Tredimensionell avbildning och analys av mitokondrier inom mänskliga Intraepidermal nervfibrer

Neuroscience

GE Global Research must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Detta protokoll använder tredimensionella (3D) imaging och analystekniker för att visualisera och kvantifiera nerv-specifika mitokondrier. Teknikerna som är tillämpliga på andra situationer där en fluorescerande signalen används för att isolera en delmängd av data från en annan fluorescerande signal.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Målet med detta protokoll är att studera mitokondrierna inom intraepidermal nervfibrer. Därför utvecklades 3D imaging och analystekniker för att isolera nerv-specifika mitokondrier och utvärdera sjukdom-inducerad förändringar av mitokondrier i den distala spetsen på sensoriska nerver. Protokollet kombinerar fluorescens immunohistokemi, konfokalmikroskopi och 3D-bild analystekniker för att visualisera och kvantifiera nerv-specifika mitokondrier. Detaljerade parametrar definieras i hela förfarandena för att ge ett konkret exempel på hur du använder dessa tekniker för att isolera nerv-specifika mitokondrier. Antikroppar användes att märka nerv och mitokondrie signaler inom vävnadssnitt hud punch biopsier, som följdes av indirekt immunofluorescens att visualisera nerver och mitokondrier med gröna och röda fluorescerande signal respektive. Z-serie bilder förvärvades med konfokalmikroskopi och 3D analysprogramvara användes för att bearbeta och analysera signalerna. Det är inte nödvändigt att följa de exakta parametrar beskrivs inom, men det är viktigt att vara konsekvent med de valt under färgningen, förvärv och analys steg. Styrkan i detta protokoll är att den är tillämplig på en mängd olika omständigheter där en fluorescerande signalen används för att isolera andra signaler som annars skulle vara omöjligt att studera ensam.

Introduction

Mitokondrier tjänar vitala cellulära funktioner som inkluderar producera cell energi, buffrande kalcium, och reglerar nekrotisk och apoptotiska cell death1,2,3. Nervsystemet har en hög ämnesomsättning jämfört med kroppen4 tyder på att nervceller genererar en hög grad av cellulär energi i form av adenosintrifosfat (ATP) genom mitokondriell respiration. En hel del bevis dokument att neuronala funktioner är beroende av ATP5, särskilt på de synapser6. Fördelningen av mitokondrier inom nervceller är därför viktigt.

Under de senaste 10 åren en hel del information har visat att människohandel och dockning av neuronala mitokondrier är hårt reglerad. Motorproteiner är involverade i Distribuera mitokondrier till specifika cellulära fack i hela neuron. Handel med mitokondrier är särskilt viktigt eftersom nervceller project axoner och dendriter långt borta från soma. Kinesin motorproteiner direkt främst anterograd (bort från soma) människohandel mitokondrier längs mikrotubuli medan dynein motorproteiner direkt retrograd (mot soma) motilitet7,8,9 , 10. finns det cellulära signaler sådan mitokondriella membranpotential och impuls överledning som påverkar närvaro och riktning av mitokondriell människohandel11,12,13.

Förutom transport av mitokondrier, finns det specialiserade proteiner att lokalisera mitokondrier till specifika cellulära fack som har hög energi krav, såsom noder av Ranvier och synapser8,14, 17. I själva verket flesta av mitokondrier inom axoner är icke-rörliga9,13,18. Specialiserade proteiner som syntaphilin ankare mitokondrier till mikrotubuli längs axoner medan andra proteiner förankra mitokondrier till aktin cytoskelettet1921. Tillväxtfaktorer och joner såsom kalcium har rapporterats att stödja upphörandet av mitokondrier rörelse att lokalisera dem till regioner där de är nödvändiga21,22,23.

Sammantaget är den människohandel och för av mitokondrier avgörande för korrekt funktion av nervceller. Till stöd för detta, har störningar i mitokondriell människohandel förknippats med flera neurologiska sjukdomar inklusive ALS, Huntingtons sjukdom, Charcot-Marie-Tooth sjukdom, Alzheimers sjukdom, hereditär spastisk parapares och Optikusatrofi15,24,25,26,27. Nyligen genomförda studier har fokuserat på mitokondriell dysfunktion och patologi som potentiella mekanism för diabetisk neuropati, det sensoriskt bortfall som förknippas med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen är att diabetes förändrar fördelningen av mitokondrier inom sensoriska projektionerna av kutan nervänden. Därför utvecklades en teknik för att visualisera och kvantifiera mitokondrier inom intraepidermal nervfibrerna (IENFs), distala spetsarna av dorsalrotsganglier ganglion sensoriska afferenter. Tekniken kombinerar fluorescens immunohistokemi av specifika mitokondrie och nerv fiber etiketter med konfokalmikroskopi z-serie förvärv av signaler med kraftfulla 3D-bild analys programvara att mäta fördelningen av nerv-specifika mitokondrier från mänskliga kutan punch biopsier att uppnå detta mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hud punch biopsier erhölls från ämnen som rekryterades från ett stort community-baserade primärvården nätverk vid University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denna studie godkändes av University of Michigan institutionella granskning styrelsen och följt grundsatserna i Helsingforsdeklarationen. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje ämne före provning.

1. fluorescens immunohistokemi

  1. förbereda punch biopsier för intraepidermal nerv fiber immunhistokemi:
    1. utför 3 mm huden biopsier av medicinsk personal och placera hela biopsi i 1,5 mL Zamboni ' s fixativ lösning (2% paraformaldehyd, 0,3% mättade pikrinsyra i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4) vid 4 ° C över natten.
    2. Skölj prover med en lösning av 30% sackaros i PBS vid 4 ° C i 16-24 h eller tills provet sjunker.
    3. Embed prover i optimal skärtemperatur förening (ULT) med hjälp av en cryomold. Hela 3 mm biopsi med epidermis nedåt i formen och Fyll formen med cirka 2 mL OCT. frysa mögel på krossade torr-is. Förvaras vid-80 ° C tills den ska användas.
    4. Skär 50 µm tjock tvärsnitt med en kryostat och lagra i enskilda brunnar i en plattan med 96 brunnar med 180 µL frostskyddsvätska lagringslösning per brunn (30% etylenglykol, 30% glycerol i PBS). Följande anvisningar är för 8 brunnar 96 väl platta. Fläcken sektioner från varje biopsi webbplats som är 200-300 µm ifrån varandra.

dag 1:

  1. släcka icke-specifik märkning av hornlagret:
    1. plattan med etiketten 96 brunnar som visas i figur 1.
    2. Pipettera 150 µL lager signal förstärkare lösning att minska ospecifik bindning av sekundära antikroppar 34 , 35 i varje brunn. Överför sektioner till signal förstärkare lösning med en inoculating loop.
      Obs: ta hand medan du arbetar med vävnaden att undvika skada eller riva vävnadssnitt. Hålla i signal enhancer lösning under 30 minuter i rumstemperatur på en platt rocker.
    3. Förbered skölj brunnar i raderna 2 och 3 i plattan med 96 brunnar genom att lägga till 150 µL av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i varje brunn.
    4. Noggrant överföra avsnitt i rad 2 och skölj i 1 x PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
    5. Skölj en andra gång i 1 x PBS under 10 minuter vid rumstemperatur (rad 3).
  2. Förbereda 5% bovint serumalbumin (BSA) blockerar lösningen:
    1. förbereda 5% blockering lösning som innehåller 5% BSA och 0,3% Triton X 100 (TX-100) i 0,1 M PBS (se tabell 1) medan sektioner inkubation i signalera enhancer lösning. BSA går inte till lösning enkelt. Vortex lösning tills BSA helt löses upp.
    2. Förbereda blockerande brunnar i rad 4 i plattan med 96 brunnar genom att lägga till 150 µL av 5% BSA blockerar lösningen i varje brunn.
    3. Överföra sektioner i enskilda brunnar i 5% BSA blockerar lösning och inkubera sektioner i 5% BSA blockerar lösning för 1-2 h i rumstemperatur på en platt rocker.
  3. Förbereda 1% BSA sköljning lösning och utspädning av primära antikroppar:
    1. Förbered 1% spolningslösning som innehåller 1% BSA och 0,3% TX-100 i 0,1 M PBS (se tabell 2) medan avsnitten är inkubation i 5% BSA blockerande lösning. BSA går inte till lösning enkelt. Vortex lösning tills BSA helt löses upp.
    2. Späd primära antikroppar i 1% BSA spolningslösning medan sektioner inkubation i 5% BSA blockerande lösning.
      1. Göra 1 500 µL primär antikropp lösning och lägga till varje brunn på rad 5.
      2. Späda primära antikropparna: använda nerv-specifika etikett, kanin polyklonala anti protein genprodukten 9,5 (PGP9.5) på 1:1, 000. Använd mitokondrierna-specifika etikett, mus monoklonal anti pyruvat dehydrogenas E2/E3bp antikropp (PDH) på 1: 100 i 1% BSA sköljning lösning.
  4. Förbered primär antikropp:
    1. Pipettera 150 µL av primär antikropp i var väl i rad 5 i plattan med 96 brunnar.
    2. Med verktyget loop, överföra sektioner från blockerande lösningen (rad 4) i raden 5 som innehåller primära antikroppen.
    3. Wrap plattan tätt med parafilm att hålla den från att torka ut.
    4. Placera prover på platta rocker i rumstemperatur i 1 h och sedan Inkubera prover vid 4 ° c på en platt rocker över natten.

dag 2:

  1. skölj prover:
    1. Förbered skölj brunnar i rader 6, 7 och 8 i plattan med 96 brunnar genom att lägga till 150 µL av 1% BSA sköljning lösning i varje brunn.
    2. Överför sektioner till första 1% BSA spolningslösning (rad 6) och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Upprepa sköljningar två gånger mer av ruvning sektioner i 1% BSA sköljning lösning i raderna 7 och 8 för 1 h varje rumstemperatur.
  2. Späd sekundära antikroppar i 1% BSA sköljning lösning:
    1. göra 1 500 µL sekundär antikropp lösning medan sektioner inkubation i den sista sköljningen av 1% BSA sköljning lösning (rad 8).
    2. Späda sekundära antikroppar: för PGP9.5 (grön fluorescerande konjugerade get-anti-kanin-antikropp, 1: 1000), för PDH (röd fluorescerande konjugerade get anti mus, 1:1, 000) i 1% BSA sköljning lösning.
  3. Förbereda sekundär antikropp:
    1. Pipettera 150 µL av sekundär antikropp in raden 9 av 96 brunnar plattan.
    2. Försiktigt överföra avsnitten från 1% BSA sköljning lösning (rad 8) i sekundär antikropp brunnar (rad 9).
    3. Använda parafilm, Linda plattan tätt för att hålla den från att torka ut. Täck med aluminiumfolie. Placera prover på platta rocker i rumstemperatur i 1 h och sedan Inkubera prover vid 4 ° c på en platt rocker över natten.

dag 3:

  1. Förbered rengör 1 x PBS genom filtrering genom ett 0,22 µm filter:
    1. Pipettera 150 µL filtreras 1 x PBS till rad 10, 11 och 12.
    2. Överföra prover till rad 10 och skölj i 1 x PBS för 1 h i rumstemperatur. Täcka plattan med 96 brunnar med aluminiumfolie och placera på en platt rocker under skölj. Upprepa filtreras 1 x PBS-skölj två gånger för 1 h varje vid rumstemperatur i rader 11 och 12.
  2. Förbereda objektglas för montering vävnadssnitt:
    1. plats 50 µL filtreras 1 x PBS på en bild.
    2. Överföring avsnittet från 1 x PBS (rad 12) till 50 µL droppe. Noggrant placera avsnittet i rullgardinsmenyn i PBS genom utspelas vävnaden och plattas det försiktigt in i glas-bilden. Ta bort överflödigt PBS med glas pipett för att undvika att späda montering reagensen. Vidrör inte sektioner med Glasbulben.
    3. Pipettera 1 - 2 droppar av montering reagens som innehåller DAPI direkt ovanpå avsnittet på Mikroskop bild med omsorg att inte störa i avsnittet orientering. Placera försiktigt en 50 x 24 mm #1.5 Mikroskop täckglas över avsnittet.
    4. Rensa eventuella luftbubblor som bildats medan placera täckglaset och torka av överflödig vätska ut kanterna på täckglaset. Förbereda en ny bild och upprepa montering prhandla för varje avsnitt.
    5. Botemedel/torr montering media genom att placera bilderna i den mörka natten i rumstemperatur. Överföra bilder till 4 ° C för kortsiktiga (1-2 veckor) eller -20 ° C för långsiktig lagring (mer än 2 veckor).
      Obs: Negativa kontroller utelämnas primär antikroppar för PGP9.5 eller PDH i steg 1.4.2.2 och visas ingen urskiljbar märkning av nerver eller mitokondrier i epidermis. Positiva kontroller utfördes för PDH antikropp att bevisa det etiketter alla mitokondrier (inga data anges). Positiva kontroller utfördes på odlade primära mus dorsalrotsganglier ganglion nervceller som var sensorik med en baculoviridae till etikett mitokondrier med grönt fluorescerande Protein (GFP) signal och sedan fixeras och färgas med PDH antikropp och röd fluorescerande sekundära antikroppar. Alla mitokondrier som uttrycker GFP var samtidig märkta med röd etikett för PDH immunohistokemi (inga data anges).

2. Confocal Imaging

  1. utföra confocal imaging:
    1. samla bilder med hjälp av en laser skanning confocal Mikroskop med 40 X olja-immersion (1,25 numerisk bländare (N.A.)) mål på ett inverterat Mikroskop.
      1. På varje fokalplan sekventiellt förvärva fluorescerande signaler:
        kärnor: excitation λ = 405 nm, spektrala utsläpp filter λ = 420-480 nm
        nervtrådar: excitation λ = 488 nm, spektrala utsläpp filter λ = 505-560 nm
        Mitoch ondria: excitation λ = 543 nm, spektrala utsläpp filter λ = 606-670 nm
    2. ange parametrarna av följande in i Mikroskop mjukvaran: avsökningshastighet av 600 Hz med 2 ram genomsnitt och zoom för 2.2; 12-bitars intensitet upplösning (4096 grå nivåer).
      1. Ställ mikroskopet programvaran för optimerad lateral upplösning (scan resolution = 1 024 x 1 024) och axiell upplösning/optisk snittning (confocal bländare = 1 luftiga enhet (AU) med z-steg storlek 210 nm).
        Obs: Den resulterande XYZ-upplösningen är 172,2 nm x 172.2 nm x 210 nm med en bildstorlek på 176,1 µm x 176,1 µm x 30-50 µm.
    3. Aktivera en live scan för nerv signalen (grön-fluorescens) och justera kontrollen z-fokus för att hitta och ange övre och lägre fokal flygplan i Mikroskop mjukvaran som omfattar den nerv signalen inom avsnittet vävnad. Den totala z-serien är normalt 30-50 µm för ett 50 µm vävnad avsnitt.
    4. Rotera fältet scan med Mikroskop mjukvaran under en live scan så att epidermis är horisontellt eller vertikalt placerad i bilden.
    5. Skanna varje signal separat och Justera detektorn (fotomultiplikatorn röret, PMT) spänning och förskjutning att minimera/ta bort någon över och under mättade pixlar.
      Obs: Skanna gånger med ovanstående parametrar tar cirka 20-40 min beroende på antalet z skivor.

3. 3D visualisering och analys av mitokondrier inom mänskliga Intraepidermal nervfibrer

  1. isolera 3D epidermis:
    1. duplicera den ursprungliga bilden och använda den högsta stödnivån projektion (extended fokusvyn) av bilden för att identifiera och isolera epidermis.
    2. Använda ett område av intresse för att spåra längs övre och nedre kanterna av epidermis att ta bort oönskade områden såsom hornlagret och dermis som är frånvarande av intraepidermal nervfibrer. Beskär till denna markering.
  2. Användning deconvolution på nerv och mitokondrie fluorescerande signaler:
    Obs: Deconvolution hjälper till att återställa integriteten hos de fluorescerande signalerna. Den restaurering som används i detta protokoll kallas blinda deconvolution eftersom den använder fluorescerande signalerna i bilderna för att avgöra hur mycket signaler spridit sig från sin ursprungliga källa (punkt sprida funktion). Processen förbättrar signal upplösning återanvisats signalen sprids tillbaka till sitt ursprung-läge.
    1. Beräkna en punkt sprida funktion (PSF) för grön fluorescerande nerv signal (grön-fluorescens) med följande parametrar:
      1. anges beräknade polyesterstapelfibrer till confocal. Ställ in medium brytningsindex på 1.515 och numerisk bländare till 1,25. Ange detektor pinhole 1 luftiga enhet (A.U.). Ställ in laser excitation våglängd till 488 nm och utsläpp våglängd till 515 nm.
    2. Beräkna en PSF för röd fluorescerande mitokondrie-signalen (röd-fluorescens) med följande parametrar:
      1. Set beräknas polyesterstapelfibrer till confocal. Ställ in medium brytningsindex på 1.515 och numerisk bländare till 1,25. Ange detektor pinhole 1 AU. Ställ in laser excitation våglängd till 543 nm och utsläpp våglängd till 617 nm.
    3. Optimera nerv och mitokondrier fluorescerande signalerna av deconvolution använder de motsvarande vävda som anges ovan och iterativ restaurering funktionen inställd på 100% förtroende och en iteration gräns på 10 cykler.
  3. Skapa nerv-specifika ytor:
    1. användning de " skapa yta " verktyg för att göra en fast yta av nerver från deconvolved grön fluorescerande sekundära märkning av PGP9.5 identifierade nerver.
    2. Uncheck den " len " och kunna använda funktionen absolut intensitet att ställa in tröskelvärdet för den nerv signalen eftersom det är betydligt ljusare än bakgrunden fluorescens.
    3. Använda funktionen absolut intensitet för att ange tröskelvärde för nerv signal eftersom det är betydligt ljusare än bakgrunden fluorescens. Ange tröskelvärdet tillräckligt låg för att korrekt identifiera nerverna.
    4. Filtret ut små, icke-nerv ytor baserat på storlek.
      Obs: Om det behövs, manuellt redigera ut ytterligare icke-nerv ytor inom den " redigera " fliken genom att hålla CTRL-tangenten att markera flera objekt och sedan ta bort dem med Delete-tangenten.
  4. Isolera nerv-specifika fluorescerande mitokondriell signal:
    1. Välj fliken Redigera i nerv ytan för att visa den " Mask boenden " funktion. Nerv ytan skapas i steg 3.3 används för att isolera mitokondrier i dessa nerver från mitokondriella signaler är associerad med keratinocyter.
    2. Som den " Mask alla ' knappen öppnas en " maskkanalen " fönster, välja deconvolved röd fluorescerande signalen från rycka ned menyn under " kanalval " för mitokondriell signalen.
    3. Klickar du i rutan för att sätta en bock den " duplicerade kanalen innan du applicerar masken " alternativet.
    4. Klicka på radion knapp framför den " konstant innanför/utanför " alternativet Mask inställningar och klicka i rutan för att sätta en bock den " ange voxel utanför ytan till " alternativ och skriv in 0,00 för värdet. Klicka på OK-knappen för att skapa den nya kanalen som representerar mitokondriell signaler inom nerv ytan.
  5. Skapa mitokondrierna-specifika ytor:
    1. användning de " skapa yta " verktyg för att göra en fast yta av mitokondrierna från den nyskapade fluorescerande kanalen av nerv-specifika mitokondriell signalerna från steg 3,4.
    2. Avmarkera den " slät " har och välj den " bakgrunden subtraktion " funktionen för att ange tröskelvärde. Den här funktionen använder lokal kontrast runt mitokondriell signalen för att identifiera mitokondrier från bakgrunden.
    3. Set tröskelvärde tillräckligt låg för att korrekt identifiera mitokondrier. Det lägre tröskelvärdet fastställdes i detta exempel 2,000 för en 16-bitars (65 536) skala.
    4. Filtrera mitokondriell ytor baserat på storlek. I det här exemplet voxel gränsen var satt till 1,0 voxlar är som lägst begränsa möjligt. Om det behövs, manuellt redigera ut icke-mitokondrierna ytor inom den " redigera " fliken genom att hålla CTRL-tangenten att välja flera objekt och sedan ta bort dem med Delete-tangenten.
      Obs: Ibland, programvaran kommer att skapa ytor som inte är associerade med en urskiljbar fluorescerande mitokondriell signal. I dessa fall är det möjligt att ta bort dem med den " redigera " tab.
  6. Exportera och beräkna morfometriska värden för analys:
    1. Exportera värden för nerv- och mitokondrie ytor från den " statistik " fliken för vidare analys med elektroniska kalkylprogram.
    2. Exportera volym värdena för både nerv och mitokondrie ytor.
    3. Räkna antalet enskilda nervtrådar som är närvarande i varje bild och anteckna värdet i det elektroniska kalkylbladet.
    4. För varje bild, beräkna följande potentiella värden för analys i det elektroniska kalkylbladet:
      1. Summa volymer för alla nerv ytor.
      2. Filtret ut nerv-specifika mitokondriell ytor nedanför en volym av mindre än 0,02 µm 3 och bin ytorna av storlek. Exempelvis använder lagerplatser till exempel 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08, 0,08 - 0,16, 0,16 - 0.32, 0.32 - 0,64, 0,64 - 1.28 1.28-2,56, större än 2,56 µm 3.
        Obs: Den nedre gränsen för mitokondriell volym var inställd på 0,02 µm 3 baserat på tidigare publicerade volymer av mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Räkna antalet nerv-specifika mitokondriell ytor inom varje lagerplats och det totala antalet ytor över lagerplatser (0,02 - större än 2,56 µm 3).
      4. Beräkna andelen nerv-specifika mitokondriell ytor på respektive lagerplats. Använd greven per bin dividerat med det totala antalet mitokondrier ytor.
      5. Summera volymer för alla nerv-specifika mitokondriell ytor.
      6. Beräkna andelen nerv med mitokondriell signal genom att dividera totala nerv ytan volymen med summan av alla mitokondriell ytan volymer.
      7. Beräkna antalet mitokondrier per nerv volym genom att dividera den totala nerv ytan volymen av räkningen av alla mitokondriell ytor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Visualisering och kvantifiering av mitokondrier inom mänskliga IENFs

Fluorescens immunohistokemi möjliggör samtidiga märkning av flera signaler inom mänsklig hud biopsier att visualisera nerver, mitokondrier och kärnor. En plattan med 96 brunnar är ett bekvämt sätt att organisera stegen i förfarandet för immunohistokemi. Figur 1 visar att denna konfiguration står för upp till 8 avsnitt behandlas genom 12 stadier av lösningar. Fritt flytande metoden kombineras med försiktig skakning med en platt rocker säkerställer att antikropparna har tillräcklig tillgång till tränga igenom avsnitten från båda sidor. Protokollet tar 3 dagar att slutföra, vilket är till stor del på grund av övernattning inkubationer i primära och sekundära antikroppar vid 4 ° C, som konsekvent etikett nerver och mitokondrier.

Återstoden av förfarandet omfattar imaging, bearbetning och analys av fluorescerande signalerna. Konfokalmikroskopi utnyttjar de fluorescerande signalerna till optiskt avsnitt diskreta signaler från fokalplanet genom att eliminera out-of-fokus signaler. Förvärv av z-serien via avsnittet vävnad ger en 3D-representation av de fluorescerande signalerna för nerver, mitokondrier och kärnor. Parametrarna är optimerade till bild 172 µm längs längden av överhuden som skulle omfatta ett genomsnitt av 5 nerver. Figur 2 illustrerar en typisk 3D-bild av de tre fluorescerande signaler som samlas in från epidermis. Den PGP9.5 färgning (figur 2B) ger en rik signal av den epidermala och dermal nerver som är av en högre intensitet än bakgrunden auto-fluorescensen av vävnad. Nukleära fläcken (figur 2 c) hjälper till att identifiera gränserna för epidermis där intraepidermal nervfibrerna innerverar. Det är vanligt att det yttre lagret av epidermis har en diffus signal som kan bero på kvarvarande DNA i den corneocytes som bygger upp stratum corneum. Mitokondrierna är tydligt märkta av den PDH färgning (figur 2D) där majoriteten av signalen är associerade med celler i epidermis som är primärt keratinocyter.

