منهج في النسب الانسحاب من الخلايا القرنية عن طريق متعدد الألوان مراسل الفلورسنت الفئران

1Department of Genetics and Developmental Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology, 2Department of Ophthalmology, Hillel Yaffe Medical Center, 3Bioimging Center, Biomedical Core Facility, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally
Published 12/18/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Amitai-Lange, A., Berkowitz, E., Altshuler, A., Dbayat, N., Nasser, W., Suss-Toby, E., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. J. Vis. Exp. (106), e53370, doi:10.3791/53370 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

أثناء التطور الجنيني والأنسجة والتشكل الجهاز تتم عن طريق برنامج دقيق يمكن وصفها من حيث تكاثر الخلايا، والهجرة الخلية ومواصفات النسب 1-4. وتشارك هذه العمليات البيولوجية أيضا في الحفاظ على توازن الأنسجة الكبار، الأمر الذي يتطلب وقف تجديد الخلايا. تتبع النسب، وتحديد وتتبع ذرية من نوع معين من السكان الخلية، ويوفر أداة هامة لدراسة التطور الجنيني ووقف توازن الخلية. في الواقع، يتزايد استخدامه في العديد من مجالات البحث. بشكل خاص، أصبح البحث عن المفقودين النسب أداة أساسية في تحديد منشأ ومصير الخلايا الجذعية في التوازن وسرطان التنمية. هذا هو لأنه قد تقدم معلومات أساسية حول كيفية سلوك الخلية في سياق أنسجة سليمة أو الحي، مع التدخل التجريبي الحد الأدنى، على النقيض من العزلة الخلية والثقافة في المختبر أو transplantatiعلى هذا قد يؤدي إلى تحيز غير المرغوب فيها.

تقليديا، والأصباغ مثل الدهون القابلة للذوبان carbocyanine، الذي تدرج في الغشاء البلازمي للخلايا، واستخدمت لتتبع النسب. على الرغم من أن هذه الأنواع من التجارب أدت بنجاح إلى الاكتشافات الكبرى والمفاهيم الأصيلة شكل في البيولوجيا التطورية 5،6، لديهم بعض القيود، بما في ذلك صعوبة في السيطرة على خصوصية الخلايا المستهدفة، وتأثير غير مرغوب فيه من الصبغة على سلوك الخلية والتخفيف التسمية مع مرور الوقت. وقد مكنت النوكليوتيدات نهج وضع العلامات التماثلية توثيق وجود بطء في سباق الدراجات "التسمية الاحتفاظ الخلايا" التي تتوافق يفترض أن هادئة الخلايا الجذعية 7،8. ومع ذلك، في حين أن هذه التقنية يمكن أن تثبت وجود خلايا الدراجات بطيئة تقوم على حركية الانتشار على مدى فترة زمنية محدودة لا يمكن أن تقدم أفكارا جوهرية بشأن وظائف الخلايا الجذعية. أمثل المنهجيات تتبع النسبodology يجب تقليل تأثير وضع العلامات على خصائص الخلية ملحوظة، نسله، أو جيرانه. بالإضافة إلى ذلك، سيكون من المفيد أن يكون السيطرة على تحريض وضع العلامات، وهي لديها القدرة لوضع علامة على السكان خلية من الاهتمام في مرحلة والوقت بطريقة تعتمد وكذلك في خلية واحدة (نسيلي) الطريقة. طريقة وضع العلامات مستقرة ولا رجعة فيه التي يتم تمريرها إلى جميع ذرية الخلية مؤسس من الأهمية بمكان بحيث سيتم الإبقاء على التسمية مع مرور الوقت، وليس نقلها إلى الخلايا المجاورة.

وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت نهج الجينية لوضع العلامات الخلية. في هذه الأنظمة، المروجين خلية معينة يمكن استخدامها لتحريك لجنة المساواة العرقية recombinase التعبير من أجل إزالة حاجز-يحيط loxP والسماح للتعبير عن الجينات مراسل مثل البروتين الفلوري الأخضر أو Β غالاكتوزيداز الجينات مراسل 13/09. هذا النهج يمكن ليس فقط تتبع الخلايا وذريتها ولكن يسمح أيضا الخليةolation والتوصيف الجزيئي. أصبحت تتبع الخلية على مستوى خلية واحدة ممكن عن طريق تحريض التعبير عن واحد الفلورسنت الجين المراسل. واحد الحد هاما في هذه المنظومة هو حقيقة انه فقط عندما يتم المسمى نسبة ضئيلة جدا من خلايا فمن الممكن لفصل وتعقب الحيوانات المستنسخة الفردية. للتغلب على هذا القيد للصحفيين متعدد الألوان يمكن استخدامها. عند استخدام الوسم متعدد الألوان، تتبع مصير الفرق من الخلايا المجاورة في نفس مكانة يمكن أن يتحقق بكفاءة 14-17. مؤخرا، تم تطوير مجموعة متنوعة من Brainbow (برازيلي) الأليلات عن النسب تتبع التجارب، مما تعبير العشوائية متعددة الجينات مراسل فلوري الاستفادة من لجنة المساواة العرقية / نظام السلمون المدخن. يتكون نظام لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن من recombinase الانزيم لجنة المساواة العرقية، التي تعترف وتربط لتسلسل الحمض النووي محددة مثل مواقع loxP. بعد ملزم من لجنة المساواة العرقية recombinase، يحدث إعادة التركيب موقع معين، والذي يسبب إزالة loxP يحيط تسلسل resultinز في التعبير عشوائي من البروتينات الفلورية مختلفة (يوصف آلية أدناه). هي مجموعة متنوعة من خطوط برازيلي المتاحة للاستخدام (انظر ملاحظات 16،18،19). وتشمل الاختلافات الرئيسية بين سلالات برازيلي (ط) فروق في عدد من الجينات الفلورية المدرجة في الكاسيت، تتراوح ما بين 2 (برازيلي 2.0)، 3 (Br1.0) إلى 4 (Br1.1، Br2.1) الجينات الفلورسنت ، (ب) وجود مواقع السلمون المدخن الموجه متبادل للسماح للانقلاب الجين (Br2.0-2.1)، (ج) نوع من المواقع السلمون المدخن استخدامها، و (د) التعبير أو الصمت من الفلورسنت التعبير الجيني قبل تفعيل لجنة المساواة العرقية. تقدم BR3 التي أنشئت مؤخرا افضل طريقة للتصوير متعدد الألوان من الخلايا العصبية. واحدة من السمات الرئيسية لهذا النص هو أنه يحتوي على مجموعة جديدة من صامد البروتينات الفلورية farnesylated، التي تمكن حتى تلطيخ من أرقى العصبية بمعالجة 20.

الأهم من ذلك، قد تحتوي على إصدارات مختلفة من الأشرطة الأخ وتحديدا الخلايا العصبية Thy1 العلاقات العامةomoter أو بتواجد مطلق أعرب CAG (CMV) مروج. وأخيرا، في حين أن بعض الفئران المعدلة وراثيا برازيلي قد تحتوي على الأخ التحوير واحد، قد تتكون الآخرين النسخ التحوير متعددة، مما يسمح للإنتاج عدد هائل من الاحتمالات لتركيبات الألوان إلى أن تتجلى في كل خلية (انظر على سبيل المثال 16).

