Метод Lineage Tracing из клетки роговицы, используя Multi-Color Люминесцентная Reporter Мышей

1Department of Genetics and Developmental Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology, 2Department of Ophthalmology, Hillel Yaffe Medical Center, 3Bioimging Center, Biomedical Core Facility, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally
Published 12/18/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Amitai-Lange, A., Berkowitz, E., Altshuler, A., Dbayat, N., Nasser, W., Suss-Toby, E., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. J. Vis. Exp. (106), e53370, doi:10.3791/53370 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Во время эмбрионального развития, тканей и органов морфогенез состоится через четкой программой, которая может быть описана в терминах клеточной пролиферации, миграции клеток и спецификации клонов 1-4. Эти биологические процессы также участвуют в поддержании гомеостаза взрослых тканей, что требует регенерации стволовых клеток. Lineage трассировка, идентификация и отслеживание потомства определенного типа клеток населения, является важным инструментом для изучения эмбриогенеза и гомеостаза клетки стволовые. Действительно, все чаще используется во многих областях исследований. В частности, линия трассировка стала важным инструментом в определении происхождения и судьбы стволовых клеток в гомеостаза и рака развития. Это потому, что он может предоставить важную информацию о том, как ведет себя клетка в контексте интактной ткани или организма, с минимальным вмешательством экспериментальной, в отличие от выделения клеток в пробирке и культуры или transplantatiна что может привести к нежелательной предвзятости.

Традиционно, красители, такие как жирорастворимые карбоцианиновых, которые включают в плазматической мембране клеток, были использованы для отслеживания клонов. Хотя эти типы экспериментов успешно привели к серьезным открытий и формы семенных концепций в биологии развития 5,6, они имеют некоторые ограничения, в том числе трудности для контроля специфичности клеток-мишеней, нежелательного воздействия красителя на поведение клеток и разведении этикетки с течением времени. Нуклеотидные подходы аналог маркировки позволили документирования существование медленной езды на велосипеде "ярлык сохраняя клетки", что по-видимому соответствуют покоя стволовых клеток 7,8. Тем не менее, в то время как этот метод может показать наличие медленных велосипедных элементов на основе распространения кинетики в течение ограниченного периода времени она не могла обеспечить существенные идеи относительно функциональности стволовых клеток. Оптимальное отслеживание происхождение метгии должны свести к минимуму влияние маркировки о свойствах отмеченной ячейке, ее потомства, или его соседей. Кроме того, было бы полезно иметь контроль над индукции маркировки, а именно, чтобы иметь возможность помечать клеточной популяции интереса на этапе и времени зависимым образом, а также в одной ячейке (клонального) образом. Стабильная и необратимый метод маркировки, которая передается на все потомство основателя ячейки важно, чтобы этикетка будут сохранены в течение долгого времени, и не передается в соседние клетки.

Совсем недавно были разработаны генетические подходы этикетки клеток. В этих системах, промоторы клеток могут быть использованы, чтобы вызвать экспрессию рекомбиназы Cre, чтобы удалить LoxP-пропускной пункт по бокам и позволить экспрессию репортерных генов, таких как зеленый флуоресцентный белок или Β-галактозидазы репортерных генов 9-13. Такой подход позволяет не только отслеживать клеток и их потомства, но также позволяет клеткаolation и молекулярная характеристика. Отслеживание сотового на уровне одной клетки стало возможным с помощью индукции экспрессии одного флуоресцентного гена-репортера. Одним из важных ограничений этой системы является то, что только тогда, когда очень низкий процент клеток помечена можно отделить и отслеживать индивидуальных клонов. Чтобы преодолеть это ограничение разноцветными журналисты могут быть использованы. При использовании многоцветного мечения, отслеживание дифференциального судьбы соседних клеток в той же нише, может быть достигнуто эффективно 14-17. Недавно различные Brainbow (BR) аллелей были разработаны для отслеживания клона экспериментов, позволяя стохастический экспрессию нескольких флуоресцентных репортерных генов, использующих систему Cre / LOX. Система Cre / LOX состоит из рекомбиназы фермента Cre, который распознает и связывается с специфических последовательностей ДНК, таких как сайты LoxP. После связывания Cre рекомбиназой, конкретного участка рекомбинация происходит, что приводит к последовательности удаление LoxP окружении resultinг в случайном экспрессии различных флуоресцирующих белков (механизм описан ниже). Разнообразие Br линий доступны для использования (см отзывы 16,18,19). Основные различия между штаммами Br включают (I) различия в количестве люминесцентных генов, включенных в кассете, от 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) флуоресцентных генов , (II) наличие взаимно ориентированных сайтов LOX, чтобы позволить инверсию гена (Br2.0-2.1), (III) тип LOX сайтов, используемых, и (IV) выражение или молчание экспрессии гена флуоресцентного до Cre активации. Недавно созданный Br3 предлагает улучшенный способ многоцветной визуализации нейронов. Один из основных особенностей этой стенограммы, что она содержит новый набор фотостабильных farnesylated флуоресцентных белков, которые позволяют еще окрашивание лучших нейронов обрабатывает 20.

Важно отметить, что различные версии Br кассет может содержать нейронную специфику Thy1 прomoter или повсеместно выразил CAG (ЦМВ) промотор. Наконец, в то время как некоторые из трансгенных мышей Br может содержать один Br трансген, другие могут состоять из нескольких трансгенных копий, тем самым позволяя производство огромного числа возможностей для цветовых комбинаций должен быть выражен в каждой клетке (например, см 16).

В нашем исследовании мы использовали мышь R26R-Confetti, который содержит Br 2,1 кассету 21. Br2.1 однозначно разработан, чтобы позволить Cre-опосредованные инверсии ДНК и не только из-за эксцизии обратной ориентации LoxP сайтов (рисунок 1). Таким образом, эти инверсии / вырезания события, которые приводят к изменению цвета можно продолжать так долго, как Cre присутствует 16. По этой причине, индуцируемый временная система экспрессии Cre важно для надежного отслеживания клеток с использованием Br2.1. Как показано на рисунке. 1, то Br2.1 содержит вездесущий промотор CAG последующим LoxP-окружении Нео R -casseTTE, который действует как транскрипционный контрольно-пропускном пункте, который затем в течение 4 флуоресцентных генов-репортеров, кодирование для зеленого (GFP), желтый (YFP), красный (RFP) и голубой (СФП) флуоресцентные белки, расположенных в двух тандемов. Нет флуоресценции не выражается до Cre активации. Индукция Cre рекомбиназы вызывает удаление кассеты нео-R, позволяющей случайную экспрессию одного из 4-х флуоресцентных белков в данной клетке. Первый сегмент содержит LoxP-окружении GFP и обратную YFP, в то время как второй сегмент содержит LoxP-окружении RFP и обратную CFP. Эти сегменты ДНК могут быть инвертированы непрерывно (с помощью LoxP, которая находится в обратной ориентации), или вырезали, пока Cre рекомбиназа присутствует. Таким образом, переходные и контролировать Cre трансгена следует использовать. Кассета Br2.1 обеспечивает отличную систему для различения перекрывающихся выбросов от местоположения сигнала: выражение YFP ​​и ОПП цитоплазматический, то GFP ядерная и СФП связан с клеточной мембраной. GFPи RFP выбросы легко отделяются от обычной люминесцентной микроскопии. Для того чтобы отделить выбросов YFP / GFP / CFP, спектральный система конфокальной микроскопии необходимо. В общей сложности, кассета Br2.1 позволяет случайное, индуцируемый и тканеспецифическую выражению одного из четырех различных флуоресцентных генов в каждой клетки-мишени. В самом деле, когда большее количество цветовых комбинаций необходимо, можно генерировать гомозиготных мышей, которые содержат от 2 аллели Br2.1, что приводит к экспрессии 2 цветных меток для каждой ячейки и в увеличении числа возможных комбинаций цвета до 10 22. Некоторые из штаммов Br мыши позволяют выражение гораздо большему числу возможных цветовых комбинаций, так как множественные копии кассеты были интегрированы в их геном 16. Тем не менее, в большинстве случаев, четыре цветовые комбинации, представленные одной Br2.1 аллеля являются достаточными. После протоколом, здесь можно установить этот метод с использованием относительно простой установку Спектраль микроскопии с мало, если какой-либо необходимости для калибровки.

Здесь мы предлагаем адаптируемый протокол для использования мышей R26R-конфетти, которые содержат одну аллель Br2.1, для отслеживания клона экспериментов эпителия роговицы. Это трансгенный штамм мыши была использована для изучения происхождения и судьбы толстой кишки 21,23 и роговицы эпителиальных стволовых клеток 22,24, наличие стволовых клеток в деятельности рака кишечника 25 и для характеристики почек подоцита в фокальной-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) 17.

Protocol

О себе этика: В этом исследовании ухода за животными и использования были подобными Заявление ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research. Все эксперименты были одобрены местным комитетом по этике.

1. выбрать подходящий CRE-рекомбиназу выражая мыши штамм

  1. Из-за большого разнообразия Cre трансгенных линий, доступных для покупки 26 и в зависимости от целевой ткани для исследуемого, выберите Cre напряжение трансгенной мыши, у которых ген рекомбиназа Cre контролируется промотором, который является специфичным для интересующей ткани. В случае временной контроль необходим, выберите индуцибельную линию CRE.
    Примечание: Мы выбрали тамоксифен индуцибельную К14-Cre ERT трансген специально маркировать лимбальных и роговицы эпителиальных стволовых клеток / клеток-предшественников 24. Обратите внимание, что там может быть различия между штаммами, а Ди Джироламо и соавторы сообщили лимбальной специфику, не роговицы выражения для их K14-Cre ERT 22. Преимущество использования индуцибельные трансгенных мышей CRE, что она позволяет индукцию линии трассировки на универсальных временных рамок.

2. Выберите подходящий штамм Br Mouse

  1. Выберите подходящий Br кассету в зависимости от исследования вопроса и доступной Cre линии 16,18,20.
    1. Если используется неиндуцибельных штамм Cre мыши, выберите кассету Br, что не позволяет непрерывные ДНК инверсий / эксцизии и, таким образом, привести к возникновению тупиковых продуктов (например Br1.0 или Br1.1) 16.

3. Крест трансгенных линий интереса

  1. Для протокола, показанного здесь, пересечь гомозиготную R26R-Confetti напряжение (Br2.1 / Br2.1) с гомозиготной Cre ERT деформации (CRE ERT / Cre ERT) для получения гемизиготных отпрысков (Br2.1 / +; Cre / +) что готовы к моно-аллельный линии трассировки, как все они содержат один аллель Br2.1 и аодин аллель CRE.
    Примечание: Для повышения эффективности маркировки, можно генерировать мышей, которые содержат два аллеля CRE (Br2.1 / +; Cre / CRE), в то время как два аллеля Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) будет увеличить цветовые сочетания (как описано в 22).

4. Cre-рекомбиназа Индукционная

Примечание: Администрация тамоксифен в этих экспериментах проводили путем ежедневного внутрибрюшинного введения, в течение всего срока 3-4 дней, с тем чтобы побудить транслокации Cre ERT рекомбиназы в ядро лимбальных и роговицы базальной К14-положительные стволовых / клеток-предшественников эпителиальные клетки. Следующий протокол может быть использован для введения четыре мышей. Кроме того, местное применение тамоксифена на глазной поверхности приводит более высокую эффективность. Решение Тамоксифен может храниться в темноте при 4 ° С в течение одной недели. Теплый раствор перед использованием.

  1. Взвешивают 100 мг тамоксифена и растворить его в 5 мл кукурузного масла вобразуют 20 мг / мл раствора тамоксифеном.
  2. Вводят 200 мкл тамоксифена (4 мг) раствор внутрибрюшинно 8 недель мышей в течение 3-4 последовательных дней.
    Примечание: Решение Тамоксифен может храниться в темноте при 4 ° С в течение до одной недели. Теплый раствор перед использованием.
  3. Для местного применения: взвешивание 60 мг тамоксифена и растворить его в 1 мл кукурузного масла, чтобы сформировать 60 мг / мл раствора тамоксифеном. Вихревой и установить решение в встряхивании на водяной бане, поддерживаемой при 65 ° С до тех пор, пока не станет ясно отпуск его в ванну до использования.
    1. Осторожно применять 100 мкл раствора Тамоксифен каждой поверхности глаза мыши.

5. Подготовка ткани для визуализации

  1. Жертву животных с использованием изофлуран (2% кислорода испаряется в) анестезии (обезболивания подтвердить правильность отсутствием рефлексов) с последующим СО 2 ингаляции в соответствующих точках времени после инъекции и тамоксифена ColLect соответствующую ткань.
    1. В этих экспериментах, выяснять глаза в следующих временных точках: 1, 4, 8, 12 и 16 недель после инъекции тамоксифен. Добиться энуклеацию с помощью изогнутых щипцов. Нажмите веки, вызывая глазное яблоко, чтобы выскочить из глазницы. Поместите щипцы позади глазного яблока, проведение зрительный нерв. Осторожно потяните глазное яблоко и отсоедините его.
      Примечание: На этом этапе, как описано ниже, ткани могут быть подготовлены для анализа Wholemount меченых клеток. Обычные замороженных срезов также могут быть получены, фиксируется в PFA и отображаемого как описано ниже (см раздел 6 и 22).
  2. Поместите каждый глаз в 60 мм блюдо, наполненный PBS.
  3. Под микроскопом стерео-помощью щипцов держать глаз около зрительного нерва с роговицей вниз и использовать скальпель, чтобы удалить зрительный нерв, мышцы и соединительной ткани и сделать небольшой разрез в задней части глаза.
  4. Использование пружинных ножниц тщательно увеличитьсократить позволяя объектив поп и удалить диафрагму с помощью щипцов.
  5. Свести роговицы, делая 4-5 радиальных разрезов, начиная от центра к периферии, используя скальпель.
  6. Используйте скальпель, чтобы сократить избыток периферических тканей за лимба.
  7. Исправление роговицы в 4% PFA в течение 10 мин, затем кратковременно промыть их PBS.
  8. Инкубируйте образцы с DAPI в течение 10 мин и кратко промыть PBS.
  9. Mount роговицы на стеклах с эпителиальной стороной вверх. Поместите каплю монтажа СМИ на верхней части роговицы и крышкой с крышкой стекла. Пусть слайды сухой O / N в РТ. Держите слайды при 4 ° С.

6. конфокальной микроскопии и обработки изображений Анализ

  1. Используйте спектральный систему конфокальной который позволяет разделение выбросов YFP / GFP / CFP. Набор возбуждения флуоресценции и длины волн излучения в зависимости от флуоресцентных белков кассеты Br. Выберите наиболее подходящий длины волны возбуждения для каждого белка целью минимизации крествозбуждение. Выбрать узкие интервалы выбросов с целью минимизации утечки сигналов из разных белков.
    1. Для кассеты Br2.1, используйте следующий набор из возбуждения флуоресценции (Ex) и эмиссии (EM) в качестве отправной точки: DAPI - экс 405 нм / EM 420-480 нм, CFP - экс 458 нм / EM 470-500 нм, GFP - 488 нм экс / EM 497-508 нм, YFP - экс 514 нм / EM 529-540 нм, а ЗП - экс 561 нм / EM 575-615 нм.
  2. Для того, чтобы визуализировать большие площади ткани с высоким разрешением, приобретать плитку изображений. Для результатов, показанных на фиг.2А-В, образу весь роговицы путем получения массива 12 х 12 изображений, т.е. приобретают 144 полей (512 х 512), используя 4 флуоресцентных каналов в каждой области. В общей сложности собрать 576 изображений, а затем объединить.
  3. Чтобы исследовать локализацию меченых клеток в различных глубинах и сооружений ткани, получения изображений Z-Стек различных регионах, представляющих интерес. В порядке TО изображений всю глубину роговицы, приобретают 8 оптических срезов на 3 мкм интервалами. Ортогональные виды секций, собранных, а также проекций изображения на основе максимальной интенсивности могут быть построены с использованием обычных программного обеспечения визуализации 24.

7. повреждение роговицы в сочетании с тамоксифена индукции

  1. Анестезию мышей с изофлуран (2% испаренного кислорода) и управлять анальгетики (10 мг / кг Carpofen, подкожно). Подтвердите правильное обезболивания по останову до пят-пинча.
  2. Взвешивают 1 г порошка Тамоксифен и растворить его в 5 мл стерильной ДМСО с получением 200 мг / мл раствора концентрации.
  3. Теплый раствор тамоксифена до 65 ° С на водяной бане до тех пор, пока раствор станет прозрачным. Хранить раствор в ванну до использования.
  4. Применить глазную мазь с необработанной противоположной глаз, чтобы предотвратить обезвоживание во время анестезии. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не восстановил достаточную конСознание поддерживать грудины лежачее положение. Не вернуться мышей, которые перенесли глаз ранив в компании других мышей до полного восстановления. Мыши должны быть тщательно контролироваться после травмы. В этом случае они теряют больше, чем 10% от их веса тела, страдают от эрозии роговицы, или дискомфорт, эксперимент должен быть остановлен. Повторите введение анальгетиков каждые 24 ч в течение всего эксперимента.
  5. Используя стерильный шприц, без иглы, прикрепленной к ней; применять 200 мкл раствора тамоксифен местно по всей поверхности роговицы одного глаза каждой мыши.
    Примечание: жидкий раствор быстро затвердевает на поверхности глаза при комнатной температуре. Эффект роговицы травмы зависит от тяжести раны. После одного применения раствора Тамоксифен / ДМСО никаких неблагоприятных эффектов не наблюдалось у мышей. В случае повторных применений помутнение роговицы может наблюдаться.
  6. Продолжить с подготовкой ткани и визуализации (смионы 5 и 6) в соответствующих временных точках. Для того чтобы результаты, показанные здесь, пожертвовать мышей (как описано в стадии 5.1) одну неделю после ранения (рис 2 и 24).

Representative Results

В последнее время мы нацелены на выявление происхождения, выживание и миграцию стволовых клеток и клеток-предшественников эпителия роговицы 24. Накопленные данные подтверждают догмат, что эпителий роговицы регенерируется стволовыми клетками, расположенными исключительно в нише, лимбальных кольцевой формы зоны на периферии роговицы. Эта теория подтверждается в пробирке и в естественных условиях данных, и клинических данных, что обеспечило основу для успешного новаторской терапии лимбальных стволовых клеток 27-29. Тем не менее, эта тема оставалась широко обсуждаемого в последние годы из-за исследования, основанного на лимбальных эксперименты прививки, которые предложили, что лимба мыши не участвует в роговицы обновления 30. Чтобы проверить эту интересную гипотезу, Lineage трассировки эксперименты с использованием мышей были выполнены R26R-конфетти, следить за судьбой лимбальных и клеток роговицы эпителиальных стволовых / прогениторных в стационарных условиях в течение до 120 дней 24.Глаза были энуклеировали и плоский монтажа роговицы были проанализированы с помощью спектрального конфокальной флуоресцентной микроскопии лазерного сканирования 10 и 120 дней после тамоксифена инъекции. Как и ожидалось, малые спорадические кластеры флуоресцирующих клеток наблюдалось на протяжении глазной поверхности 10 дней после инъекции, в то время как 1-4 месяцев (фиг.2В и 24), удлиненный полосы, которые проходят от лимба к центру роговицы медленно разработаны. Этот результат позволяет предположить, что роговица регенерируют клетки, которые мигрируют от лимба к центру роговицы. Далее, роговицы регенерации под ранив условиях исследовали. Для того, чтобы проверить судьбу К14-положительных лимбальных / клеток роговицы под ранив условия, а заставить эффективное отслеживание клеток, мы распустил тамоксифен в диметилсульфоксиде (ДМСО), который вызывает повреждение роговицы при местном применении. Таким образом, нам удалось вызвать умеренную ранения если один местное применение было применены (рис 2С), Mo уменьшайте ранив если дополнительная одиночку ДМСО лечение применяется в день до тамоксифена индукции или тяжелого ранения, когда ДМСО в одиночку местно применяемых в 2 последовательных дней до индукции тамоксифена.

В отличие от тонких полос, которые лимбальных медленно, разработанных и достигнутых роговицы центр в течение 4 месяцев в стационарных условиях, миграция клеток после травмы было быстрым. Примечательно, длинные и толстые полосы на лимбе были уже разработали в этих условиях в течение 7 дней. Интересно, разнообразие цветов иногда минимальна (рис 2D). В наших руках, время от времени, в основном, красные клетки были выявлены во всей роговицы, указывая, что цвет разнообразие может быть смещен в сторону конкретных флуорофоров. Это нежелательное смещение может быть откалиброван с помощью тестов доза-ответ, как сообщалось ранее, в Br1.0L 31 и 21 Br2.1.

ле / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схематическое изображение конструкции R26R-конфетти. (А) R26R-конфетти конструкция содержит промотор CAG для высоких уровней выражение, LoxP (черный треугольник) -flanked Нео R -roadblock и кассеты Brainbow2.1 на Rosa26 локуса 16,21. Кассета Brainbow2.1 включает в себя два голова к хвосту LoxP-окружении димеры. Один димер состоит из ядерного локализованные зеленого флуоресцентного белка (GFP) и обратного-ориентированных цитоплазматической желтого флуоресцентного белка (YFP, то обратное ориентации обозначена - PFY). Второй димер содержит цитоплазматический RFP и обратный-ориентированных мембраной привязанные голубой флуоресцентный белок (CFP, то обратное ориентация обозначается - ПФК) 16. - Е) После активации Cre-рекомбиназы, может возникнуть различные иссечение и инверсии события; возможные результаты exemplifiред в B - E. Деятельность Cre вызывает перестройку стохастический кассеты, ведущей к генных абсорбции и / или инверсий и таким образом результаты в случайном выражению одного из четырех флуоресцентных белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Роговицы линия трассировки под гомеостаза и травмы. R26R-конфетти / мыши К14-Cre вводили 4 мг тамоксифена, как указано в протоколе. В указанное время после индукции точки плоской роговицы были обследованы - В). Роговицы ранения в сочетании с индукцией Cre было достигнуто путем местного применения тамоксифена, растворенного в ДМСО (C - D). Мозаичные изображения полученыпо многоканальному облицовка плиткой спектральной конфокальной микроскопии показано - Д). В гомеостаза, радиальные полосы на лимбе медленных мигрирующих клеток проходит между лимба и роговицы центра. Эти полосы развивалась медленно, достигая роговицы центр в течение 4-5 месяцев (B). Кластеры клеток роговицы были очевидны, а (белые стрелки, б). В противоположность этому, большие лимбе полосы появились в течение одной недели при ранении условий (С). Примером смещения цвета разнообразия к эритроцитов (D). Лимбальных-роговицы граница аннотированный пунктирной линией. Масштабная линейка 500 мкм. Сокращения: CFP, голубой флуоресцентный белок; GFP, зеленый флуоресцентный белок; RFP, красный флуоресцентный белок; YFP, желтый флуоресцентный белок. Эта цифра была изменена с 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюэта фигура.

Discussion

Lineage трассировки эксперименты были проведены в течение многих лет. Последние технологические усовершенствования и появление штаммов конфетти мыши открывает новые возможности для исследований. Сегодня исследователи могут извлечь выгоду из большого количества коммерчески доступных ткане-специфических Cre линии мышей с нокаутом, и трансгенных мышей. Это дает возможность для разработки универсальной системы для экспериментальных решении научных вопросов с основной экспертизы, избегая трудоемкого практику, обеспечивая надежные и достоверные данные.

Мышей R26R-Конфетти являются элегантный инструмент для эффективного отслеживания и изучения природы и поведения клеток в живом организме. Система легко устанавливается и позволяет неинвазивным клонов отслеживание отдельных клеток во время эмбриогенеза, стволовые клетки под регенерацию гомеостаза, или при других обстоятельствах, таких как травмы, воспаления и рака. Затем полученный данных обеспечивает надежную DESCRIPTион выживания клеток-мишеней, клональной экспансии клеток и миграции клеток, в количественной форме. Важным шагом будет выбрать подходящий генетический штамм мыши, что позволяет надежно разрешить эффективно тканеспецифическую маркировку в точном стадии развития. Одним из ограничений этой системы является то, что для мониторинга живой организм, ткань должна быть доступной и прозрачной. Точно так же, отслеживания толстый ткань в живом может быть только способствовали два фотона или нескольких фотонов микроскопии. Тем не менее, отслеживание сотового можно по разделам посмертных тканей и, возможно, неповрежденной ткани могут быть изучены после того, как был преобразован в стали прозрачными методом CLARITY 32,33. Другим ограничением, чтобы считать, что, хотя соседние клетки, которые экспрессируют один и тот же флуорофор вероятно, принадлежат к той же линии клональной, это также возможно, что они могут быть получены из независимого клеток происхождения, которые случайным образом выразил ту же флуоресцентный ген. Это possibiliти становится очень маловероятно, при использовании нескольких аллелей Br чтобы многочисленные цветовые комбинации.

В будущем, объединяя систему Confetti с имеющихся генетических инструментов (т.е., нокаут, Достучаться и трансгенных мышах) позволит изучение генов и их мутаций в области здравоохранения и патологии. Точно так же, линия трассировки при различных возмущениях системы (т.е., стволовые клетки уничтожение нишу, лазерная абляция опосредованной клеточной медикаментозное лечение) принесет новые идеи на пути участия в судьбе клеток решений сигнализации. В конечном счете, комбинаторной использование флуоресцентного и биолюминесценции маркировки, генетические корреспонденты сигнальных путей и передовые микроскопии обеспечит исследователям надежную систему, чтобы узнать, как один клетки реагируют на их окружения в их родной среде.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette Jackson strain #013731
K14-CreERT mice Jackson strain #005107
tamoxifen Sigma T5648
isoflurane USP Terrell Piramal Critical Care
Carprieve 30 b.wt
DMSO Sigma D2650
DAPI Sigma D9542 used at concentration of 4 µg/ml
Immu Mount Thermo Scientific 9990402
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage Zeiss The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Imaging Software Zeiss
Duratears-eye ointment Alcon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
  2. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  3. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
  4. Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
  5. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
  6. Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
  7. Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
  8. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
  9. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).
  10. Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
  11. Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
  12. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  13. Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
  14. Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
  18. Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. 763-769 (2011).
  19. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
  20. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
  21. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  22. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
  23. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  24. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
  25. Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
  26. Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).
  27. Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
  28. Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
  29. Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
  30. Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
  31. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  32. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
  33. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats