जीन एक्सप्रेशन से पीडि़त संकेत पारगमन रास्ते की पहचान करने के लिए चिकन भ्रूण अंग विकसित करने में मोतियों की ग्राफ्टिंग

1Division of Animal Sciences, School of Biosciences, University of Nottingham
Published 1/17/2016
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Developmental Biology

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Summary

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Mohammed, R. H., Sweetman, D. Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression. J. Vis. Exp. (107), e53342, doi:10.3791/53342 (2016).

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Abstract

चिकन भ्रूण का उपयोग यह सीधे वृद्धि कारक या जीन अभिव्यक्ति और संकेत पारगमन मार्ग की सक्रियता पर संकेत दे रास्ते के विशिष्ट अवरोधकों या तो के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए संभव है। इस तकनीक को विशेष समय के लिए ठीक से परिभाषित विकास के चरणों में संकेतन अणुओं की डिलीवरी की अनुमति देता है। इस भ्रूण काटा और जीन अभिव्यक्ति स्वस्थानी संकरण, या immunostaining के साथ मनाया संकेत पारगमन मार्ग के सक्रियण में, उदाहरण के लिए जांच की जा सकती हैं।

U0126, एक खल्क अवरोध करनेवाला में भिगो इस FGF18 में भिगो वीडियो हेपरिन मोती या एजी 1-X2 के मोतियों की माला में, ओवो में अंग कली में grafted रहे हैं। इस FGF18 U0126 से हिचकते हैं Myod और ERK फास्फोरिलीकरण और अंतर्जात और FGF18 प्रेरित दोनों Myod अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है कि पता चलता है। एक retinoic एसिड प्रतिपक्षी में भिगो मोती FGF18 द्वारा समय से पहले Myod प्रेरण शक्ति प्रदान कर सकते हैं।

यह दृष्टिकोण हमें हो सकता हैविभिन्न विकास कारकों और अवरोधकों और की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एड आसानी से विकासशील भ्रूण में अन्य ऊतकों के लिए अनुकूल है।

Introduction

एवियन भ्रूण कई वर्षों से एक के लिए विकास के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान की है। उनके सबसे उपयोगी विशेषताओं में से एक है कि वे हेरफेर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं। बाहरी विकास के इस तरह के सेल भाग्य 2,3 के अध्ययन के लिए क्लासिक बटेर-लड़की कल्पना प्रणाली के रूप में उदाहरण सहित विभिन्न micromanipulations भ्रूण का उपयोग करने में अंडे का खोल सकते हैं और प्रदर्शन करने के लिए यह संभव बनाता है, विकास 4,5 के दौरान विशिष्ट ऊतकों में overexpression के लिए रेट्रोवायरस के इंजेक्शन और explant संस्कृति विकास संकेतन स्रोतों 6 की पहचान करने के लिए। अभी हाल ही में GFP व्यक्त एक ट्रांसजेनिक चिकन लाइन से ग्राफ्ट के साथ लेबल हटाया मेजबान के बीच उत्पन्न काइमेरा शास्त्रीय ग्राफ्टिंग और आनुवंशिक संशोधन के संयोजन विकास 7.8 में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि दिखाया गया है।

एवियन भ्रूण हेरफेर किया जा सकता है जिस आसानी अंग के अध्ययन के लिए यह एक शानदार मॉडल बना दिया हैविकास 9। विवो में विकासशील अंगों के लिए विशिष्ट वृद्धि कारकों के आवेदन अंग patterning 10,11 में परिवर्तन और इस प्रक्रिया को 12 में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी है कि कारकों की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। यह दृष्टिकोण भी मांसपेशियों के विकास को नियंत्रित करने वाले कारकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और इस तरह के Wnts 13, BMPs 14 और HGF 15 के रूप में कई संकेतों के लिए भूमिकाओं का पर्दाफाश किया है।

हाल ही में इस तकनीक का अंग कली में myogenic जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के संकेतों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और FGF18 और retinoic एसिड के बीच बातचीत Myod अभिव्यक्ति 16 के समय को नियंत्रित कर सकते हैं कि दिखाया गया है। मोती पर लादा और फिर परिभाषित विकास के चरणों में विशिष्ट ऊतकों में सीधे grafted जा सकता है कि विकास कारकों और छोटे अणुओं का एक संयोजन का उपयोग विकास के दौरान लगभग किसी भी समय है और इस क्षेत्र में हस्तक्षेप करने का अवसर देता है। इस inve करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैविखंड patterning 17,18, तंत्रिका विनिर्देश 19, तंत्रिका शिखा पलायन 20 और एक्सिस विस्तार 21 सहित कई प्रक्रियाओं stigate।

यहाँ हम चिकन अंगों के विकास में या तो वृद्धि कारक या अवरोधकों में भिगो मोतियों ग्राफ्टिंग के लिए एक विधि का वर्णन है। इस स्वस्थानी संकरण में साथ मांसपेशियों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके myogenesis पर इन संकेतों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम इस तरह के retinoic एसिड या विशिष्ट संकेत दे रास्ते के छोटे अणु अवरोधकों के रूप में छोटे हाइड्रोफोबिक अणुओं के लिए वृद्धि कारक है, या एजी 1-X2 मोती के लिए उपयोग किया जाता है जो हेपरिन लथपथ मोती, या तो उपयोग ग्राफ्ट का वर्णन है। हालांकि अन्य मोती भी FGFs 22 और श्श्श 23 दोनों वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो उपलब्ध हैं।

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Protocol

आचार वक्तव्य: इन सभी प्रयोगों जानवरों की देखभाल और नॉटिंघम विश्वविद्यालय के नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करें।

ग्राफ्टिंग के लिए हेपरिन मोतियों की 1. तैयारी

  1. उपयोग करने से पहले पीबीएस में अच्छी तरह से हेपरिन मोती धो लें। नोट: मोती पीबीएस में एक घोल के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    1. पीबीएस के 1 मिलीलीटर बूंद में एक 20 μl विंदुक के साथ शेयर करने से उन्हें हटाने के द्वारा ग्राफ्टिंग के लिए मोती का चयन करें। फिर एक 3 सेमी पेट्री डिश में पीबीएस के एक 20 μl ड्रॉप में मोती हस्तांतरण करने के लिए 2 μl करने के लिए सेट एक micropipette का उपयोग करें। एक p2 विंदुक टिप के साथ चयनित मोती हस्तांतरण, माइक्रोस्कोप विदारक एक स्टीरियो का उपयोग कर, आकार पर आधारित मोती चुनें और; उन चारों ओर 100 मीटर व्यास आदर्श होते हैं।
  2. मोतियों से पीबीएस निकालें। एक 20 μl पिपेट और ठीक watchmakers संदंश के साथ केशिका क्रिया द्वारा अवशिष्ट तरल के साथ तरल के सबसे निकालें। नोट: यह वास्तविक विकास इसलिए जितना संभव हो उतना दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हैयह मोती के लिए जोड़ा जाता है जब आर पतला नहीं है।
  3. मोती पर सीधे वृद्धि कारक पिपेट। FGF18 के लिए पीबीएस में 0.1% BSA में 0.5 मिलीग्राम / एमएल पर पुनर्गठन पुनः संयोजक FGF18 के 0.5 μl जोड़ें। वाष्पन से तरल को रोकने के लिए पकवान के किनारों के आसपास पानी की कई बूँदें रखें।
  4. आरटी पर 1 घंटे के लिए मोती सेते हैं। पाश्चर विंदुक के साथ पकवान से पानी की बूंदों निकालें और ग्राफ्टिंग के लिए तैयार बर्फ पर जगह है।
  5. उन्हें कल्पना में मदद करने के लिए कलम बांधने का काम करने से पहले (पारदर्शी मोतियों के लिए) हस्तांतरण 2% फिनोल लाल को 4-5 मोतियों की आवश्यकता है। भ्रूण को स्थानांतरित करने से पहले पीबीएस में कुल्ला।

ग्राफ्टिंग के लिए एजी 1-X2 के मोतियों की 2. तैयारी

  1. 0.2 एन फार्मिक एसिड के साथ derivatize मोती का उपयोग करने से पहले।
    1. इस प्रयोग के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब मोती हस्तांतरण करने के लिए एक रंग ऐसा करने के लिए। 0.2 एन फार्मिक एसिड के 1ml जोड़ें और 1 घंटे के लिए एक मिलाते हुए मंच पर धो लें।
    2. फिर एक P1000 विंदुक के साथ फार्मिक एसिड को हटाने और एक साथ की जगहपानी की मिलीलीटर। 1 घंटे के लिए धो और फार्मिक एसिड शेष दूर करने के लिए छह बार दोहराएँ।
    3. एक P1000 विंदुक के साथ शेष तरल निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों की दुकान। नोट: यह इस स्तर पर सभी अवशिष्ट पानी निकालने के लिए आवश्यक नहीं है।
  2. एक 3 सेमी पेट्री डिश में एक छोटा सा रंग का उपयोग कर शेयर से लगभग 5-10 μl मात्रा के मोतियों की एक छोटी सी गोली निकालें और DMSO के 1 मिलीलीटर जोड़ने (या दवा में भंग कर रहा है विलायक जो भी)। नोट: यह सही आकार के उन लोगों का चयन करने के लिए, जिसमें से कई सौ मोती प्रदान करना चाहिए।
  3. फिर एक और 3 सेमी पेट्री डिश में विलायक की एक 20 μl ड्रॉप करने के लिए लगभग 100 मीटर व्यास की माला हस्तांतरण करने के लिए 2 μl करने के लिए सेट एक p2 पिपेट का उपयोग करें।
  4. एक 20 μl पिपेट और एक 2 μl विंदुक के साथ किसी भी अवशिष्ट विलायक के साथ विलायक निकालें। दवा के 20 μl लागू किया जाना है के साथ बदलें।
    नोट: स्थिरता (या कभी विलायक इस्तेमाल किया जाता है) DMSO में 100 माइक्रोन की एकाग्रता पर दवा भंग के लिए,कुछ छोटे अणु inhibitors के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर 20 μl और दुकान में विभाज्य अस्थिर कर रहे हैं और यह दोहराया फ्रीज विगलन से बचने के लिए सबसे अच्छा है। यदि आवश्यक हो तो मोती भिगोने से पहले वांछित एकाग्रता के लिए दवा पतला। प्रभावी सांद्रता प्रत्येक दवा के लिए अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  5. 1 घंटे के लिए सेते हैं। इन अणुओं के कई संवेदनशील प्रकाश कर रहे हैं के रूप में प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  6. पानी में भंग 2% फिनोल लाल के 20 μl में 2 μl करने के लिए सेट एक p2 पिपेट साथ स्थानांतरण 4-5 मोती कलम बांधने का काम करने से पहले। मोती कल्पना करने के लिए एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग इस कदम को पूरा करें। ठीक watchmakers संदंश के साथ एक एकल मनका या एक तार पाश निकालें और भ्रूण को स्थानांतरित करने से पहले पीबीएस में कुल्ला। इस गतिविधि का नुकसान हो सकता है के रूप में उपयोग करने से पहले अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए 2% फिनोल लाल रंग में मोती मत छोड़ो।

3. टंगस्टन सुइयों तैयारी

  1. 3-4 सेमी लंबाई में ठीक टंगस्टन तार काट दिया। के अंत में तार का एक टुकड़ा डालेंएक लेम्प बर्नर में एक गिलास पाश्चर विंदुक और पिघल स्थिति में ठीक करने के लिए। वे प्रयोग के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं, तो पुर्जों देखते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए 10 सुइयों अप करने के लिए तैयार करें।
  2. एक टांका लगाने का यंत्र लौ में तार के अंत की जगह और (2-3 मिनट के आसपास) टंगस्टन सफेद चमक रहा है और टिप तेज है जब तक वहाँ पकड़ो। नोट: उपयोग के दौरान सुई से साफ किया जा सकता है और जरूरत के रूप में टांका लगाने का यंत्र में फिर से बढ़ाई।
    नोट: इन सुइयों भी मोती स्थानांतरित करने के लिए छोरों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। धीरे बेंच के लिए सुई को छूने और यह एक पाश फार्म के आगे झुकना होगा।

मनका Grafts के लिए 4. तैयारी भ्रूण

  1. वे वांछित चरण (सबसे अंग कली जोड़तोड़ के लिए 3-5 दिन) तक पहुंचने तक कुंद अंत तक साथ अंडे सेते हैं। खोल तोड़ने के लिए और फिर खोल हटाने और भ्रूण का पर्दाफाश संदंश का उपयोग करने के लिए कुंद अंत पर कुंद संदंश नल का उपयोग करना। खोल झिल्ली यह भी सुनिश्चित निकाल दिया जाता है।
    नोट: पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर के साथ सहायता के लिए एक पाश्चर विंदुक के साथ जोड़ा जा सकता हैइस झिल्ली जर्दी से चिपक है। धीरे, जर्दी की सतह पर पीबीएस पिपेट जर्दी को नुकसान नहीं ख्याल रख रही है, संदंश के साथ झिल्ली समझ, और धीरे दूर अंडे से यह पुल।
  2. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ अंडा और एक 19 जी सुई से अंडे की सफ़ेदी के 5 मिलीलीटर तक निकालें। भ्रूण जीवित रहने की दरों को कम कर सकते हैं बड़ी मात्रा को हटाने के रूप में अंडे सील करने के लिए इस्तेमाल किया टेप के साथ संपर्क नहीं कर सकता है भ्रूण सुनिश्चित करने के लिए जरूरत के रूप में ही ज्यादा ले लो।
  3. भ्रूण 15 100 यू पेनिसिलिन युक्त पीबीएस के मिलीग्राम और 0.1 मिलीग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल के लिए कलाकारों भारत स्याही की एक 5-6 बूँदें जोड़ने कल्पना करने के लिए। 0.5-1 इंजेक्षन मिलीलीटर सीधे 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ भ्रूण और एक 25 जी सुई के तहत।
  4. निर्जलीकरण नहीं है भ्रूण सुनिश्चित करने के लिए अंडे में 1% भ्रूण बछड़ा सीरम और 100 यू पेनिसिलिन और 0.1 मिलीग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल के साथ पीबीएस के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें। धार तेज watchmakers संदंश का प्रयोग पीतक झिल्ली को हटा दें और विकासशील अंग कलियों से अधिक भ्रूणावरण खुला। भ्रूण बाहर सूखा नहीं है सुनिश्चित करें औरयदि आवश्यक हो तो, यह और पीबीएस / एफसीएस जोड़ें।
    नोट: अंग कलियों स्पष्ट रूप से भ्रूण के पार्श्व पर बनती outgrowths के रूप में देखा जा सकता है। इन चरणों में भ्रूण ऐसे दाईं ओर सामान्य रूप से सबसे ऊपर है बंद हो जाएगा। नतीजतन यह सही अंग में मोती भ्रष्टाचार और contralateral नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया है लोगों का उपयोग करने के लिए सामान्य रूप से आसान है।
  5. मनका प्रत्यारोपित किया जाएगा, जहां अंग कली में एक चीरा बनाने के लिए एक तेज टंगस्टन तार का प्रयोग करें। युवा चरणों में यह मुश्किल है, हालांकि जहां संभव अंग कली माध्यम से सभी तरह काटने से बचें।
    नोट: पुराने भ्रूण (एच एच चरण 22 और ऊपर) में यह ग्राफ्टिंग के लिए, लेकिन अंग ही छोटा है कली के रूप में यह और अधिक कठिन है युवा चरणों में अंग कली के विशिष्ट क्षेत्रों का चयन करने के लिए संभव है। यह अंग कली तो, विशेष रूप से युवा चरणों में, मनका समीपस्थ अंग में रहेगा grafted मनका अतीत बड़ा हो जाएगा कि याद करने के लिए भी महत्वपूर्ण है।
  6. या तो अतिरिक्त ठीक वा का उपयोग कर वृद्धि कारक या दवा से या तो एक मनका उठाओtchmakers संदंश या एक टंगस्टन सुई से बने एक पाश। मनका DMSO या फिनोल लाल या तो में भिगो कर दिया गया है, तो भ्रूण के लिए आवेदन करने से पहले पीबीएस में कुल्ला। संदंश / तार पाश के साथ भ्रूण को मनका स्थानांतरण। तब चीरा में मनका डालने के लिए बढ़ाई टंगस्टन तार का उपयोग करें।
  7. भ्रूण हाइड्रेटेड रखा जाता है यह सुनिश्चित करना कि अंडे के लिए पीबीएस / एफसीएस के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें लेकिन इस भ्रूण को नुकसान पहुंचा और मनका उखाड़ फेंकना जा करने के लिए पैदा कर सकता है के रूप में भ्रूण खुद पर सीधे आवेदन करने से बचें। टेप के साथ अंडे को सील करने और इनक्यूबेटर पर लौटने।

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Representative Results

एचएच चरण में 21 Myod धुंधला विकासशील somites (चित्रा 1 ए) के myotome में देखा जा सकता है, हालांकि अंग myoblasts के विकास में नहीं व्यक्त की है। चित्रा 1 बी एक FGF18 मनका भ्रष्टाचार निम्नलिखित Myod 6 घंटे के लिए स्वस्थानी संकरण में पता चलता है। Contralateral अंग में कोई अभिव्यक्ति नहीं है, जबकि Myod मनका के करीब myoblasts में प्रेरित किया है। U0126 में भिगो एक मनका, खल्क, Myod (चित्रा 1 सी) के ब्लॉक FGF18 प्रेरण की एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला सह-ग्राफ्टिंग। इसी एचएच चरण 21 में एक U0126 मनका ग्राफ्टिंग और 24 घंटा अनुपचारित contralateral अंग (चित्रा -1, ई) के साथ तुलना Myod की अंतर्जात अभिव्यक्ति कम कर देता है के बाद Myod अभिव्यक्ति के लिए देख रहे हैं।

एचएच चरण 19 FGF18 पर अंग कलियों में Myod (चित्रा 1F) प्रेरित नहीं करता। Figu (मोतियों की हालांकि सह-ग्राफ्टिंग FGF18 में भिगो और retinoic एसिड प्रतिपक्षी BMS493 इस पर काबू कर सकते हैं और अस्थानिक Myod का पता चला हैफिर से 1G)

चित्रा 1 मैं FGF18 तेजी फास्फोरिलीकरण लाती है कि पता चलता है कि जबकि FGF18 पुष्टि करने के लिए खल्क भ्रूण के माध्यम से अभिनय 1 घंटा मनका भ्रष्टाचार के बाद काटा और फॉस्फोरिलेटेड ERK के लिए immunostained गया है, खल्क। चित्रा 1H का लक्ष्य ग्राफ्टिंग के बाद एक FGF18 मनका 1 घंटा की एक brightfield छवि से पता चलता है grafted मनका के आसपास ERK की। चित्रा 1J इन छवियों का ओवरले से पता चलता है। नियंत्रण मोती ERK फास्फोरिलीकरण प्रेरित नहीं करते 0.1% BSA में भिगो (चित्रा 1K, एल, एम)

आकृति 1
अंगों में चित्रा 1. Myod अभिव्यक्ति Myod (ए) व्यक्त नहीं करते एचएच चरण 21 पर। ERK फास्फोरिलीकरण के माध्यम से FGF18 और retinoic एसिड से unmanipulated नियंत्रण अंग नियंत्रित किया जाता है, लेकिन समय से पहले अभिव्यक्ति (एक FGF18 मनका ग्राफ्टिंग के बाद 6 घंटा पता चला हैबी)। सह-ग्राफ्टिंग FGF18 और U0126 मोती ब्लॉकों इस प्रेरण (सी)। अंतर्जात Myod अभिव्यक्ति एचएच चरण 21 (डी) में देखा जाता है, लेकिन इस U0126 (ई) में भिगो मोतियों ग्राफ्टिंग द्वारा अवरुद्ध है। पहले अंग कलियों में समय से पहले Myod अभिव्यक्ति FGF18 (एफ) द्वारा प्रेरित नहीं है, लेकिन FGF18 और retinoic एसिड प्रतिपक्षी BMS493 (जी) में भिगो सह ग्राफ्टिंग मोतियों से प्रेरित है। Brightfield (एच), फ्लोरोसेंट (आई) और विरोधी phosphoERK लिए immunostained एक HH21 अंग (जे) छवियों का विलय कर दिया: HH21 अंग में grafted FGF18 मोती 1 घंटे के बाद ERK फास्फोरिलीकरण प्रेरित। बीएसए में भिगो नियंत्रण मोती ERK फास्फोरिलीकरण प्रेरित नहीं करते: (कश्मीर), फ्लोरोसेंट (एल) और विरोधी phosphoERK लिए immunostained एक HH21 अंग की (एम) छवियों विलय कर दिया। यह आंकड़ा Mok एट अल, 2014 16 से संशोधित किया गया है। काले तारक: हेपरिन मोती; सफेद Asteजोखिम: एजी 1-X2 मोती; तीरों का अंग कलियों में अस्थानिक Myod अभिव्यक्ति दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ओवो में ऊतकों को विकसित करने के लिए सीधे आवेदन मनका ग्राफ्ट का उपयोग वे लागू कर रहे हैं, जिस पर विकास मंच और जोखिम की अवधि से अधिक अद्वितीय नियंत्रण दे रही है विकास के दौरान वृद्धि कारक सिगनल की भूमिका काटना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

अणु के प्रत्येक प्रकार के लिए मनका के चुनाव महत्वपूर्ण है। यह प्रत्येक अनुभव से इन मोतियों पर अवरोध की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए आवश्यक है, हालांकि इस तरह यहाँ वर्णित अवरोधकों और retinoic एसिड के रूप में छोटे हाइड्रोफोबिक अणु, आमतौर पर derivatized एजी 1-X2 मोती के लिए अच्छी तरह से बाइंड करें। इसी तरह, विकास कारकों के लिए यह मनका के विभिन्न प्रकार के परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है। कुछ मोती भ्रष्टाचार प्रदर्शन करने के लिए काफी लंबे समय के लिए उन्हें लेबल होगा जोड़तोड़ लेकिन पीबीएस में एक कुल्ला द्वारा पीछा फिनोल लाल के साथ एक छोटी उपचार के दौरान कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है तो पारदर्शी और कर रहे हैं।

मोतियों की तैयारी करते हैं, विशेष रूप से उन अवरोध करनेवाला के साथ भिगो कर दिया गया है जोएस, यह जहाँ तक संभव के रूप में प्रकाश से बचाने के लिए महत्वपूर्ण है। उनकी प्रारंभिक उपचार के दौरान और हेरफेर के दौरान वे शामिल किया जाना चाहिए और मोतियों का तबादला किया जा रहा है जब केवल हटा दिया। इन अभिकर्मकों कुछ अस्थिर कर रहे हैं और ठीक से जमा नहीं करता है, तो भ्रामक नकारात्मक परिणाम दे सकते हैं के रूप में यह हौसले thawed aliquots का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है। यह मनका के प्रभाव को कम कर सकते हैं इस के रूप में बांधने का काम पहले भी लंबे समय के लिए फिनोल लाल रंग में भिगोने उन्हें छोड़ने के लिए नहीं भी महत्वपूर्ण है।

दोनों वृद्धि कारक है और दवाओं की, इन मनका ग्राफ्ट के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता, अक्सर बहुत अधिक हैं; FGF18 मोती अक्सर 100 माइक्रोन की एकाग्रता में भिगो कर रहे हैं छोटे अणु अवरोधकों के लिए 0.5 मिलीग्राम / एमएल और मोतियों की एक एकाग्रता में भिगो कर रहे हैं। यह आम तौर पर इस मोती द्वारा अवशोषित कर लेता है और फिर जारी किया वृद्धि कारक है और दवाओं की मात्रा के रूप में आवश्यक है समाधान में कोशिकाओं के इलाज के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता तुलना में बहुत अधिक है, हालांकि सीधे लेकिन शायद पीढ़ी को मापने के लिए मेहनत कर रहे हैंइस में विवो से कम स्तर ते। नतीजतन सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए एक प्रभावी खुराक निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रत्येक अणु के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।

विकास के दौरान, 24 somites और इस तरह चुनाव आयोग संस्कृति के रूप में 25, ओवो में या संस्कृतियों में भ्रूण पर इस्तेमाल किया जा सकता है इस तकनीक को भी अन्य ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू इस तरह की है। यह तो उसी तरह से 26 में भ्रूण के विकास में grafted किया जा सकता है, जो छर्रों के रूप में विशिष्ट वृद्धि कारक स्रावित जो सुसंस्कृत कोशिकाओं को विकसित करने के लिए भी संभव है।

पहुंच के संयोजन, हेरफेर और कम लागत में आसानी चिकन भ्रूण के विकास का एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है। ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों तेजी से एवियन प्रजातियों और दोनों मुर्गियों के आनुवंशिक रूप से संशोधित लाइनों के लिए लागू कर रहे हैं के रूप में 7 और बटेर 27 पहले से ही डी में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर रहा है इन संशोधित पक्षियों के साथ तकनीक ग्राफ्टिंग शास्त्रीय भ्रूण के संयोजन से उपलब्ध हो जाते हैंविकास 8,28।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin acrylic beads Sigma H5263 The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads Bio-Rad 140-1231
Affi Gel blue beads Bio-Rad 153-7301; 153-7302 These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18 Peprotech 100-28 Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126 Cell Signalling 9903 Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493 Tocris Biosciences 3509 Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink Windsor and Newton 5012572003384 (30 ml) While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% Alfa Aesar 10404
Penicillin / streptomycin Sigma P0781 Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS

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References

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