في دراستنا، استخدمنا الماوس R26R-النثار الذي يحتوي على برازيلي 2.1 كاسيت 21. تم تصميم Br2.1 فريد للسماح العكس DNA لجنة المساواة العرقية بوساطة وليس فقط الختان بسبب التوجه المتبادل للمواقع loxP (الشكل 1). وبالتالي، يمكن لهذه الأحداث انعكاس / الختان التي تؤدي إلى تغيير لون يستمر طالما جنة المساواة العرقية موجودة 16. لهذا السبب، وهو نظام الزمني التعبير لجنة المساواة العرقية محرض أساسي لتتبع الخلية موثوقة باستخدام Br2.1. كما هو مبين في الشكل. 1، وBr2.1 يحتوي على مروج CAG في كل مكان تليها يحيط loxP الجدد R -casseتتيه، الذي يعمل بمثابة حاجز النسخي، التي تبعتها 4 الجينات الفلورية مراسل والترميز للأخضر (GFP) والأصفر (YFP) والأحمر (RFP) وسماوي (CFP) البروتينات الفلورية المتمركزة في اثنين من المقعدين. وأعرب عن أي مضان قبل تفعيل لجنة المساواة العرقية. تحريض لجنة المساواة العرقية recombinase يسبب إزالة كاسيت النيو-R تمكين التعبير عشوائي واحدة من 4 البروتينات الفلورية في خلية معينة. يحتوي الجزء الأول GFP-يحيط loxP وYFP عكس، في حين أن الجزء الثاني يحتوي على RFP-يحيط loxP وCFP عكسه. قد باستمرار أن يكون مقلوب هذه القطاعات DNA (باستخدام loxP التي هي في اتجاه عكس)، أو رفعه، ما دام لجنة المساواة العرقية recombinase موجودا. لذلك، يجب استخدام لجنة المساواة العرقية التحوير عابرة والسيطرة عليها. يوفر كاسيت Br2.1 نظام ممتاز للتمييز بين انبعاثات متداخلة على موقع الإشارة: التعبير عن YFP وطلب تقديم العروض هو حشوية، وGFP هو النووي وCFP منضما إلى غشاء الخلية. GFPوانبعاثات طلب تقديم العروض يتم فصلها بسهولة بواسطة المجهر الفلورسنت التقليدية. من أجل فصل الانبعاثات YFP / GFP / CFP، هناك حاجة إلى نظام التصوير متحد البؤر الطيفية. وإجمالا، الكاسيت Br2.1 يسمح للتعبير معين عشوائي، محرض، والأنسجة واحد من أصل أربعة جينات الفلورسنت متميزة في كل خلية المستهدفة. في الواقع، عندما تكون هناك حاجة لعدد أكبر من تركيبات الألوان، واحدة يمكن أن تولد الفئران متماثل التي تحتوي على 2 الأليلات من Br2.1، مما أدى في التعبير عن 2 علامات اللون لكل خلية ورفع عدد من تركيبات الألوان الممكنة ل10 22 وبعض سلالات الفئران برازيلي تمكين التعبير عن عدد أكبر بكثير من تركيبات الألوان الممكنة منذ تم دمج عدة نسخ من الكاسيت إلى جيناتهم 16. بعد ذلك، في معظم الحالات، وتركيبات الألوان الأربعة التي قدمتها أليل Br2.1 واحدة تكفي. بعد بروتوكول المقدمة هنا، يمكن للمرء أن إقامة هذه الطريقة باستخدام الإعداد بسيطة نسبيا من SPECTRآل المجهري مع قليل إن وجدت الحاجة للمعايرة.

هنا نقدم بروتوكول للتكيف لاستخدام الفئران R26R-النثار التي تحتوي على أليل Br2.1 واحد، حيث ينتسب تتبع تجارب ظهارة القرنية. وقد استخدمت هذه السلالة الماوس المعدلة وراثيا لدراسة منشأ ومصير القولون 21،23 والخلايا الجذعية الظهارية القرنية 22،24، فإن وجود نشاط الخلايا الجذعية في سرطان الأمعاء 25، وتميز خلية رجلاء الكلى في الكبيبات القطعي الوصل (FSGS) 17.

Protocol

بيان الأخلاق: في هذه الدراسة ورعاية الحيوان الاستخدام ويتفق مع بيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. وتمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة أخلاقية المحلية.

1. اختيار مناسب جنة المساواة العرقية، recombinase تعرب عن ماوس سلالة

  1. من مجموعة كبيرة ومتنوعة من لجنة المساواة العرقية خطوط المعدلة وراثيا متاحة للشراء 26 واعتمادا على الأنسجة المستهدفة للتحقيق معهم، واختيار لجنة المساواة العرقية سلالة الماوس المعدلة وراثيا والتي يتم التحكم في recombinase الجينات لجنة المساواة العرقية التي كتبها مروج غير محددة لالأنسجة من الاهتمام. في حالة الحاجة السيطرة الزمانية، واختيار لجنة المساواة العرقية خط محرض.
    ملاحظة: لقد اخترنا تاموكسيفين محرض K14-لجنة المساواة العرقية ERT التحوير لتسمية تحديدا الخلايا الجذعية / السلف الظهارية الحوفي والقرنية 24. لاحظ أنه قد تكون هناك اختلافات بين سلالات، ودي جيرولامو وزملاء العمل وأفاد خصوصية الحوفي مع أي التعبير القرنية لK1 بهم4-لجنة المساواة العرقية ERT 22. ميزة لاستخدام محرض الفئران المعدلة وراثيا لجنة المساواة العرقية هو أنه يسمح للتحريض النسب تتبع في أطر زمنية متعددة.

2. اختيار مناسب سلالة برازيلي ماوس

  1. اختيار الكاسيت برازيلي المناسب اعتمادا على سؤال البحث ومتاحة خط 16،18،20 لجنة المساواة العرقية.
    1. إذا تم استخدام غير محرض لجنة المساواة العرقية سلالة الماوس، واختيار الكاسيت برازيلي التي لا تسمح مستمرة DNA العكس / الختان، وبالتالي تؤدي إلى منتجات مسدود (على سبيل المثال Br1.0 أو Br1.1) 16.

3. عبور خطوط المعدلة وراثيا الاهتمام

  1. لبروتوكول المعروضة هنا، عبور متماثل R26R-النثار سلالة (Br2.1 / Br2.1) مع متماثل لجنة المساواة العرقية ERT سلالة (لجنة المساواة العرقية ERT / لجنة المساواة العرقية ERT) للحصول على الذريات فرداني الزيجوت (Br2.1 / +، لجنة المساواة العرقية / +) التي هي على استعداد لأحادية أليلية النسب تتبع كما أنهم جميعا تحتوي على Br2.1 أليل واحد ولجنة المساواة العرقية أليل واحد.
    ملاحظة: لزيادة كفاءة وضع العلامات، واحد يمكن أن تولد الفئران التي تحتوي على اثنين من الأليلات لجنة المساواة العرقية (Br2.1 / +، لجنة المساواة العرقية / لجنة المساواة العرقية)، في حين أن اثنين الأليلات Br2.1 (Br2.1 / Br2.1، لجنة المساواة العرقية / +) من شأنه أن زيادة تركيبات الألوان (كما هو مفصل في 22).

4. الحث جنة المساواة العرقية، recombinase

ملاحظة: تم تنفيذ إدارة تاموكسيفين في هذه التجارب من قبل حقن داخل الصفاق يوميا، لمدة 3-4 أيام، وذلك للحث على النبات من لجنة المساواة العرقية ERT recombinase في نواة الحوفي والقرنية الجذعية القاعدية K14 إيجابية / السلف الخلايا الظهارية. بروتوكول التالية يمكن استخدامها لحقن أربعة الفئران. بدلا من ذلك، التطبيق الموضعي للتاموكسيفين لسطح العين ينتج كفاءة أعلى. يمكن أن تظل الحل تاموكسيفين في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تدفئة حل قبل الاستخدام.

  1. تزن 100 ملغ من عقار تاموكسيفين وحلها في 5 مل من زيت الذرة لتشكيل 20 ملغ / مل حل تاموكسيفين.
  2. ضخ 200 ميكرولتر من تاموكسيفين (4 ملغ) حل البريتونى إلى 8 أسابيع الفئران القديمة لمدة 3-4 أيام متتالية.
    ملاحظة: يمكن أن تظل الحل تاموكسيفين في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تدفئة حل قبل الاستخدام.
  3. لالتطبيق الموضعي: تزن 60 ملغ من عقار تاموكسيفين وحله في 1 مل من زيت الذرة لتشكيل 60 ملغ / مل حل تاموكسيفين. دوامة وتعيين حل في حمام مائي تهتز الحفاظ على 65 ° C حتى يصبح إجازة اضح في الحمام حتى الاستخدام.
    1. تطبيق بعناية 100 ميكرولتر من الحل تاموكسيفين على كل سطح العين من الفأرة.

5. إعداد الأنسجة للتصوير

  1. الحيوانات التضحية باستخدام الأيزوفلورين (2٪ تبخر في الأكسجين) التخدير (تخدير تأكيد السليم بسبب عدم وجود ردود الفعل)، يليه CO 2 الاستنشاق في نقاط زمنية مناسبة بعد تاموكسيفين الحقن والعقيدlect الأنسجة ذات الصلة.
    1. لهذه التجارب، استأصل العينين عند نقاط الزمني التالي: 1، بعد 4 و 8 و 12 و 16 أسبوعا حقن تاموكسيفين. تحقيق استئصال باستخدام ملقط منحنية. اضغط على الجفون مما تسبب في مقلة العين لموسيقى البوب ​​من محجر العين. وضع ملقط وراء مقلة العين عقد العصب البصري. برفق مقلة العين وسلخه.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، كما هو موضح أدناه، الأنسجة يمكن أن تكون على استعداد لتحليل wholemount من الخلايا المسمى. ويمكن أيضا أن تكون مستعدة الأقسام العادية الأنسجة المجمدة، ثابتة في PFA وتصويرها كما هو موضح أدناه (انظر القسم 6 و 22).
  2. ضع كل عين في صحن 60 ملم مليئة برنامج تلفزيوني.
  3. تحت المجهر ستيريو باستخدام ملقط عقد العين بالقرب من العصب البصري مع القرنية أسفل واستخدام مشرط لإزالة العصب البصري والعضلات والنسيج الضام، وجعل شق صغير في الجزء الخلفي من العين.
  4. باستخدام مقص الربيع تكبير بعنايةقطع السماح للعدسة جحظ وإزالة القزحية باستخدام ملقط.
  5. تسطيح القرنية عن طريق 4-5 شقوق شعاعية بدءا من مركز نحو المحيط الخارجي باستخدام مشرط.
  6. استخدام مشرط لقطع الأنسجة الطرفية فائضة تتجاوز حوف.
  7. إصلاح القرنيات في PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل لهم لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني.
  8. احتضان عينات مع دابي لمدة 10 دقيقة ويغسل لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني.
  9. جبل القرنيات على الشرائح الزجاجية مع الجانب الظهارية مواجهة. ضع قطرة من تصاعد وسائل الإعلام على رأس القرنية والغطاء مع غطاء من الزجاج. السماح الشرائح الجافة O / N في RT تبقي الشرائح في 4 ° C.

6. متحد البؤر المجهري والتحليل التصوير

  1. استخدام نظام متحد البؤر الطيفية التي تمكن فصل الانبعاثات YFP / GFP / الحراجية المعتمدة. تعيين الإثارة مضان وانبعاث موجات اعتمادا على البروتينات الفلورية للكاسيت برازيلي. اختيار الطول الموجي الإثارة الأكثر ملاءمة لكل بروتين تهدف إلى التقليل عبرالإثارة. اختيار نطاقات ضيقة الانبعاثات من أجل تقليل تسرب إشارات من البروتينات المختلفة.
    1. لكاسيت Br2.1، استخدم ما يلي اقامة الإثارة مضان (مثلا) والانبعاثات (م) كنقطة انطلاق: دابي - 405 نانومتر السابقين / م 420-480 نانومتر، CFP - 458 نانومتر السابقين / م 470-500 نانومتر، GFP - السابقين 488 نانومتر / م 497-508 نانومتر، YFP - 514 نانومتر السابقين / م 529-540 نانومتر، وRFP - 561 نانومتر السابقين / م 575-615 نانومتر.
  2. من أجل رؤية مناطق الأنسجة كبيرة مع ارتفاع القرار، واكتساب التصوير البلاط. للحصول على نتائج هو مبين في الشكل 2A-B، صورة القرنية بأكملها من خلال الحصول على مجموعة من 12 × 12 صورة، أي الحصول على 144 الحقول (512 X 512) باستخدام 4 قنوات الفلورية في كل حقل. تماما جمع 576 الصور ثم دمج.
  3. لاستكشاف توطين الخلايا الموسومة في أعماق وهياكل أنسجة مختلفة، الحصول على صور Z-كومة من مناطق مختلفة من الفائدة. من أجل رس صورة عمق الكامل للقرنية، الحصول على 8 أقسام البصرية في 3 ميكرون فترات. وجهات النظر المتعامدة من الأقسام التي تم جمعها، وكذلك التوقعات تستند هذه الصورة إلى أقصى شدة يمكن بناؤها باستخدام برامج التصوير التقليدية 24.

7. القرنية الإصابات جنبا إلى جنب مع تاموكسيفين التعريفي

  1. تخدير الفئران مع isoflurane (2٪ تبخيرها في الأكسجين) وإدارة المسكنات (10 ملغ / كغ Carpofen، حقن تحت الجلد). تأكيد التخدير المناسبة التي تجاوب إلى أخمص القدمين قرصة.
  2. يزن 1 غرام من مسحوق تاموكسيفين وحلها في 5 مل من DMSO معقمة لإنتاج 200 ملغ / مل تركيز الحل.
  3. تدفئة حل تاموكسيفين إلى 65 درجة مئوية في حمام مائي حتى يصبح حل واضح. إبقاء الحل في الحمام حتى الاستخدام.
  4. تطبيق مرهم العين للعين المقابل غير المعالجة لمنع الجفاف أثناء التخدير. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد أنه يخدع كافيةsciousness للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الفئران التي تعرضت لإصابة العين للشركة من الفئران الأخرى حتى تعافى تماما. يجب مراقبة الفئران عن كثب في أعقاب الإصابة. في حال فقدان أكثر من 10٪ من وزن الجسم، ويعاني من تآكل القرنية، أو عدم الراحة، ويجب أن تتوقف التجربة. إدارة المسكنات كرر كل 24 ساعة طوال التجربة بأكملها.
  5. باستخدام محقنة معقمة، دون إبرة المرتبطة به. تطبيق 200 ميكرولتر تاموكسيفين حل موضعيا على سطح القرنية كاملة من عين واحدة من كل فأر.
    ملاحظة: الحل السائل يتصلب بسرعة على سطح العين في RT. تأثير إصابة القرنية يعتمد على شدة الجرح. بعد تطبيق واحد من حل تاموكسيفين / DMSO لم يلاحظ أي آثار سلبية في الفئران. في حالة الطلبات المتكررة يمكن ملاحظة عتامة القرنية.
  6. تواصل مع إعداد الأنسجة والتصوير (انظر الفرعالأيونات 5 و 6) في نقطة زمنية ذات الصلة. للحصول على نتائج المعروضة هنا والتضحية الفئران (كما هو مفصل في المرحلة 5،1) أسبوع واحد جرح آخر (الشكل 2 و 24).

Representative Results

في الآونة الأخيرة، ونحن تهدف إلى التعرف على مصادر والبقاء والهجرة من الخلايا الجذعية والخلايا الاصلية للظهارة القرنية 24. تراكم الأدلة تدعم العقيدة التي يتم إعادة ظهارة القرنية عن طريق الخلايا الجذعية الموجودة حصرا في محراب الحوفي، وهو على شكل منطقة الدائري في محيط القرنية. ويدعم هذه النظرية في التجارب المختبرية والبيانات الجسم الحي، والأدلة السريرية التي وفرت الأساس لالرائد الجذعية الحوفي العلاج بالخلايا الناجح 27-29. ومع ذلك، بقي هذا الموضوع المثير للجدل في السنوات الأخيرة نتيجة لدراسة بناء على تجارب التطعيم الحوفي أن اقترح أن حوف الماوس لا يشارك في تجديد القرنية 30. لاختبار هذه الفرضية مثيرة للاهتمام، النسب تتبع التجارب باستخدام أجريت الفئران R26R-النثار، لمتابعة مصير الخلايا الظهارية الجذعية / السلف الحوفي والقرنية في ظل ظروف مستقرة لمدة تصل إلى 120 يوما 24.ومنزوعة النواة عيون وحللت جبل مسطحة القرنيات التي كتبها متحد البؤر الطيفية المسح بالليزر مضان المجهر 10 و 120 يوما حقن آخر تاموكسيفين. كما هو متوقع، لوحظت مجموعات متفرقة صغيرة من الخلايا الفلورسنت في جميع أنحاء سطح العين بعد 10 يوما الحقن، بينما في وقت لاحق 1-4 أشهر (الشكل 2B و 24)، والشرائط ممدود التي تمتد من حوف نحو مركز القرنية وضعت ببطء. وتشير هذه النتيجة إلى أن القرنية يتم إعادة الخلايا التي تهاجر من حوف نحو مركز القرنية. بعد ذلك، تم فحص تجديد القرنية في ظل ظروف اصابة. من أجل اختبار مصير الخلايا القرنية / الحوفي K14 إيجابية في ظل الظروف اصابة بينما يحفز تتبع الخلية فعالة، فإننا حل تاموكسيفين في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)، والذي يسبب إصابة القرنية عند التطبيق الموضعي. بهذه الطريقة تمكنا من إحداث إصابة خفيفة إذا تم تطبيق التطبيق الموضعي واحد (الشكل 2C)، مو derate من اصابة إذا تم تطبيق إضافية DMSO وحدها العلاج في اليوم قبل تاموكسيفين تحريض أو الجرح الشديد عندما DMSO وحده يطبق موضعيا في 2 أيام متتابعة قبل تاموكسيفين الاستقراء.

وعلى النقيض من خطوط رقيقة الحوفي التي وضعت ببطء وصلت إلى مركز القرنية في غضون 4 أشهر في ظل ظروف الحالة المستقرة، وكانت الهجرة الخلية بعد الاصابة السريعة. اللافت للنظر أنه المشارب الحوفي طويلة وسميكة وضعت بالفعل في ظل هذه الظروف خلال 7 أيام. ومن المثير للاهتمام، وتنوع الألوان الحد الأدنى في بعض الأحيان (الشكل 2D). في أيدينا، وأحيانا، لا سيما وقد تم تحديد خلايا الدم الحمراء في القرنية بأكملها، مشيرا إلى أن تنوع الألوان يمكن أن يكون متحيزا نحو fluorophores محددة. هذا التحيز غير المرغوب فيها يمكن معايرة عن طريق اختبارات الاستجابة للجرعة كما ذكرت سابقا في Br1.0L 31 و 21 في Br2.1.

ليه / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
الشكل 1. توضيح تخطيطي لبناء R26R-النثار. (A) يحتوي بناء R26R-حلويات المروج CAG لمستويات التعبير عالية، وloxP (المثلث الأسود) -flanked الجدد R -roadblock والكاسيت Brainbow2.1 في موضع Rosa26 16،21. يتضمن الكاسيت Brainbow2.1 اثنين من الرأس إلى الذيل dimers-يحيط loxP. يتكون احدة ديمر البروتين المترجمة النووية الفلورية الخضراء (GFP) والموجهة العكسية حشوية الأصفر البروتين الفلوري (YFP، تم تعيينه التوجه المقلوب - PFY). يحتوي على ديمر الثاني RFP حشوية والموجهة العكسية غشاء المربوطة البروتين سماوي نيون (CFP، تم تعيينه التوجه المقلوب - PFC) 16. (B - E) عند تفعيل لجنة المساواة العرقية-recombinase، قد تحدث الختان وانعكاس مختلف الأحداث. النتائج المحتملة هي exemplifiإد في B - E. النشاط جنة المساواة العرقية يدفع إعادة ترتيب ستوكاستيك من الكاسيت مما يؤدي إلى إزالة الجينات و / أو العكس، وبالتالي النتائج في التعبير عشوائي واحد من البروتينات الفلورية الأربعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الرقم 2. النسب القرنية البحث عن المفقودين تحت التوازن والإصابات. R26R-حلويات / تم حقن الفئران K14-لجنة المساواة العرقية مع 4 ملغ تاموكسيفين كما هو مفصل في البروتوكول. في الوقت المشار إليه وظيفة في نقاط سوت تحريض تم تصوير القرنيات (A - B). وقد تحقق جرح القرنية بالإضافة إلى لجنة المساواة العرقية تحريض من قبل التطبيق الموضعي للتاموكسيفين الذائبة في DMSO (C - D). صور فسيفساء التي تم الحصول عليهاعن طريق الأقنية تبليط الطيفي متحد البؤر المجهري تظهر (A - D). في التوازن، والمشارب الحوفي شعاعي من الخلايا المهاجرة بطيئة امتدت بين حوف ومركز القرنية. هذه المشارب تطورت ببطء، ووصلت إلى مركز القرنية في غضون 4-5 أشهر (B). وكانت مجموعات من الخلايا القرنية واضحة وكذلك (السهام البيضاء، B). في المقابل، ظهرت الشرائط الحوفي كبيرة خلال أسبوع واحد في ظل ظروف اصابة (C). مثالا للانحياز تنوع الألوان نحو خلايا الدم الحمراء (D). والمشروح الحدود بين الحوفي القرنية بواسطة خط متقطع. شريط المقياس هو 500 ميكرون. الاختصارات: CFP، ببروتين سماوي. GFP والبروتينات الفلورية الخضراء. طلب تقديم العروض، بروتين أحمر فلوري. YFP، بروتين فلوري الأصفر. تم تعديل هذا الرقم من 24 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.

Discussion

وقد أجريت النسب تتبع تجارب لسنوات عديدة. التحسينات التكنولوجية الحديثة وظهور سلالات الفئران النثار فتحت آفاقا جديدة للبحث. اليوم، يمكن للباحثين الاستفادة من عدد كبير من المتاحة تجاريا خطوط جنة المساواة العرقية الأنسجة محددة، الفئران خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا. وهذا يوفر فرصة لتصميم النظم التجريبية تنوعا لمعالجة المسائل العلمية ذات الخبرة الأساسية، وتجنب ممارسة شاقة، مع توفير بيانات موثوقة ويمكن الاعتماد عليها.

الفئران R26R-النثار هي أداة ذكية لتتبع كفاءة ودراسة طبيعة وسلوك الخلايا في كائن حي. هذا النظام هو من السهل اقامة وأنه يتيح تتبع النسب غير الغازية من الخلايا واحدة خلال مرحلة التطور الجنيني، تنبع تجديد الخلايا تحت التوازن، أو في ظل ظروف مختلفة مثل الإصابات والالتهابات والسرطان. يوفر البيانات التي يمكن الحصول عليها من المكتوية قويأيون بقاء الخلايا المستهدفة، والتوسع خلية نسيلي والهجرة الخلية، بطريقة قابلة للقياس الكمي. ومن شأن خطوة حاسمة تتمثل في اختيار سلالة الماوس الوراثي المناسب الذي يمكن أن تسمح موثوق وضع العلامات المحددة الأنسجة فعالة في مرحلة تنموية دقيقة. واحد الحد من هذا النظام هو أن لرصد كائن حي، يجب أن تكون الأنسجة الوصول وشفاف. وبالمثل، تتبع الأنسجة السميكة داخل الحيوانات الحية قد يتيسر إلا من قبل اثنين من الفوتون أو متعدد الفوتون المجهري. ومع ذلك، تتبع الخلية ممكن على أقسام الأنسجة بعد الوفاة وربما أنسجة سليمة يمكن دراستها بعد أن تم تحويله لتصبح شفافة من خلال طريقة وضوح 32،33. قيود أخرى ينبغي النظر فيها هو أنه على الرغم من الخلايا المجاورة التي تعبر عن نفس fluorophore المرجح تنتمي إلى نفس النسب نسيلي، فمن الممكن أيضا أن أنها قد تكون مشتقة من الأصل خلية المستقل الذي أعرب عشوائيا نفس الجين الفلورسنت. هذا possibiliيصبح تاي المستبعد جدا عند استخدام عدة الأليلات برازيلي للسماح العديد من تركيبات الألوان.

في المستقبل، والجمع بين نظام النثار مع الأدوات الوراثية المتاحة (أي خروج المغلوب، ونماذج الماوس knockin والمعدلة وراثيا) سوف تسمح للدراسة الجينات والطفرات في الصحة وعلم الأمراض. وعلى نحو مماثل، نسب تتبع تحت اضطرابات النظام المختلفة (أي وقف تدمير مكانة الخلية، الليزر بوساطة الخلايا الاجتثاث، علاج إدمان المخدرات) سيجلب رؤى جديدة على تورط مسارات إشارات في اتخاذ القرارات مصير الخلية. في نهاية المطاف، واستخدام اندماجي لوضع العلامات الفلورية وتلألؤ بيولوجي، وصحفيين الجيني للمسارات إشارات وأحدث المجهر توفر الباحثين جود نظام دقيق لمعرفة كيفية الخلايا وحيدة الرد على المحيطة بها في بيئتها الأصلية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette Jackson strain #013731
K14-CreERT mice Jackson strain #005107
tamoxifen Sigma T5648
isoflurane USP Terrell Piramal Critical Care
Carprieve 30 b.wt
DMSO Sigma D2650
DAPI Sigma D9542 used at concentration of 4 µg/ml
Immu Mount Thermo Scientific 9990402
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage Zeiss The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Imaging Software Zeiss
Duratears-eye ointment Alcon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
  2. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  3. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
  4. Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
  5. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
  6. Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
  7. Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
  8. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
  9. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).
  10. Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
  11. Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
  12. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  13. Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
  14. Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
  18. Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. 763-769 (2011).
  19. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
  20. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
  21. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  22. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
  23. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  24. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
  25. Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
  26. Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).
  27. Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
  28. Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
  29. Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
  30. Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
  31. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  32. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
  33. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats