在Micropost阵列方便,准确机械力分析

Bioengineering

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Goedecke, N., Bollhalder, M., Bernet, R., Silvan, U., Snedeker, J. Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays. J. Vis. Exp. (105), e53350, doi:10.3791/53350 (2015).

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Abstract

Introduction

机械性敏感基于细胞的测定允许调查粘附细胞,具有广泛的,反映了力学可以在细胞生物学发挥核心作用的应用程序。这些应用程序通常专注于推动亚细胞过程或全细胞行为的基本机制。一方面,外部环境因素,如细 ​​胞外基质组合物或基质硬度可显着地影响细胞的机械和生物反应。1同样可以使用许多类的药物活性化合物的后观察到,其中,效果是常其特征在于使用细胞培养模型2另一方面基因型性能,例如那些引起自发或实验诱导的基因突变,可诱导了与细胞骨架结构和功能的改变相关的细胞表型的显着的变化。3这些实施例短短数的许多可能的题目为哪些细胞机械表型是相关的,并且所有的这些都被有效地研究了micropost阵列。

在写这篇文章的时候,大约有200多篇已经发表了描述细胞micropost互动。这些作品讨论micropost偏转原理的理论问题,以及在其制造的实用说明。第一篇文章中描述的细胞和灵活micropost阵列的相互作用是出 ​​版的谈及其同事在2003年4相反经典牵引力显微镜(TFM),其中连续的软衬底被用于估计nanonewton规模细胞收缩,Tan等人描述使用由有机硅弹性体的多个紧密隔开的垂直梁的方法。该技术的主要优势出现两个主要的功能。首先,为了改变小区表观基板刚度1只需要改变micropost尺寸,同时保持基板组合物,否则恒定,从而避免了在表面拓扑结构和化学的差异。第二microposts像可以与力和空间分辨率个别粘着斑的数量级上离散地分析,并且可以减少所固有的由标准的TFM类似分析的分析挑战个人弹簧。

今天的micropost阵列的应用范围大大超过了力量的只是少数单个细胞的映射。例如,秋山报告使用的分离的背脉管组织从一个蛾毛虫作为致动器的一个micropost阵列,为了开发一种昆虫肌肉供电自主微型机器人。5

然而,microposts大部分发布的应用程序都集中在医疗条件,比如感染或癌症的研究。例如,micropost阵列已经用于研究力产生的奈瑟gonorrh捆绑IV型菌毛是与信号级联增强感染有关。6其他已经使用microposts研究并靶向细胞骨架的药物化合物治疗乳腺癌细胞OEA菌落。7

一个micropost的偏转采用经典梁理论常常被描述为与最终负载假设电池的悬臂只重视对micropost的最顶端。这里所施加的 F引起的偏转δ取决于micropost的“抗弯刚性”k和由下式计算:

式(1) (1)

与E,I,和L是杨氏模量,转动惯量和梁的长度分别面积矩。然而,从这个公式的结果只能给力的,因为梁剪切加工和弯曲以及一般近似为底物变形者不被交流计数。考虑到microposts通常由从软材料如聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基础的硅橡胶需要这些因素包括在内。 舒恩等人证实,有这样的基础上micropost(L / D)和相应的聚合物的泊松 V的纵横比的校正因子8它由下式给出。:

公式(2) (2)

T 倾斜 (ⅴ)作为一个倾斜系数,其包括嵌合参数a = 1.3作为可以在同一篇文章中找到:

公式3 (3)

这意味着一个micropost的校正刚度ķ 压改正是纯弯曲刚度k = k 弯曲的产物和校正因子压改正计算公式如下:

公式4 (4)

因此,细胞力的计算应采用公式(1)的更精致的变化,现在读来进行:

公式5 (5)

修正的影响,只要是用于micropost尺寸典型值变得更为明显。例如,一个15微米长micropost具有圆形横截面,并且直径为5μm制成的基于PDMS的硅橡胶导致0.77的校正因子,因此,未校正的计算将23%高估施加的细胞的力。这变得更加严重为microposts具有较小的纵横比。

传统上,micropost图像分析也基于理想化的梁弯曲理论。在2005年率先使用MICR的组OPOST阵列出版适合micropost分析的图像分析软件9所述的软件需要软件许可证及用户必须采取三种图像的每个位置。分别来自micropost的顶部和底部的平面中的传输模式,另一种在荧光模式与染色的细胞。比较所述顶部和底部的位置为每个后micropost的软件确定的力矢量场,并计算相关的参数,如每交力。其它软件包存在,他们的分析原则在描述它们的相应条款简要地提到,但这些分析软件包通常是不公开的。10,11

设计用于映射细胞力的micropost阵列可分类为在正交micropost布局或六边形的,后者具有的所有邻居microposts之间等距的间隙的优点是。典型microposts公顷已经圆形截面和它们的尺寸范围从1.0微米至10微米的直径和2到50微米,长度4然而,microposts与椭圆形或正方形的横截面也有报道。12,13

使用基于PDMS的硅氧烷混合物作为micropost材料允许用于将纳米颗粒引入该混合物中。例如添加钴纳米棒使micropost的磁性活化,从而提供了潜在的实验设计的另一个自由度。14大部分组上产生平的刚性基板像盖玻璃或培养皿内其micropost阵列。然而,Mann和同事最近报道上形成可拉伸膜一个micropost阵列15这允许在研究活细胞的亚细胞动态响应在细胞收缩的术语细胞拉伸力到贴壁细胞的应用。

目前广泛使用的,最ESTAB用于制造micropost阵列lished过程中Sniadecki和同事。16-18的见地协议总之标准洁净室处理中描述被用于产生关于使用SU8光致抗蚀剂的硅晶片的顶部的微结构是基于软光刻。这之后是复制方法,其中在硅橡胶被浇铸在将它们转移到模具中的结构。在第二步骤中这些模具被用于复制使用的硅橡胶上的选择的衬底顶部的初始显微结构。然而,尽管大,越来越多的与他们申请公开,建立一个制造过程microposts的花费相当长的时间,即使对微工程专家;存在需要优化和适应特定实验室环境和micropost布局,得到可接受的质量水平的许多工艺步骤。

商业micropost阵列现已就绪-T邻的使用(“现成的架子”)格式具有一贯的高品质。因此,它们是替代所需的现场制作的复杂和冗长的制造工艺。本文的市售micropost阵列用于使用单明场显微术图像映射蜂窝力。更重要的是本文介绍和文件名为MechProfiler一个全功能的开源软件,可以下载作为补充材料,这份手稿。该软件的一个比较活跃的版本也可以在http://www.orthobiomech.ethz.ch找到。

一个“关闭的,现成的”检测和兼容的开源分析软件相结合,显着降低了进入障碍,以实现精确的TFM实验。研究人员无法获得任何无尘室设备或软件开发专业知识成功地分析细胞的力量。它使用户能够集中于mechanosensitivity分析输出,而不是技术本身,使之能够为更广泛的社区牵引力测量。此外,这是对铺平阵列micropost全自动筛选的方式迈出的重要一步。

该MechProfiler分析软件处理的文件格式TIFF,PNG,BMP和JPG图片。这些图像可以用荧光,相衬或明视场光学显微镜拍摄。该独立程序与游离Matlab的编译器运行时(见: 图12)一起运行,并底层算法允许简化图像处理,从而使用户能够处理具有单个或多个细胞的图像中约1分钟。此外,这些细胞既可以活的或“固定”。

该MechProfiler软件能够通过靠质量商业micropost阵列的再现性,大大提高了数据吞吐量分析,更具体地,默认“非偏转“的阵列中的每个交位置可以推定针对理想格(制造偏差为网格在用于该研究的阵列均小于100纳米)。

在短的一个打开选择的用于分析的图像文件,它们作物到感兴趣的区域中,定义覆盖细胞的职位或需要被丢弃,确定后的位置,计算该挠度/对理想格力,最后节省出口有可能所有的细胞特异性的数据,其中包括一个标准的办公电子表格。

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Protocol

在Micropost阵列1.培养细胞

注意:所有步骤必须在生物安全柜中进行,以确保无菌。这里给出的容积为T25细胞培养瓶。细胞培养基配方和细胞接种密度为骨癌细胞系HuO9和M132优化。

  1. 准备播种的细胞培养到micropost阵列。
    1. 通过将培养瓶在标准光学显微镜下检查细胞培养质量。确保细胞显示出典型的生长和形态通过估计如何培养瓶底部的许多被覆盖。 70%-80%A覆盖率反映了健康的增长速度。因为它们代表死细胞和/或一个杂草丛生培养注意漂浮细胞的量。
    2. Trypsinize细胞通过除去介质和洗涤用4ml 1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中。添加0.8 ml的1×胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)和在室温下孵育,直到电池小号打跑,大约需要2-4分钟。检查过程与显微镜,偶尔挖掘瓶轻轻地支持撞出。
    3. 加入5 ml的细胞培养液(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/ F12,用10%胎牛血清(FBS),1%青霉素/链霉(青霉素/链霉素)),使反应停止,并以洗掉残留细胞仍然坐在瓶的底部。接着吸取此悬浮上下数次以获得均匀的混合物。一定要吸取横跨烧瓶的原始生长区域中的所有解决方案以获得一个有效的松脱。
    4. 在细胞悬液转移到15毫升管中,用台式离心机以0.5×g离心3分钟离心它。
    5. 除去上清液并且通过移液器上下吹吸5次再悬浮在5ml培养基中的细胞沉淀。请一定要避免泡沫的产生,而这样做。
    6. 通过使用细胞计数室和一个光microsco确定细胞密度PE。检查细胞聚集体的细胞悬浮液中细胞计数室和确保仅具有单个细胞用于后续实验。吸管再次上下数次,如果细胞倾向于形成聚集体将它们分开。
    7. 稀释细胞悬浮液以足够的介质获得的25000个细胞/ ml的细胞液。颠倒封闭管数次拌匀。
  2. 准备micropost阵列细胞种植。
    关键注意:不要吸取到micropost阵列直接,因为这可能会损害microposts,尤其是当不想要的泡沫进行了介绍。此外,请确保micropost阵列永不干涸的发生毛细作用力导致崩溃的microposts的。
    1. 放置与micropost阵列玻璃衬底面朝上在12孔板的孔中通过使用一对镊子的,并通过添加1毫升乙醇中(99%)湿它。在室温下孵育20-30秒。
    2. 稀释乙醇逐步通过在井侧加入约1毫升无菌去离子水(DI水)和吸移用移液管或抽吸设备大致1毫升重复此步骤,至少3次。
    3. 通过添加和吸移约1 ml的取代离子水用PBS缓冲液中相同的方式。重复此步骤3次。
    4. 通过添加和吸约为1毫升培养基替换PBS缓冲带中。重复此步骤3次。
  3. 在每个制备的micropost阵列的顶端吸移管1 ml的细胞液(25,000个细胞)。靠近多孔板,并将其转移到恒温箱(CO 2 5%,37℃)。让细胞粘附和生长在microposts为6-7小时之上。
  4. 通过使用光显微镜偶尔检查的粘附过程。检查大部分细胞出现全面铺开多个microposts。

2.固定和染色细胞

注意:所有的步骤,并这里给出容积为12孔板的单个孔。建议处理不多十二井超过四个在一个时间,以避免一个晒出孔中的任何液体,这将导致在microposts的崩溃后吸出。

  1. 从井抽吸介质和洗涤细胞2×1毫升的PBS缓冲液。确保使用温和的力量,同时用PBS洗涤以去除累积的孵化过程中micropost阵列上的细胞碎片和分离死细胞。
  2. 固定细胞以5分钟0.5 ml的3.7%缓冲的甲醛溶液。
  3. 通过洗涤micropost阵列2×1毫升无菌DI水代替甲醛溶液。
  4. 染色(在50%的水,40%乙醇和10%乙酸0.05%考马斯亮蓝)将细胞与染料为约90秒。洗净多余染色液过2次用1毫升无菌去离子水。加入1毫升去离子水至micropost阵列。
  5. 使用光学显微镜检查染色的结果。重复吨HE染色步骤,如果单元格的身体太微弱待观察。
  6. 商店micropost阵列染色细胞之上的冰箱中在4℃下。确保让他们在水下时刻。

3.细胞成像

注:第4步仅适用于显微镜没有无限校正光学系统。

  1. 加2ml去离子水至培养皿用薄玻璃底,高分辨率成像。
  2. 用一对镊子到成像盘与microposts朝上传送micropost阵列。
  3. 放置在成像培养皿上的光学显微镜的可移动的阶段。
  4. 转用于成像的透镜的补偿环,直到在标尺上的数字表示沿着光路的所有材料的总厚度,以补偿在玻璃基板上,有机硅弹性体和顶部的液体的折射率的不匹配。这将导致一个明亮的外观的microposts的核心。
  5. 关闭光圈在照明侧下降到50%,并从光路在允许一个普通明视场模式除去任何相衬环。
  6. 对齐micropost阵列的microposts形成一条水平线的观察视野。确定起点( 左上角),移动培养皿逐步在舞台上扫描micropost阵列同时服用大量的图像。
  7. 以最高的分辨率设置使用20X或40X的目标相机中的所有图像。希望能发展为在图像的中心的单细胞。
  8. 通过基板沿z轴扫直到micropost提示是聚焦。使用显微镜的微调调焦轮,使之朝着注重micropost底部约2-3微米。
  9. 通过采取一系列一个阵列部通过摄像参数之一清扫测试图像在一个时间(建立标准成像过程例如,曝光时间,光圈设置,灯设置等)。与MechProfiler分析图像并确定一个快速和可靠的分析的合适的参数组。

与开放源代码软件“MechProfiler”4.图像分析

注意:所有软件功能可与使用鼠标左键指点设备被激活。然而,受过训练的操作将使用设计为在键盘上,以使一个有效的两手的图像处理的左半边的记录快捷键。

  1. 启动图像分析软件MechProfiler并打开一个范围,需要通过点击“打开”被分析的图像。
  2. 将所有参数到由软件开发商提供的“设置”部分。确定必须根据由软件手册中详细描述的程序进行自定义配置轮廓阈值和最小距离)的参数。
  3. 分析图像■一个接一个通过使用“剪裁”他们种植到感兴趣的区域(单击并拖动鼠标按钮按下)。双击绘制的矩形内完成这个动作。
  4. 通过点击“画细胞轮廓”,使用十字光标绘制包括细胞附着到所有microposts标记每个可见细胞轮廓一个接酮。
  5. 通过点击“放弃帖子”放弃任何不必要的microposts并使用十字光标绘制。括属于一个单元的图象部分以外的或者被偏转因其他理由而不是由所关注的小区中的所有microposts。
  6. 启动软件子程序“查找质心”通过鼠标点击。调整过滤器设置旁边的“查找质心”按钮,直到所有microposts注册,这是可见的红叉的中心。如果过滤器的设置过低microposts将被忽略,如果它太高亩ltiple职位将被标记为一个单一的micropost。保持过滤器的分析会话期间设置不变。
  7. 使用手动编辑功能“手动编辑”的质心与多个或遗漏micropost位置。使用鼠标十字通过单击并拖动整个选择有问题的micropost。双击矩形内,并将丢失的红色标记放大的图像部分,它会自动关闭研究。放弃这样的micropost如果是绘制细胞外轮廓(见步骤4.5),然后再继续。
  8. 找到理想的micropost电网用鼠标点击激活“生成网格”功能。确保位置对应的真实micropost头,用蓝色圈所示,绘制细胞轮廓内。
  9. 更正其中使用相应的“曼努埃尔编辑”功能,用鼠标点击所需要的细胞区域内的任何错位的电网设施。使用十字来选择曲的micropostestion通过点击和拖动它跨越。双击出现的矩形内,并将丢失的蓝色标记的放大图像部分,它会自动关闭研究。
  10. 使用按钮“计算挠度”通过鼠标点击来获得基于所述图像段中的micropost的位置和产生的理想电网之间的差计算出的偏转值的直方图。
  11. 保存完整的分析,包括价值观,通过鼠标点击“保存”的表。
  12. 通过点击“重置视图”和分析“下一步形象”,它可以方便地使用正确的键盘光标键来完成另一个图像部分或鼠标点击继续图像分析。

5.数据分析 - Mechanoprofiling

  1. 从与所分析的图像文件夹中的Office电子表格程序打开文件“results.xls”。它包含了人的数据计算L值,包括所有micropost偏转和标准衍生的措施,如工作( 基底变形能量)的分析单元。

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Representative Results

所描述的技术的主要优点在于它的简单性和潜在的快速和有效地纳入常规实验室工作。搭配开源软件的高品质的商业传感器阵列的组合提供了否则将需要获得洁净室设施和深入的图像分析和软件开发知识机械力敏感的信息。 图1说明了该方法的工作流程。它开始准备和种子细胞到micropost阵列。固定和染色细胞后的micropost阵列准备成像。该技术的核心部分是一个使用MechProfiler软件的图像分析。用户可以输入的所有相关参数中的GUI的“设置”之后立即开始analyszng图像。相应的像素大小是受单个像素表示,并且依赖于用户的设备时的长度。它需要可以通过取物体的图像与已知的大小分别建立对于每个使用的放大倍数。给出一个例子在补充图9。

图像质量是一个关键因素,因为它强烈地影响分析过程。为了实现一应该确保有稳定的和例行维修成像平台如图2中特定的最高质量,光源的对准是重要的,因为未对准将导致不需要的阴影分析时可能是有问题图像。此外,放置在光学显微镜顶上抗振动台或板,有利于在大多数实验室成像期间,因为它提供了额外的稳定性。

使用薄的玻璃底培养皿用于成像的优点包括转换为具有增加的分辨率更明亮的图像更高的有效数值孔径值。

当塔基纳克在明视场模式下,图像的50%,封闭式光圈建议,作为专注于microposts提示便于由于出现一个清晰的暗环的周长。此外,在的情况下使用的目标有一个补偿环,必须正确地设置它来实现准确的力读数。该功能的影响,可以通过比较图3A图3B可以看出。可以快速分析通过用最佳照明相结合的补偿环的正确设置如图3C实现图像。一个micropost及其周边之间的对比强烈减少分析时间,因为它加快了搜索算法。用户会发现,实现可容易地分析图像只有很少经验是必需的。

重要的是,上面的协议克服的关键,共同的障碍快速有效地整合micropost阵列成常规实验室的工作。这一障碍源于需要控制阵列质量 - 一个要求,即是可以实现仅通过传感器再现性,灵敏度,准确性和深入细致的实验表征。然而,通过转向市售micropost阵列这个相当大的障碍是完全可以避免的。 图4A和4B示出了这样一个micropost阵列的准确性。所述microposts位置的偏差是远低于200nm并且与伴随相机/目标​​组合,导致82毫微米的使用的设定的像素大小“像素误差”这样媲美。与细胞偏转microposts图像的分析表明,对于细胞强加偏转的值基本上高于200纳米( 如图4C和图4D),从而导致一个舒适的信噪比。

图5 illustratES的不同外观的microposts图像中视是否被偏转与否。正如上面提到的非偏转microposts有一个光明的圆形的外观与周围黑暗的环。它们的位置可以利用Hough变换,这对于数字图像分析的特征提取技术来确定。

此外,它表明,在一个倒置显微镜偏转microposts显示两个面对黑暗的半月形状( 见图5A)。在直立显微镜micropost尖端和一个暗半月型的边缘是正确可见而第二个则难以检测。这些特征的基础,从偏转microposts,它已经开发了这一协议,被命名为“轮廓接近”计算的技巧明场显微镜图像的位置。

图5B是一个HuO9骨癌的一例细胞上microposts成像在倒置显微镜(顶部)。该图像的分析版本显示从所施加的轮廓的方法(底部)。使用相同micropost阵列直立显微镜(顶部) 图5C取的结果。再次被分析的版本显示了使用轮廓的方法的结果。

每一个图像分析会议,由参数的用户验证MechProfiler的“设置”部分中开始。有些是像micropost阵列尺寸和弹簧常数的micropost制造商提供。其他由用户定义的诸如用于轮廓阈值和根据在软件手册详细程序的最小偏转阙值的值。然而,值得注意的是,这些值应慎重选择,必须是恒定的所有图像相互关联的图像中,以保证可比性是很重要的。而对于图像analysi预处理步骤S,像裁剪,是自我解释像“寻找质心”,软件功能“生成网格”和“轮廓接近”需要更详细的解释的基本策略。

检测算法的默认micropost位置(作为递送由生产)将开始通过使用“查找矩心”软件的功能。该算法开始于图像搜索第一micropost的左上角。随后所有其他microposts是基于第一micropost的坐标加上用于通过以下的六角形几何的制造商提供的网格和micropost大小的值中找到。质心对于​​每个找到micropost是使用霍夫变换来计算。旁边的GUI的命令按钮滤波器滑块允许调整这一转变的灵敏度。所有发现microposts标有红十字会和他们的立场指出,苏bsequent流程。

其次,“生成网格”功能导致的所有microposts提示的坐标。它们是从一个多步骤的过程的结果。一是优化功能,解决包括从先前执行的“查找重心”算法的初始位置,以建立理想的网格。第二小区区域内的microposts的位置被计算出来。在设置参数“最小偏转门槛”相对理想的电网比规定少偏转Microposts处理与休转变。所有其他micropost尖端位置通过对偏转microposts上述轮廓的方法计算。这里的软件开始从初始质心远离小区中心的圆形边缘(亮到暗)的15°的角度范围内搜索(参见图5A)。一旦边缘找到具有给定micropost直径的圆被装配到t使用从在GUI的设置轮廓阈值帽边缘。该参数确定哪个像素的灰度值被用于拟合过程。较高的值拟合倾斜朝亮micropost中心越低的价值越适合这个圈子,以较深的micropost轮廓。一旦选择了该值应保持不变对于给定的研究中所有的图像分析,以避免增加人为的偏差或致电变形过于保守。

例如, 图6示出决定一个适当的轮廓阈值的重要性。该软件允许用户选择用于各种(0.1〜0.9),以涵盖所​​有物理上可能的照明的情况。该光学信息转换为给定的两个极端和在中间有一个更实际的值的偏转距离的翻译给出图6B中。然而,训练有素的软件的用户经常convergE要非常相似轮廓的阈值,从而导致可比较的结果在图6C中可以看出。此外,使用标准化程序细胞染色和成像最小化无效轮廓的阈值,其通常应该保持恒定内为相关图像集的风险。

为了证明该方法的鲁棒性的选择机械性分析结果的总结在图7。在图7A中的两个结果从骨癌细胞HuO9和两个从M132进行了比较。所有四个阵列是来自同一生产批次,因此具有相同的机械性能。用一组固定的参数为最小偏转(0.25微米)和轮廓的阈值(0.125)进行的分析。此外,两个相同的集从SAOS 2骨癌图像分别给予两个分析师未经有关参数设置 (参见图7进一步的信息B)。上分析染色的影响通过取随后的染料除去染色用考马斯蓝R。骨癌细胞的图像进行测试。后重新染色用考马斯蓝G的第二组图像被采取。 图7C示出的结果来自两个系列,这是由具有相同值的最小偏转(0.25微米)同一用户分析和轮廓的阈值(0.25) 。

施加机械性剖面的一个典型的例子在图8A中 ,其中,所述编译的数据被分析151细胞从各四个阵列的汇集后呈现为骨癌细胞系HuO9和M132。在此概述所有的指标值是HuO9高于为M132已经表明HuO9细胞施加更大的力比M132。然而,从图像分析的数据包含大量的附加的单细胞的信息可开采,以更好地理解啉一个给定行内otypic细胞系的行为和细胞至细胞的变异性。通过演示结果,每micropost力在箱形图可以发现,尽管类似的最小值和最大值,数据值是不同的分布确实低转移性细胞系HuO9细胞倾向于施加更大的力大于高转移M132线( 见图8B)。此外,通过相对于该小区区域归类的力值之一发现每个细胞的平均力不仅升高为HuO9细胞相比M132还以为每micropost增加平均力作为细胞扩散,直到每交达到平均力更稳定的值( 在图8C中可以看到)。此外对于细胞包括七个microposts的值几乎相同,这可能是由于它们通常出现在六边形形状与一个中央这一事实非偏转micropost独立于它们的细胞系。除了差异erences在收缩,形态差异是可以量化有趣的结果。例如,在对比的是高转移性M132细胞很少有HuO9细胞覆盖的只有三个microposts。的细胞系之间的其他形态可以用比较的,包括由覆盖microposts的数来表示单元面积的分布8D示出了两种细胞系上microposts的顶部生长时也不同动态传播行为。总之,mechanoprofile对于亲代细胞系HuO9表明,它们通常覆盖更大的面积,并应用略微更大的力到microposts而转移性细胞系M132,派生自HuO9侵略性细胞,特征涵盖更少microposts并适用每micropost较小的力。这些结果表明的TFM基础的方法歧视性应用的潜力。

图1实验工作。(一)整体过程包含从micropost阵列上的种子细胞来分析其力学性能连续五个主要步骤。与描述MechProfiler软件(B)的图像分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.成像设置,一个标准倒置显微镜,用于在micropost阵列成像单元。设置还包含一个显微摄像机及其控制器,其也可以提供数据存储功能。显示大屏幕不是必需的,但仍然是便于扩展的成像会话。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.导则micropost成像。染色细胞与40X镜头在明亮的视场模式下拍摄的micropost阵列上的(A)图片 。拍摄时,非偏转microposts出现黑眼圈。偏转的职位承担椭圆形既黑暗和光明的子区域。染色细胞覆盖microposts使他们显得更黑到如此地步,有micropost和细胞之间的反差。调整透镜补偿环并重新聚焦后拍摄(B)中相同的图像。这里microposts的芯成为实质上更明亮,给予更多的对比度。 ( 三)adjus后再次拍摄同一位置廷所有照明参数与相机控制器。可自由站立microposts出现明亮的圈子与暗环。偏转microposts显示出独特的半月形的“影子”围绕沿拉动轴的弯曲核心。 请点击此处查看该图的放大版本。>

图4
图4.分析microposts的MechProfiler截图。(A)一个空的典型例子 micropost阵列可以看出,在这个屏幕截图。所述microposts排列成恒定六边形图案。 (B)中与这些microposts偏转值的直方图显示的所有值都是在200nm以下。 (C)的典型例子为HuO9骨癌细胞覆盖拉多microposts。由此可以看出,牵引量为多相的。 ( 四)与该HuO9细胞偏转值柱状图表示偏转的广泛认为源于细胞“与micropost底物相互作用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5. Micropost出现在明场照明和图像中计算自己的位置的策略。(一)非偏转microposts显示为带黑色外圈明亮的圆形区域。质心是由一个霍夫变换来计算。偏转microposts显示暗半月形的形状。根据显微镜装置,如果microposts面临的二极管灯牛逼源( 例如,倒置显微镜),有两个清晰可见的半月形状。如果microposts面对透镜例如直立式显微镜)只有一个半月是清晰可见而且尖的边缘。在这两种情况下的轮廓的方法应该是用来计算micropost小费。使用倒置显微镜从HuO9骨癌细胞并用轮廓的方法分析其版本(底部)(B)中的原图像(顶部)。 (C)使用的直立显微镜和分析版本,再次施加轮廓的方法(底部)相同micropost阵列(顶部)原始图像,但具有低得多的轮廓阈值更适合于调用暗环形边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图6.轮廓的方法,选择合适的阈值。(A)这三个截图说明了使用三个不同轮廓的阈值相同的分析microposts。如果该值被设置要么太低(左)或太高(右)比软件拟合表示micropost头不正确的蓝色环。它低估或过冲的micropost头的实际位置。一个正确的选择的阈值,使软件适应的蓝色戒指的半月形暗区,形成通过偏转micropost内。 二)该图显示偏转依赖于上面显示的microposts所选择的轮廓阈值的平均金额。它还说明,对于细胞外轮廓的microposts的值不会受到影响,因为该轮廓拟合不施加在那里。 ( 三)该图说明了选择中等间隔内的阈值minimalizes的过度或低估micropost挠度的风险。由不同的经过培训的用户选择的值之间的差值通常比0.05,这导致平均偏差值可以接受的差异更小。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
图7.稳健性检验从不同的骨肿瘤细胞系机械性的分析结果;误差棒代表一个标准偏差(A)机械力分析的阵列1和M132的阵列3播种HuO9细胞后,从四个相同micropost阵列结果-四天后阵列4(B)上播种HuO9在阵列2和M132从米的结果的比较echano-分析基于相同的图像集由两个独立的分析师的分析之后。图像分析结果(C)的比较,从两个不同的图像序列与考马斯亮蓝R和彻底清除染料和再染色考马斯亮蓝G.之后的第二染色后第一个采取请点击此处查看该图的放大版本。 。>

图8
图8.机械一仿形骨癌细胞系的(A)中的两个骨癌细胞系HuO9之间的比较(低转移潜能)和M132(高转移性)图显示,所有指示器值对于HuO9细胞系更高(总N = 302;实验两组独立,误差线=标准差)。 (B 仲>)的箱形图说明了每micropost施加的力处于较低的纳米牛顿范围。然而,HuO9细胞比M132细胞(威威表示数据的最小值和最大值)拉更多。 (C)上形成类似的结果可以通过比较细胞覆盖microposts相同数量可以看出。 HuO9细胞施加超过M132细胞更多的力量。 HuO9细胞覆盖3 microposts的数目并不代表,仅出于完整性(误差棒=标准差)。 ( 四)在整个覆盖microposts的号码不同分布表明,与micropost阵列进行交互时,每个骨癌细胞系都有自己的传播特点。 请点击此处查看该图的放大版本。

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补充图9.像素大小的显微镜装置通常使用上有一个比例尺一个特殊的显微镜载玻片确定;备选地,micropost阵列布局,由制造商提供可以使用,例如 ,15个单位与13微米(195微米的总长度)由2,375像素(带图像处理工具建立)划分导致了0.082微米/ PXL。 请点击这里查看该图的放大版本。

补充图10
补充图从上使用倒置显微镜两个照明技术相同的位置截取的HuO9骨癌细胞的图像10的比较;迪欧染microposts的绿色荧光。(A 明视场模式。 二)分析切换到绿色荧光通道 ,我的法师拍摄 无需重新调整。   (C)的校正后的聚焦到非常micropost提示第二荧光图像。两个照明通道的(D)覆盖 仅用于说明的目的。   (E)机械一分析指标从三个图像结果。尽管修正完全偏转不能从荧光图像估计的焦点。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图11
补充网络使用的DiI对正置显微镜荧光染色microposts相同的位置(A)亮场图像古尔11. 图像序列。有三个microposts相互接触在尖端。 (B)切换到荧光通道略高于microposts的头上后相同的位置。 ( 三)降低焦平面到microposts的最顶端。 (DE)后,进一步降低对microposts“底部的焦平面逐步连续的图像。 ( 六)降低焦平面的有机硅弹性体基板内后microposts的形象。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图12 补充图12.截图MechProfiler图形用户界面。从配置的是HuO9骨癌细胞典型的分析结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这项工作旨在通过大幅降低技术和实用的准入门槛,以推进牵引力显微镜领域。这些障碍来自两个方面。首先是必须克服可重复地制造和实验委托micropost阵列的许多非平凡的技术挑战。第二,是同样的非平凡需要单个细胞的力的可靠半自动分析 - 牢记典型的实验中,可能需要几百甚至几千个细胞的分析。上述技术被开发,以使不具有驻地工程专门细胞生物学实验室内micropost基于牵引力显微镜访问。在这篇文章中提出的传感器和分析技术应该允许非专家随时准确地分析由单细胞施加的力量。

除了访问细胞生物学升从头与至少一个中间级亮场显微镜,所描述的方法需要一些额外的技术要素。这里大多数用户可以使用,即使有限的经验进行有效的牵拉力显微镜实验,尽管该技术的性能和多功能性。然而有在必须考虑所提出的协议三个重要方面。首先,它是必要的,以确保micropost阵列总是覆盖着液体,以避免它们的塌陷,由于毛细管力。第二个需要优化成像参数为后天micropost图像,这是最好的,采取相同的阵列位置的图像系列,同时改变曝光时间,光圈孔径,而补偿环位置完成。找到用于micropost尖端正确焦平面是很重要的,这方面确实需要给出的传感器阵列的小三维深度一定的经验。第三个必须下载开放获取的图像分析软件MechProfiler discusse这里d,连续而详细的用户手册和培训的例子可在下载站点​​。后使用软件来分析设有手动例子一些经验,用户应采取要使用在成像设置测试图像以便配置合适的显微镜设置。基于所获得的图像时,轮廓阈值应同样优化。单个micropost图像可以通过使用开源MechProfiler软件不管它是否包含一个或多个小区在一分钟内经过培训的用户进行分析,从而允许在几个小时内的统计学相关结果(几百细胞的分析)的代。

需要一些调整另一个方面是任何施加的细胞染色过程的优化。当细胞被过度染色的软件可能无法注册正确micropost位置。另一方面,如果染色太微弱它需要由用户更多的努力来检测“真正的”细胞轮廓薄细胞突起可以错过。

但是,通过将细胞染色和阵列成像过程的固定协议,此错误的范围变得可接受的低水平。在这项工作中不同的细胞染色方法进行了测试,是根据不同浓度的结晶紫,像吐温20或Triton-X或染料的加入曙红的组合的表面活性剂的存在。然而,染色强度以及从实验基本上改变其稳定性进行试验。仅如上述的使用亮蓝G显示出可接受的细胞染色鲁棒性结合足够强度仍看到薄细胞轮廓,但不与发达轮廓途径干扰。

在一般情况下,有选择修改所呈现的技术。例如通过组合在此提出的荧光显微镜染色细胞器亮场技术像细胞核或肌动蛋白丝的网络,它可以提供有关细胞力学的上下文底层细胞过程的其他信息。此外,使用长链烷基carboxycyanines(DII或DIO)的microposts成为荧光14虽然如此,它控制从所呈现的技术的每个偏差是重要的。补充图10和图11说明了潜在的隐患。使用倒置显微镜的绿色荧光通道( 图10B和10C)采取了考马斯亮蓝G染色NIH 3T3成纤维细胞图像目前主要micropost机构,但不是他们的提示,导致一个错误的位置分析 (图10E)。尽管从明视场模式图10A)的micropost提示无法进行成像,这可能是由于通过细胞染色的荧光信号的吸收切换后重新调整的最佳努力。这是相对于伊马与正置显微镜( 图11B-11F)的黄色荧光通道采取水电站,其中多个清晰的图像可以沿Z轴获得。这里,用户需要确保图像拍摄与焦平面在最前端11C),而不是某个地方更靠近micropost底部,以避免错误的主叫偏转值。

应当指出的是,也有用于micropost测定技术的限制。例如,检测到的偏转的精确度取决于光学装置的质量。显微镜通常用于荧光成像,其中所连接的照相机的感光度具有更高的优先级比大量象素的优化。当然,这将导致具有更大的像素大小的图像。此外,应该指出的是,亮场图像无法确定是否细胞突起到达衬底底部。然而,商业micropost阵列是使用激光共聚焦测试显微镜。结果发现,细胞似乎接受二进制涂层促进只粘附在micropost提示和不为micropost阵列的其余部分。另一个因素源自micropost阵列,这已被证明是0.2微米的位置误差。连同2.8 NN个/μm给定的弹簧常数这导致力读出的0.6 NN错误。对于micropost测定另一个约束来自于下列事实,从由多个小区共享microposts施加的力不能确定。因此,只有分离的单细胞进行分析。对于所提出的协议的具体限制源自正确的应用程序的敏感轮廓的方法,这需要以获得可靠的结果一定量的用于用户训练。此外,对于一个更快的分析,用户应采取的图像,其中所述micropost阵列被对准,从而形成水平或沿着观测场边缘的垂直线。 DespitE中的事实,即对于六边形网格几何形状内找到microposts软件算法不是由一个旋转角度限制microposts的摄像大于5°离轴使得难以裁剪到图像部分不含有不完全microposts,然后动态以“生成网格”功能的一个失败。在这种情况下,用户可以在开始分析micropost位置之前使用集成的旋转功能。

所描述的方法主要适用于表征两个骨癌细胞系中,派生高转移线计价M132名为HuO9一个亲代细胞系,和。在此背景下六百单细胞图像拍摄于明视场模式,并使用MechProfiler软件进行分析。随后的数据挖掘显示,亲代细胞系HuO9施加略微更大的力和通常涵盖每单元多microposts比从转移性细胞系M132细胞。然而,细胞在定影的时刻,这可能促进了范围广泛的结果不同步,因此,在细胞周期的不同阶段。通过利用活细胞图像在长达24小时的时间内,人们发现,蔓延后许多细胞保持其初始位置,而其他迁移,扩散,断开并以不同的速度(见补充视频)再次迁移。这表明细胞的机械轮廓是经常不是恒定的,可以在整个细胞群体或甚至在根据其当前活动单个小区有很大变化。另一个因素可能是一个micropost阵列的细胞被强制执行离散迁移步骤,以达到另一个micropost,这是相对于传统的TFM,其中小区粘附平坦表面,并且可以与步骤分钟迁移上。但是,为了分析这些小步骤,有必要采取的粘着点的荧光图像,其需要访问非常先进的米icroscopes和高度复杂的图像分析软件。尽管如此,机械型材较大人群中的分布仍然经常细胞系的显着特征。因此,一个高通量方法,其能够大量细胞的表征是必不可少的。这里介绍的手工成像过程和开放存取软件扩展到全自动显微镜系统怀有很大的潜力。

总之强大牵引力显微镜方法,提出这是在一个标准的细胞生物学实验室容易可采用。从细胞接种的整个工作流程,以图像分析是简单而有效。而这里所述的协议是全功能的,改进正在进行适应分析算法,以便能够同时处理micropost阵列正交布局和显影过程,可以简化从活细胞成像的图像序列的分析。在上下文的结果骨癌芯锂未列名,这里所描述的方法可用于筛选细胞从临床活检组织,以便建立这样的测定是否可持有的预后价值,使临床医生预测活检细胞从骨的癌症患者的转移潜能。这样的测定将影响治疗策略。其他潜在应用涉及测试药物活性化合物上机械活性细胞如平滑肌细胞或心肌细胞,有可能以协助建立一个药物功效或毒性。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T25 cell culture flasks Nunc 156367
1x PBS-buffer Sigma D8537
0.5% Trypsin-EDTA Life Technologies 15400054
Medium DMEM/F12 Sigma D8437
FBS South America Life Technologies 10270106
Penicillin-Streptomycin 100x Sigma P4333
15 ml centrifuge vials Sarstedt 62.554.502 
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin MicroDuits MPA-col1/FN Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A. Merck 100.983
12-well plate Nunc 150628
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma HT5011
Brilliant Blue G-250 Sigma 27815 Coomassie blue
Methanol ACS p.A. Merck 1.06009
Acetic acid Sigma 695092
Glass bottom dish WillCo Wells BV GWSb-3522 35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse Nikon n/a Inverted microscope
D3-L3 Nikon n/a Camera controler
DS Fi2 Nikon Camera

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References

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