos por los receptores de olor 11.

Grabación sensillum Individual (SSR) fue desarrollado para detectar el cambio extracelular en el potencial de acción causada por la aplicación de cualquiera de los estímulos químicos o no químicos. Mediante la inserción de un electrodo de registro en la linfa sensillum y un electrodo de referenciaen alguna otra parte del cuerpo del insecto (por lo general, ya sea los ojos compuestos o el abdomen), la tasa de disparo de las neuronas en respuesta a estímulos se puede grabar 12. Los cambios en el número de espigas representan la sensibilidad del insecto a estímulos específicos. Estímulos químicos de diferentes identidades y concentración provocarán diferentes respuestas neuronales, con diferentes tasas de disparo y las estructuras temporales, y por lo tanto pueden ser utilizados para investigar el proceso de codificación del insecto a los productos químicos específicos.

Para la chinche común, ambas formas sexuales comparten el mismo patrón de sensilla olfativo en las antenas: de nueve ranurado sensilla clavija C, 29-pelo como E (E1 y E2) sensilla, y un par cada uno de Dα, Dβ, Dγ peg suave sensilla 13,14. Como múltiples neuronas han sido identificados en cada tipo de sensillum, no es fácil distinguir los potenciales de acción de diferentes neuronas alojados en la misma sensillum, por lo que para este experimento la totanúmeros l de potenciales de acción se contaron fuera de línea durante un período mseg 500 antes y después de la estimulación. A continuación, el número de potenciales de acción después de la estimulación se restará de la cantidad de potenciales de acción antes de la estimulación y se multiplica por dos con el fin de cuantificar los cambios en la velocidad de disparo en cada sensillum individual en espigas por segundo 15.

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Protocol

1. Preparación de Instrumentos, Soluciones de estímulos, y los insectos de cama

  1. Preparar una solución de 50% KNO 2 (w / v) en una botella de 20 ml.
  2. Afilar dos microelectrodos de tungsteno en solución KNO 2 a 5 V por inmersión en repetidas ocasiones los electrodos de tungsteno dentro y fuera de la solución.
    1. Aproximadamente afilar el alambre de tungsteno por inmersión de aproximadamente 10 mm del alambre de tungsteno dentro y fuera de la solución de KNO 2 a la velocidad de 2 inmersiones / seg durante aproximadamente 5 min, lo que puede consumir en gran medida el extremo frontal del alambre de tungsteno.
    2. Delicadamente afilar el electrodo mediante la inmersión de aproximadamente 1 mm de la punta del alambre dentro y fuera de la solución a la velocidad de 2 inmersiones / seg durante al menos 1 min con el fin de hacer un punto del electrodo fino y agudo. Compruebe el diámetro de la punta del electrodo con el microscopio con frecuencia hasta que llega a 0,2 a 0,5 micras, que debe ser lo suficientemente fina como para perforar la cutícula del insecto de la cama sensillum olfativo.
      Nota: Si bien afilada manualmenteEning el electrodo, la velocidad de inmersión del alambre de tungsteno en la solución de KNO 2 no es constante todo el tiempo. Con más práctica, es mucho más fácil mantener una velocidad relativamente constante en el afilado del electrodo. La hora de afilar también es incierto en función de cómo bien debe ser el electrodo. Aquí, una punta de electrodo con el diámetro de ~ 0,2 micras es suficiente para perforar a través de la sensillum olfativo.
  3. Diluir cada uno de los estímulos químicos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a partir del compuesto ordenado a una concentración inicial de 01:10 v / v como una solución madre. Crear una serie de diluciones decimal dependiendo del número de dosis requeridas en el experimento, de nuevo con DMSO, a partir de cada una de las soluciones madre para cada producto químico. Aquí, utilizar 10% (+) - β-pineno y eucaliptol.
  4. Coloca los días sin alimentar o siete después de la alimentación de las chinches adultos (ya sea hombre o mujer) de la Ft. Colonia Dix (un regalo del doctor Haynes en la Universidad de Kentucky) que se utilizará en tque experimentar en una placa de Petri.
    Nota: No hay un número exacto de chinches colocados en la placa de Petri. Puede ser un poco o mucho.

2. Cama Bug Preparación Antenas

  1. Anestesiar las chinches en el hielo (2-3 min).
  2. Fijar tanto las antenas y el cuerpo del insecto en un cubreobjetos de microscopio con cinta de doble cara y retire las piernas con unas tijeras finas.
  3. Use una aguja pequeña para tocar suavemente las antenas a fin de que se peguen en la cinta de manera constante.
  4. Descansa el cubreobjetos contra una pequeña bola (~ 1 cm de diámetro) de cera dental para facilitar la manipulación y ajustarlo a un ángulo apropiado (~ 90 °) para el electrodo de registro (Figura 1).
  5. Una vez asegurado, coloque la chinche de cama bajo un microscopio estéreo, encienda la fuente de luz fría y ajustar la intensidad de la iluminación hasta que la antena se presenta claramente, y el enfoque del microscopio en el segundo flagelo de la antena de chinches a gran aumento (720X) .
    Nota: La intensidad de la iluminación utilizada en el experimento no se cuantifica, lo que realmente depende de cómo los ojos del experimentador sentir la intensidad de la iluminación.

3. Individual sensillum grabación

  1. Conectar el preamplificador (10X) con el controlador de adquisición de la señal, que está conectado con el ordenador para la grabación de la señal y visualización. Encienda el ordenador e inicie el software, por ejemplo, AutoSpike32 y haga clic en el modo de "Grabar" en la barra de menú. A continuación, elija la "onda" con el fin de iniciar la grabación de las señales de onda.
    Nota: Una línea plana que va desde la izquierda a la derecha de la pantalla en varias ocasiones ahora debe ser visible. Aquí, la ventana de grabación tiene una duración de 40 seg. Grabación Max onda es 10 seg. Frecuencia de muestreo seleccionada es 96.000 y la tasa de muestreo digital es 240. No es la posición 0% y sin filtrar, sin rectificación de las señales de grabación. Todos estos ajustes de los parámetros en el software pueden ser modificados según sea necesario.
  2. <li> Activar el altavoz conectado al preamplificador, que se utiliza para presentar el modo de tono para las respuestas neuronales a partir de sensillum antenal.
  3. Inserte el electrodo de referencia en el abdomen del insecto de la cama estabilizado.
    Nota: El electrodo de referencia se llevó a cabo por un soporte del metal se adhiere magnéticamente a la mesa de aire.
  4. Después de que el electrodo de referencia se ha conectado al abdomen del insecto de la cama, mover el electrodo de registro, que está conectado al preamplificador y manipulada por un micromanipulador, hacia el extremo posterior de la antena del insecto de la cama.
  5. Cuando el electrodo de registro está en contacto con la punta derecha de la antena, encienda el microscopio y localizar el electrodo a bajo aumento.
  6. Ajuste el electrodo de registro al tiempo que aumenta gradualmente la magnificación hasta que tanto el electrodo y la sensillum antenal están en el mismo plano y claramente visible bajo el microscopio.
    Nota: En ese momento, el microscopio es habitualmente con el máximo aumento.
  7. Inserte el electrodo de registro en el eje del sensillum usando el micromanipulador e ir un poco más si el ruido de fondo es alto en comparación con el potencial de acción.
  8. Una vez que los potenciales de acción claras se observan desde el sensillum grabada, llenar una micropipeta con 10% (+) - β-pineno. Utilice la micropipeta para depositar 10 l alícuota de 10% (+) - β-pineno sobre una tira de papel de filtro (~ 3 x 15 mm) colocado dentro de una pipeta Pasteur de vidrio.
    1. Conectar la pipeta cargada a la salida del tubo de flujo de impulsos del controlador de estímulo y coloque la punta de la pipeta en el pequeño orificio en el tubo orientado hacia la antena.
  9. Cuando todas estas conexiones se han estabilizado, presione el pedal del controlador de estímulo para entregar un soplo 0,5 seg de estímulo (0,5 L / min) en la corriente de aire humidificado continua. El registro de los potenciales de acción se iniciará simultáneamente cuando el footswitch es deprimido. El proceso de grabación será el último durante 10 segundos a partir del 1 seg antes de la estimulación.
  10. Cuente los potenciales de acción fuera de línea durante dos períodos de 500 ms, una antes y otra después de la estimulación. Restar cualquier cambio en la tasa de pico durante el ms post-estimulación 500 de la actividad espontánea registrado durante los 500 ms precedentes y convertir los conteos en la escala convencional de espigas / s multiplicándolos por 2.

Reemplazo 4. Estímulo en el SSR

  1. Una vez que el interruptor de pedal ha sido activado, entregar el 10% de (+) - β-pineno en la pipeta sobre la antenas bug cama y registrar la respuesta a este odorizante específico para 10 seg, después de lo cual se retira la pipeta.
  2. Etiquetar otra nueva pipeta con el eucaliptol 0,001% a ensayar. Coloque un pequeño trozo de papel de filtro sobre el que se ha aplicado 10 l de estímulo, en la nueva pipeta.
  3. Espere 2-5 minutos hasta que el estímulo es completamente vaporized en la pipeta de vidrio. Coloque la pipeta sobre la salida del tubo de flujo de pulso.
  4. Inserte la punta de la pipeta en el pequeño orificio del tubo orientada hacia la antena. Pise el pedal y empezar la grabación de 10 segundos.
  5. Desconecte la pipeta y preparar otra pipeta con 0,01% eucaliptol.
  6. Prueba de todo el resto de las dosis de eucaliptol (de 0,001% a 10%) en la sensilla antenal para observar las respuestas dependientes de la dosis. Prueba de la más diluida, a las dosis menos diluidas.

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Representative Results

Grabación individual sensillum es una poderosa técnica de investigación utilizada en los estudios de ecología química de insectos y fisiología neuronal. La investigación de las respuestas neurales de los insectos a los diferentes compuestos volátiles, especialmente los que piensa que es ecológico relacionado con la supervivencia y el desarrollo de los insectos, no sólo nos da una visión muy valiosa en el proceso de olfato de insectos, pero también abre nuevas vías prometedoras que potencialmente podrían conducir para el desarrollo de nuevos reactivos útiles para el control de plagas.

La chinche de cama común, como un notorio de plagas urbanas, sin duda ha atraído la atención de muchos investigadores. Entre las diversas áreas de estudio relacionadas con las chinches, su mecanismo olfato es de suma importancia para la ecología química de las chinches. Estudios previos han descrito explícitamente la cantidad y distribución de diferentes tipos de sensillum olfativa en la camaantenas bug. Como se muestra en la Figura 2A, antenas de chinches poseen cuatro segmentos (SC, PE, F1 y F2). La mayoría de la sensilla olfativa se presentan en el extremo posterior de la segunda flagelo (F2), pero su distribución es claramente diferente para cada tipo: la sensilla D, a saber Dα, Dβ y Dγ, sólo se encuentran a lo largo del lado interior de la antenas (Figura 2C), mientras que el C y E sensilla (E1 y E2) se encuentran a ambos lados de las antenas (Figura 2B). Por lo tanto, con el fin de asegurar que registrar la respuesta neural de la sensilla D, cuidadoso posicionamiento de la antena es esencial.

Dado que ambas formas sexuales de cuota de chinches el mismo patrón de tipos sensilla y la parte interna de sus antenas contiene todos los tipos de sensilla, apuntando a esta zona hace que sea mucho más fácil de registrar las respuestas químicas de todos los diferentes tipos de sensilla por separado en la antenae (Figura 3A). En la grabación sensillum única, diferente olfativo sensilla exhiben señales neuronales con distintivamente diferentes potenciales de acción tipos y amplitudes (Figura 3B). Por ejemplo, E sensilla se sabe que tienen uno o dos neuronas en el interior, mientras que el tipo D de la casa sensilla más neuronas que E o C sensilla, produciendo más complicados potenciales de acción que los otros como resultado. Las amplitudes de las respuestas neuronales a partir de C sensilla son mucho más pequeños que los de los otros tipos Sensillum.

Una vez que las conexiones de los electrodos se han establecido, las respuestas neuronales de cada tipo de sensillum a cada estímulo se pueden grabar en base a su identidad e intensidad. Para algunos estímulos a los que los chinches de cama son extremadamente sensibles, la respuesta neural puede ser muy fuertes y durar varios segundos más allá de la terminación de la estimulación. Por ejemplo, en respuesta a 10% (+) - β-pineno, chinches mostraronuna fuerte reacción con una tasa enorme de disparo (≥200 picos / seg) y dinámica temporal super-sostenidos en comparación con el control con disolvente solo como el estímulo (Figura 4A y B). Diferentes estímulos pueden provocar totalmente diferentes respuestas neuronales a partir de la misma sensillum y diferentes concentraciones de un mismo estímulo es probable que generen bastante diferentes frecuencias de cocción. Como se muestra en la Figura 5, el aumento de la concentración de eucaliptol levantó las frecuencias de disparo de 30 picos / seg a 0.001% a 240 picos / seg a 10% de una manera dependiente de la dosis.

Figura 1
Figura 1. Un diagrama esquemático que muestra el procedimiento de fijación de las chinches. La chinche de cama se estabiliza en el cubreobjetos con las antenas fijas en la cinta. La muestra montada se coloca entonces en un escenario magnético. La orientación y la altura de la muestra cun ser ajustado a un ángulo adecuado entre las antenas de chinches y el electrodo de registro. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Distribución de sensilla olfativo en las antenas de chinches. (A) Un escaneo Electrodo Microscopio (SEM) Imagen de una antena de chinches. La antena tiene cuatro segmentos, la Sculpus (SC), Pedecel (PE), el flagelo primera (F1) y el segundo flagelo (F2). La mayor parte de la sensilla olfativa se encuentran en F2, aunque unos pocos sensilla olfativas también se han encontrado en F1, que se cree que está relacionada con su función de detección de feromonas de agregación para el insecto de la cama 16. (B) Una imagen SEM de la cara exterior de F2, que alberga el olfac C y Esensilla tory. Una imagen SEM de la cara interna de F2, que se encontró a la casa de todos los diferentes tipos de sensilla olfatorio (C): D (Dα, Dβ, Dγ), C y E. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

figura 3
Figura 3. señales neuronales típicas de diferentes tipos de sensilla olfativa de antenas de chinches. Imágenes (A) de alta resolución de SEM de cada tipo de sensillum olfativo en las antenas de chinches. (B) las señales neuronales típicos de los diferentes sensilla olfativa antes de la exposición a un estímulo. Dα, Dβ, Dγ y C sensilla, que albergan múltiples neuronas sensoriales olfativas (OSN), exhiben más complicados potenciales de acción que E1 y E2 sensilla, que contain sólo uno o dos OSN. Las amplitudes de los potenciales de acción de C sensilla son mucho más pequeños que los de otros tipos Sensillum. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. respuesta neural Representante a estímulos que los chinches de cama son sensibles a. Trace (A) de señal que muestra la respuesta neural típica de un sensillum olfatorio (Dγ) para el disolvente, que se utiliza como el control en la grabación sensillum sola. Los rastros de la señal se establecen para comenzar 1 segundo antes de que el soplo de 0,5 segundos de estímulo. Las huellas de señal siguen grabando durante 10 segundos después de iniciar la bocanada de estímulo. (B) de la señal que muestra la traza extremadamente fuerte respuesta neural de un olfativasensillum (Dγ) a un estímulo botánico, 10% (+) - β-pineno. Después de la bocanada de (+) - β-pineno se entrega a la sensillum Dγ, OSNs alojados dentro de este sensillum se disparan con alta frecuencia y una dinámica temporal de larga duración. La barra blanca encima de la traza de la señal indica el intervalo de 1 segundo antes de la exposición de estímulo, la barra roja por encima de la traza correspondiente a la entrega de la bocanada de estímulo a la sensillum olfativa y la barra de negro por encima de la traza indica la señal grabada después de la terminación de puff estímulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. respuestas dependientes de la dosis representativas de OSN a los estímulos. El uso de otro estímulo botánico, eucaliptol como exaMPLE, la sensilla Dγ muestra una respuesta dependiente de la dosis a diferentes concentraciones de eucaliptol. Como las concentraciones aumentaron de 0,001% a 10%, las frecuencias de disparo se elevaron de 30 picos / seg a 240 espigas / seg. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La técnica individual sensillum grabación ha sido ampliamente utilizado en la prueba de las respuestas neurales de insectos como las moscas de la fruta, mosquitos y chinches a diferentes estímulos químicos en el medio ambiente. Estos estímulos químicos a menudo se disuelven y se diluyen en un disolvente común a fin de preparar diferentes dosis de los tratamientos. Sin embargo, diferentes disolventes pueden producir muy diferentes tasas de liberación de los estímulos. Estudios anteriores sobre algunos insectos estudiados extensivamente como Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus y Aedes aegypti han generalmente se usa aceite de parafina como disolvente para disolver los estímulos, ya que estos insectos son relativamente insensibles a aceite de parafina 17-20 de. Aceite de parafina también se ha utilizado en estudios de grabación sensillum individuales anteriores de insectos de la cama, por la misma razón 14. Sin embargo, el disolvente más utilizado puede no ser la mejor para cada especie de insecto. En el caSE de insectos de cama, tanto aceite de parafina y DMSO, a la que las chinches también exhiben insensibilidad, se han utilizado para disolver los estímulos en diferentes estudios 14,15, pero las mismas dosis de estímulos diluidos en DMSO parecen provocar respuestas neuronales mucho más fuertes en la sensilla de chinches. Por ejemplo, DMSO-disuelto R - (+) - limoneno y S - (-) - limoneno respuestas neuronales generados de ≥ 70 picos / seg de Dγ sensilla en antenas de chinches, mientras que el limoneno disuelto aceite de parafina suscitó respuestas neurales de la única ≤25 picos / seg de Dγ sensilla. Esta disminución en las respuestas neuronales es bastante común en los estímulos que han sido diluidas con aceite de parafina, probablemente debido a la tasa de liberación más lenta de aceite de parafina en comparación con DMSO. Esta tasa de liberación más lenta reduce la cantidad de estímulo entregado sobre la superficie de la sensillum y puede resultar en una conclusión engañosa con respecto a la sensibilidad de los insectos a ciertos semioquímicos.

Dos ste críticaps para llevar a cabo la grabación sensillum solo son la preparación 1) muestra y 2) de grabación de señales. Para la preparación de la muestra, ya que las chinches tienen piernas muy fuertes y antenas moviéndose activamente, es muy importante eliminar todas las piernas y se adhieren las antenas bien en la cinta de doble cara. En el proceso de grabación de señal, a veces, es imposible posicionalmente para el electrodo al punto en el eje sensillum. Si este es el caso, el electrodo puede perforar el extremo posterior de la sensillum, que siempre da una señal muy limpia y clara con muy poco ruido de fondo.

Como hay múltiples neuronas alojadas en el D y C sensilla tipo, a menudo es difícil distinguir entre las neuronas individuales en base a las amplitudes y las formas de los potenciales de acción producidos durante SSR. Sin embargo, todavía es posible ver las diferencias en las respuestas de la cama de errores a diferentes estímulos basado en la frecuencia de disparo combinado de todas las neuronas en la misma sensillum. En teoría, las chinches son sensibles a ciertos estímulos con una fuerte estimulación mientras insensible a otros estímulos con estimulación débil en la misma dosis. Otros estudios que integren pruebas de comportamiento y la información de su respuesta neural a estos estímulos serían, por tanto, proporcionar información significativa sobre semioquímicos ecológicamente relacionados sobre chinches.

En este estudio, que también se utiliza la técnica de SSR para poner a prueba las respuestas neurales de sensilla olfativa a diferentes dosis de estímulos. Se observó un patrón dependiente de la dosis en las respuestas neuronales del insecto de cama a diferentes sustancias químicas. Sin embargo, teniendo en cuenta el entorno complejo chinches viven, la dosis real de los compuestos volátiles que encuentran los insectos de la cama en su entorno normales será muy bajo. Como resultado, los semioquímicos que provocan una fuerte respuesta neuronal a dosis bajas hasta 01:10 5 tienen más probabilidades de ser biológicamente significativo para las chinches que otros productos químicos t v / v y 01:10 4 v / vsombrero única función a dosis altas. Por lo tanto, los semioquímicos que actúan a dosis bajas probablemente juegan un papel importante en la quimiorrecepción de las chinches, ayudándoles a localizar un host o evitar los factores adversos, por lo que proporcionarán una guía útil en la detección de la promesa atrayentes de chinches o repelentes para uso en tanto de laboratorio y ensayos de campo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire A-M SYSTEMS #716500 Used for preparing the electrode
KNO2 Sigma #310484 Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply BK Precision 1653A Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Leica Z6 APO Microscope Leica 10447424 Used for observing the sensilla on antennae
Simulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
4-Channel USB Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Light Source SCHOTT A20500 Providing light sources for observation
Micromanupulator Leica 115378 Used for minor movement of electrode
Speaker Juster 95a Connected with Acquisition Controller IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic stand Narishige GJ-1 Used to hold the reference electrode, stablized bed bug and stimulus delivery tube
TMC Vibration Isolation Table TMC 63-500 Used for isolating the vibration from the equipments
Coverslip Tedpella 2225-1 Used for holding the bed bug
Double-sided Tape 3M XT6110 Used for stablizing the bed bug on the coverclip
Dental Wax Dentakit DK-R012 Used for supporting the coverclip where bed bug is stablized 

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References

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