Förvärv parametrarna beskrivs i detta protokoll med en 40 X oljeimmersionsobjektivet en 1,25 numerisk bländare och en zoomfaktor för 2.2. Detta resulterar i en XYZ bildstorlek 176,1 µm x 176,1 µm x 30-50 µm. Dessa inställningar fånga nog av epidermis att inkludera ett genomsnitt på 4-6 nervfibrer per bild (figur 3A). Provtagning vid högre upplösning skulle minska antalet nerver i varje bild. Figur 3B visar en zoomfaktor 3,3, vilket minskar området XY 114.8 µm x 114.8 µm, vilket resulterar i färre nerver per bild. Den idealiska stickprovstäthet som definieras av Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) för en 40 x oljeimmersionsobjektivet med en 1,25 numerisk bländare föreslår en XYZ skanningsupplösning 54 nm x 54 nm x 205 nm. Detta skulle kräva en zoomfaktor 6,6 gånger på 1 024 x 1 024 upplösning och minska vyn XY till 57,4 µm x 57,4 µm och bara fånga ett genomsnitt på 1-2 nerv per bild (figur 3 c).

Nästa fas är att utföra bildbehandling att ta bort oönskade delar av bilden och förbättra signalerna. I detta protokoll tas dermis och hornlagret bort för att kunna fokusera analysen på regionen i epidermis där IENFs innerverar. Tredimensionella programvara gör det möjligt att isolera, förbättra och analysera de fluorescerande signalerna. Verktyg inom programvaran för att isolera den epidermala nerv och mitokondrier genom att beskära ut regioner ovanför och under epidermis (figur 4A-C). Denna process underlättas av kollapsa signalerna i en utökad vy och sedan spåra en freehand regionen runt epidermis. Den beskurna bilden bearbetas vidare av bilden restaurering algoritmer. Deconvolution används för att optimera upplösningen av nerver och mitokondrie signaler (figur 4 d).

Den sista fasen är att identifiera och extrahera morfometriska funktioner från signalerna. En viktig aspekt av detta protokoll är att mäta funktioner av nerv-specifika mitokondrier. Bildanalys programvara har funktioner som Använd ytor som skapats för en signal (i detta fall nerv ytan) som en maskering verktyg att isolera en annan fluorescerande signal (i detta fall mitokondrierna) inom denna yta. Det första steget i analysen av nerv-specifika mitokondrier är att skapa 3D-ytor runt nerverna (figur 5A-B). Den nerv ytor används sedan för att beskära nerv-specifika fluorescerande mitokondriell signalerna (figur 5 c, 5D, 5E, 5 G). Slutligen skapas 3D-ytor runt nerv-specifika mitokondriell signalerna att erhålla volymetriska mätningar (figur 5F, 5H). Tabell 3 visar morfometriska mätningarna som exporteras från bild analys programvara och sammanfattningsdata. De viktigaste värdena att exportera är volym värdena för nerv och nerv-specifika mitokondriell signaler. Volymdata från mitokondrierna är kastas i papperskorgen för att generera mitokondrier storlek frekvens data, som sedan används för att skapa storlek frekvens histogram (figur 6). Volymdata används också för att göra sammanfattande åtgärder för antal mitokondrier per IENF volym och procentandel av mitokondriell volym inom IENF volymer.

De data som presenteras i tabell 3 och figur 6 visar att denna teknik tillhandahåller ett sätt att kvantifiera mitokondrier inom mänskliga IENFs från huden biopsier. Nerverna från detta prov har mitokondrier fördelade och flesta av mitokondrier är mellan 0,02 - 0.32 µm3. Dessa storlekar är i en rad som är associerad med normala mitokondrier36,37,38,39. Mindre mitokondrierna har visat sig vara mer rörliga än större mitokondrier39 tyder på att mitokondrierna i dessa nerver kan vara mer rörliga. Studier har faktiskt inblandade att större, svullna mitokondrierna inte transporterar samt mindre mitokondrier och kan leda till axonal degeneration39,40,41. Karakterisering av nerv-specifika mitokondrier är därför en värdefull teknik som skulle vara tillämpliga på studier av neurodegenerativa sjukdomar där förändringar i mitokondriell morfologi och transport har förknippats med axonal degeneration 15,25,26,27,42,43.

5% BSA blockerar lösning
Komponenter av 5% BSA blockerar lösning Belopp som behövs
Bovint serumalbumin (BSA) [slutlig koncentration: 5%] 0,625 g
1,0% Triton x-100 (TX-100) [slutlig koncentration: 0,3%]
3,75 mL 1 x PBS ~8.125 mL Totala (Använd 1 X PBS för att föra totala volymen till 12,5 mL) 12,5 mL

Tabell 1: 5% BSA blockerar lösning. 5% BSA blockerande lösningen används i tidiga steg av protokollet immunohistokemi blockera icke-specifik bindning av antikroppar.

1% BSA sköljning lösning
Komponenter av 1% BSA sköljning lösning Belopp som behövs
Bovint serumalbumin (BSA) [slutlig koncentration: 1%] 0,125 g
1,0% TX-100 [slutlig koncentration: 0,3%] 3,75 mL
1 x PBS ~8.125 mL
Totala (Använd 1 X PBS för att föra totala volymen till 12,5 mL) 12,5 mL

Tabell 2: 1% BSA sköljning lösning. 1% BSA sköljning lösning används i protokollet immunohistokemi blockera icke-specifik bindning av antikroppar och används för att späda primära och sekundära antikroppar.

Morfometriska mätningar för IENFs och nerv-specifika mitokondrier
Exporteras och sammanfattande Data från bild analys programvara
MT storlek frekvens lagerplatser Antal Mt i storlek frekvens Bin Procentandel av Mt i Bin Totalt antal Mt MT volym (µm3) IENF volym (µm3) Antal Mt per IENF volym (antal/100 µm3) Procentandel av Mt volym i IENF volym Antal IENFs
mellan
.02-.04 µm3
20 24,4% 82 13,41 518.88 15,8 2,58% 4
mellan
.04-.08 µm3
28 34,1%
mellan
.08-.16 µm3
14 17,1%
mellan
.16-.32 µm3
12 14,6%
mellan
.32-.64 µm3
4 4,9%
mellan
.64-1.28 µm3
3 3,7%
mellan
1.28-2,56 µm3
1 1,2%
mellan
2.56 + µm3
0 0,0%

Tabell 3: Morfometriska mätningar för IENFs och nerv-specifika mitokondrierna. Tabellen representerar morfometriska värden som mäts och exporteras från bild analys programvara och sammanfattningsdata. Förkortningar: IENF, intraepidermal nervfibrer; MT, mitokondrierna.

Figure 1
Figur 1 : Schematiskt Diagram som representerar Setup för en plattan med 96 brunnar för huden biopsi immunohistokemi. Rader i plattan representera steg i protokollet för block, tvätta och inkubation lösningar och kolumnerna representerar individuella vävnadssnitt (från 1 till 8 sektioner per platta). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representativa 3D konfokalmikroskopi bild av en vävnad från en Human Epidermal biopsi bearbetas för fluorescens immunohistokemi. Obearbetade 3D projektionsbild illustrerar (A) samman fluorescerande signaler och enskilda signaler för (B) nerver (nerv, grön), (C) atomkärnor (Nuc, blå) och (D) mitokondrier (Mt, röda) i epidermis och dermis. Notera avsaknaden av signaler i hornlagret lagret av epidermis. Skala barer = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Förbättrad Image Resolution resulterar i färre nerver för efterföljande analys. Alla bilder är tagna med ett 40 X-objektiv med en 1,25 numerisk bländare olja och 3D prognoserna illustrera fluorescerande signaler för nerver (grön), mitokondrierna (Mt, röd) och atomkärnor (Nuc, blå). En bild tagen på en zoomfaktor 2,2 (A) innehåller flera nerver inom synhåll. Öka zoomfaktor till 3,3 (B) eller 6,6 (C), minskar perfekt Nyquist provtagning, avsevärt antalet nerver inom varje bild. Skala barer = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Bildbehandling. Representant utökade fokus (maximal intensitet projektion) visningen av en bild från konfokalmikroskopi av en vävnad från en human epidermal biopsi. Obearbetade projektionsbild illustrerar (A) den sammanslagna fluorescerande signaler för nerver (grön), kärnor (Nuc, blå) och mitokondrier (Mt, röd). Dermis och hornlagret är (B) beskurna ut med en region av integreresten (ROI) freehand markeringsverktyget (blå markerade området, beskära ROI) isolera bara signaler i epidermis. (C) beskurna överhuden sedan behandlas för (D) deconvolution med beräknad punkt sprida funktioner för att förbättra upplösning av nerver (grön) och mitokondrie (Mt, röd) signaler. Skala barer = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Bildanalys. Representativa 3D konfokalmikroskopi bild illustrerar (A) nerv-specifika grön fluorescerande signalen. (B) en 3D-yta (cyan) skapas för nerv signal. Nerv-specifika mitokondriell signalen är isolerade från resten av (C) epidermal mitokondriell signalerna (Mt, röd) av (D) använda nerv ytan som en maskering verktyg. Den resulterande (E, G) nerv-specifika mitokondriell röd fluorescerande signal används för att skapa (F, H) ytor (Mt yta, magenta) runt mitokondrierna inom nerv ytan (cyan). G och H är förstorade vyer av vita rutorna i E och F. skala barer = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Mitokondriell storlek frekvens Histogram. Mitochondrialsurface data presenteras som ett storlek frekvens histogram att visualisera andelen mitokondrier som finns i var och en av de olika lagerplatserna enligt deras volym (µm3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll är utformad för att isolera, kvantifiera och analysera storleken och fördelningen av nerv-specifika mitokondrier inom IENFs i 3D från mänsklig hud biopsier. Det finns flera kritiska steg i protokollet. Fritt flytande fluorescens immunohistokemi är utformade för att fläcken flera signaler i varje prov, som ger en mer mångsidig metod för explorativ forskning44,45. Detta förfarande möjliggör penetrering av antikroppar i vävnaden för att maximera förvärvet av bilder i hela 50 µm avsnittet, som är nödvändig för att förvärva konfokalmikroskopi bilder och 3D-analys. Ett annat viktigt steg är förvärvet bildparametrarna som är balanserade mellan fånga tillräckligt nerver per bild bibehållen upplösning för mätning av mitokondrier. Vävnadssnitt används i detta och protokoll som standard huden biopsi är ungefär 3 mm lång45,46,47,48. Förvärv parametrarna beskrivs i detta protokoll fånga nog av epidermis att inkludera ett genomsnitt på 4-6 nervfibrer per bild. Provtagning vid högre upplösning skulle avsevärt minska antalet nerver i varje bild, speciellt vid Nyquist provtagning. Ett tredje viktigt steg är att använda deconvolution algoritmer för att förbättra upplösning och kontrast av signaler, särskilt för mitokondrier. Deconvolution bilder bidrar till att kompensera inte provtagning med högre upplösning. Det sista viktiga steget är att använda analys bildbehandlingsprogram för att isolera nerv-specifika mitokondrier från mitokondrierna är associerad med celler i överhuden. Detta sker genom att använda nerv ytan som en maskering verktyg för att beskära mitokondriell signal om att lokalisera inom nerven.

Det finns några potentiella ändringar i denna teknik att överväga. En möjlig ändring vore att förkorta varaktigheten av fluorescens immunohistokemi. De natten inkubationer i primär och sekundär antikropp lösningar vid 4 ° C kunde förkortas till 3-4 timmar i rumstemperatur. Kortare inkubationer rumstemperatur ökar dock ofta bakgrunden fluorescens, så försiktighet bör vidtas för att undvika dålig signal till brus. En annan möjlig ändring skulle vara att justera bild förvärv parametrar. Som nämnts ovan, bild förvärv beskrivs här var partisk mot att fånga ett rimligt antal nerver per bild över hög bildupplösning. Det är möjligt att använda en högre förstoring mål, såsom en 63 x oljeimmersionsobjektivet med en 1.3 numerisk bländare. Om alla parametrar är oförändrad och ett 63 X-objektiv användes, XY bildfältet skulle reduceras till 112 µm x 112 µm och därför minskar det genomsnittliga antalet nerver per bild. Den viktigaste punkten är att använda konsekventa parametrar i hela förvärvet och efterföljande analys.

Den största begränsningen av denna teknik är att det är tidskrävande. Immunohistokemi tar 3 dagar att behandla vävnad, bild förvärvandet tar ca 30-50 minuter per bild beroende hur många optiska z-åtgärder och behandling/bildanalys tar cirka 20 min. Detta är en betydande tid engagemang men ger viktiga morfometriska mätningar i slutet. En annan begränsning av denna teknik är det begränsa området av epidermis samplas per bild. Dock kommer detta utan tvekan förbättra som framsteg görs i bild förvärv priser med förbättrad upplösning kombinerat med snabbare datorprocessorer och analysprogram.

Betydelsen av detta protokoll över andra metoder är i kraft av att kombinera fluorescens immunhistokemi med konfokalmikroskopi och 3D bildanalys. Traditionellt, sker intraepidermal nerv fiber analys med kromogen baserat immunhistokemi och ljusa fält mikroskopi, särskilt för klinisk diagnos av neuropati45,47,49. Användning av fluorescens immunohistokemi gör det möjligt att färga och analysera flera signaler i varje prov, som ger en mer mångsidig metod för explorativ forskning44,45. Denna teknik ger en strategi för att isolera en viss signal av intresse, i detta fall nerv-specifika mitokondrier, från en komplex signal, mitokondrierna är associerad med epidermala celler.

Kraften i denna teknik är dess användbarhet i framtida tillämpningar. Möjligheten att isolera och mäta nerv-specifika mitokondrier gör det möjligt att utvärdera sjukdom-inducerad förändring i storleken och fördelningen av mitokondrier. Flera neurologiska komplikationer har inblandade mitokondriell dysfunktion som en potentiell mekanism av sjukdomen. I synnerhet har en modifierad version av denna teknik använts för att påvisa att patienter med diabetes och diabetisk perifer neuropati har mätbara förändringar i storleken och fördelningen av nerv-specifika mitokondrier jämfört med åldersmatchade styr50. Denna teknik skulle vara användbart för utvärdering av effektiviteten av terapier som syftar till att förbättra eller bota sensorisk neuropati. Slutligen, mångsidigheten hos tekniken gör det tillämpas på ett brett utbud av analyser som använder en fluorescerande signalen för att isolera en delmängd av data från andra fluorescerande signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa bidrag K08 NS061039-01A2, programmet för neurologi forskning & upptäckt, och A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde morfologi och bild analys Core för Michigan Diabetes Research Center, finansieras av nationella institut för hälsa Grant 5P 90 DK-20572 från nationella institutet för Diabetes och mag- och njursjukdomar. Författarna vill tacka J. Robinson Singleton och A. Gordon Smith (University of Utah) för deras generösa donation av mänsklig hud prover.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA
MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80, (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4, (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241, (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34, (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218, (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125, (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11, (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31, (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13, (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22, (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22, (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118, (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132, (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167, (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70, (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27, (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802, (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120, (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53, (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5, (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216, (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182, (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58, (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29, (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628, (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292, (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4, (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35, (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14, (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12, (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17, (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33, (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164, (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15, (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1, (10), 799-812 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics