En metod för Lineage spårning av hornhinnan celler Använda Multi-färg Fluorescerande Reporter Möss

1Department of Genetics and Developmental Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology, 2Department of Ophthalmology, Hillel Yaffe Medical Center, 3Bioimging Center, Biomedical Core Facility, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally
Published 12/18/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Amitai-Lange, A., Berkowitz, E., Altshuler, A., Dbayat, N., Nasser, W., Suss-Toby, E., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. J. Vis. Exp. (106), e53370, doi:10.3791/53370 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Under fosterutvecklingen, vävnader och organ morfogenes ske genom ett detaljerat program som kan beskrivas i termer av celltillväxt, cellmigration och härstamning specifikation 1-4. Dessa biologiska processer är också involverade i att upprätthålla vuxna vävnadshomeostas, vilket kräver stamcells förnyelse. Härstamning spårning, identifiering och spårning av avkomman av en viss typ av cellpopulationen, utgör ett viktigt verktyg för att studera embryogenes och stamcells homeostas. I själva verket är det allt används i många forskningsområden. Särskilt blev härstamning spårning ett viktigt verktyg för att identifiera ursprung och öde stamceller i homeostas och cancerutveckling. Detta beror på att det kan ge viktig information om hur cellen fungerar inom ramen för den intakta vävnad eller organism, med minimal experimentella ingripande, i motsats till cellisolering och odling in vitro eller transplantatipå som kan resultera i oönskad förspänning.

Traditionellt färgämnen såsom lipidlösliga karbocyanin, som inkorporerar in i plasmamembranet hos celler, användes för härstamning spårning. Även om dessa typer av experiment har framgångsrikt lett till stora upptäckter och formade nyskapande begrepp inom utvecklingsbiologi 5,6, de har vissa begränsningar, bland annat svårigheten att kontrollera specificiteten hos målceller, den oönskade effekten av färgämnet på cellens beteende och utspädning av etiketten över tiden. Nukleotidanalog märkning metoder har gjort det möjligt att dokumentera förekomsten av slow-cykling "etikettkvarhållande celler" som förmodligen motsvarar vilande stamceller 7,8. Även denna teknik kan visa närvaron av långsamma cykel celler baserat på spridnings kinetik under en begränsad period inte kunde ge betydande insikter om funktionaliteten hos stamceller. En optimal härstamning spåra methodology bör minimera effekten av märkningen på egenskaperna hos den markerade cellen, dess avkomma eller dess grannar. Dessutom skulle det vara fördelaktigt att ha kontroll på märkningen induktion, nämligen att ha förmågan att märka cellpopulationen av intresse på en scen och tidsberoende sätt samt i en enda cell (klonal) sätt. En stabil och irreversibel metod märkning som förs vidare till all avkomma av grundaren cellen är viktigt så att etiketten skulle behållas över tiden, och inte överföras till angränsande celler.

På senare tid har genetiska metoder för cell märkning framtagen. I dessa system kan cellspecifika promotorer användas för att utlösa Cre-rekombinas uttryck i syfte att avlägsna en loxP-flankerad vägspärr och tillåta uttrycket av reportergener, såsom grönt fluorescerande protein eller Β-galaktosidas reportergenerna 9-13. Detta tillvägagångssätt möjliggör inte bara spårning av celler och deras avkomma utan tillåter även cell ärolation och molekylär karakterisering. Cell spårning vid enkelcellnivån blev möjligt genom induktion av expression av en enda fluorescerande reportergenen. En viktig begränsning av detta system är det faktum att endast när mycket låg procentandel av celler är märkt är det möjligt att separera och spåra individuella kloner. För att övervinna denna begränsning multicolor reportrar kan användas. När du använder flerfärgad märkning, kan uppnås spårning av differential öde angränsande celler i samma nisch effektivt 14-17. Nyligen genomfördes en rad olika Brainbow (Br) alleler utvecklad för härstamning spåra experiment, vilket möjliggör en stokastisk uttryck av flera fluorescerande reportergener utnyttjar Cre / lox-systemet. Cre / lox-systemet består av Cre-rekombinas enzym, som känner igen och binder till specifika DNA-sekvenser såsom loxP-ställen. Efter bindningen av Cre-rekombinas, platsspecifik rekombination sker, vilket orsakar borttagning av loxP flankerad sekvenser resulting i slumpmässig expression av olika fluorescerande proteiner (mekanismen beskrivs nedan). En mängd olika Br linjer är tillgängliga för användning (se omdömen 16,18,19). De stora skillnaderna mellan Br stammar innefattar (i) skillnader i antalet fluorescerande gener som ingår i kassetten, från 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) till 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescerande gener (ii) förekomsten av ömsesidigt orienterade lox-ställen för att möjliggöra gen inversion (Br2.0-2.1), (iii) vilken typ av lox-ställen som används, och (iv) uttryck eller tystnad fluorescerande genuttryck före Cre aktivering. Den nyligen etablerade Br3 erbjuder en förbättrad metod för flerfärgsbildalstring av nervceller. Ett av de viktigaste inslagen i detta transkript är att det innehåller en ny uppsättning av fotostabil farnesylated fluorescerande proteiner, som gör det möjligt en jämn färgning av de finaste neuronala processer 20.

Viktigt, kan olika versioner av Br kassetter innehåller den neuronala specifika Thy1 promoter eller ubiquitously uttryckt CAG (CMV) promotor. Slutligen, medan några av de Br transgena möss kan innehålla en enda Br transgen kan andra består av flera transgena kopior, varigenom produktionen av ett enormt antal möjligheter för färgkombinationer skall uttryckas i varje cell (se till exempel 16).

I vår studie har vi använt R26R-konfetti mus som innehåller Br 2.1 kassetten 21. Br2.1 är unikt utformad så att Cre-förmedlad DNA-inversioner och inte bara excisioner grund för ömsesidigt orienteringen av loxP-ställen (Figur 1). Sålunda kan dessa inversion / excision händelser som leder till färgförändring fortsätta så länge som Cre är närvarande 16. Av den anledningen är en inducerbar temporal Cre-expressionssystem väsentliga för pålitlig cellspårning med användning Br2.1. Såsom visas i fig. 1, den Br2.1 innehåller en allestädes närvarande CAG promotor följt av loxP-flankerad Neo R -cassette, som fungerar som en transkriptions vägspärr, är den som följt av 4 fluorescerande reportergener, som kodar för grönt (GFP), gul (YFP), röd (RFP) och cyan (GFP) fluorescerande proteiner, placerade i två tandem. Ingen fluorescens uttrycks före Cre aktivering. Induktion av Cre-rekombinas förorsakar avlägsnandet av Neo-R-kassetten möjliggör slumpmässig expression av en av de 4 fluorescerande proteinerna i en given cell. Det första segmentet innehåller loxP-flankerad GFP och en omvänd YFP, medan det andra segmentet innehåller loxP-flankerad RFP och en omvänd GFP. Dessa DNA-segment kan kontinuerligt inverteras (med användning av loxP som är i omvänd orientering) eller exciderad, så länge som Cre-rekombinas är närvarande. Därför bör en övergående och kontrollerad Cre transgen användas. Den Br2.1 kassetten ger ett utmärkt system för att skilja mellan överlappande utsläpp vid signal plats: ett uttryck för YFP och RFP är cytoplasma, GFP är kärnkraft och den gemensamma fiskeripolitiken är bunden till cellmembranet. GFPoch RFP utsläpp separeras lätt genom konventionell fluorescensmikroskopi. För att separera YFP / GFP / GFP utsläpp, behövs en spektral konfokalt avbildningssystem. Sammantaget tillåter Br2.1 kassetten slump, inducerbar och vävnadsspecifikt uttryck av en av fyra distinkta fluorescerande gener i varje riktad cell. Faktum är att när ett större antal färgkombinationer som behövs, kan en generera homozygot möss som innehåller 2 alleler av Br2.1, vilket sålunda resulterar i uttrycket av 2 färg taggar för varje cell och för att höja antalet möjliga färgkombinationer till 10 22. Några av de musstammar Br möjliggöra expressionen av ett mycket större antal möjliga färgkombinationer, eftersom flera kopior av kassetten integrerades i deras genom 16. Men i de flesta fall, de fyra färgkombinationer som tillhandahålls av en enda Br2.1 allel är tillräckliga. Efter det protokoll som avses här, kan man konstatera denna metod med hjälp av en relativt enkel installation av Spectral mikroskopi med lite om något behov av kalibrering.

Här ger vi ett anpassningsbart protokoll för användning av R26R-Konfettiar möss som innehåller en enda Br2.1 allel, för härstamning spårning experiment hornhinneepitelet. Denna transgen musstam har använts för att studera ursprung och öde kolon 21,23 och korneala epitelstamceller 22,24, närvaron av stamcellaktivitet i tarmcancer 25, och för att karakterisera njure podocyte i fokal segmental glomeruloskleros (FSGS) 17.

Protocol

Etik uttalande: I denna studie djuromsorg och användning var överensstämde med ARVO uttalande för användning av djur i Oftalmisk och Vision Research. Alla experiment har godkänts av den lokala etiska kommittén.

1. Välj en lämplig Cre-rekombinas Uttrycka musstam

  1. Ur den stora variation av Cre transgena linjer som finns att köpa 26 och beroende på målvävnaden som skall undersökas, välj en Cre transgen mus stam i vilken Cre-rekombinas-genen regleras av en promotor som är specifik för vävnaden av intresse. I behövs fall temporal kontroll, välj en inducerbar Cre linje.
    Obs: Vi valde tamoxifen inducerbart K14-Cre ERT transgen att specifikt märka limbala och hornhinneepitelceller stam / progenitorceller 24. Observera att det kan finnas skillnader mellan stammar, som Di Girolamo och medarbetare rapporterade limbal specificitet utan hornhinnan uttryck för sin K14-Cre ERT 22. En fördel med att använda inducerbara transgena Cre möss är att det tillåter induktionen av härstamning spårning vid mångsidiga tidsramar.

2. Välj en lämplig Br Mouse Strain

  1. Välj lämplig Br kassetten beroende på forskningsfråga och tillgängliga Cre linje 16,18,20.
    1. Om en icke-inducerbar Cre musstammen används, välj en Br kassett som inte tillåter kontinuerliga DNA inversioner / excisioner och därmed ge upphov till återvändsgränd produkter (t ex Br1.0 eller Br1.1) 16.

3. Korsa de transgena linjerna sevärdheter

  1. För protokollet visas här, korsa homozygota R26R-Confetti stam (Br2.1 / Br2.1) med den homozygota Cre ERT stam (Cre ERT / Cre ERT) för att erhålla hemizygot avkommor (Br2.1 / +; Cre / +) som är redo för mono-alleliska härstamning spåra eftersom de alla innehåller en enda Br2.1 allel och enenda Cre allel.
    Obs! För att öka effektiviteten av märkning, kan man generera möss som innehåller två Cre alleler (Br2.1 / +; Cre / Cre), medan två Br2.1 alleler (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) skulle öka färgkombinationer (som beskrivs i 22).

4. Cre-rekombinas induktion

Obs: administrering av tamoxifen i dessa experiment utfördes genom daglig intraperitoneal injektion, under varaktigheten av 3-4 dagar, för att inducera translokationen av Cre ERT rekombinas in i kärnan hos limbus och korneal basal K14-positiv stam / stamfader epiteliala celler. Följande protokoll kan användas för insprutning av fyra möss. Alternativt, lokal applicering av Tamoxifen till den okulära ytan ger högre effektivitet. Den Tamoxifen lösning kan förvaras i mörker vid 4 ° C i upp till en vecka. Värm lösningen före användning.

  1. Väg 100 mg Tamoxifen och upplösa den i 5 ml majsolja tillbildning av en 20 mg / ml tamoxifen lösning.
  2. Injicera 200 pl Tamoxifen (4 mg) lösning intraperitonealt till 8 veckor gamla möss i 3-4 dagar i följd.
    Anmärkning: Tamoxifen lösning kan förvaras i mörker vid 4 ° C i upp till en vecka. Värm lösningen före användning.
  3. För topisk applicering: väger 60 mg Tamoxifen och lös den i 1 ml majsolja för att bilda en 60 mg / ml tamoxifen lösning. Vortexa och ställa in lösningen i ett skakande vattenbad som hölls vid 65 ° C tills det blir klart ledighet det i badet fram till användning.
    1. Applicera försiktigt 100 pl av Tamoxifen lösning till varje ögonytan av musen.

5. Vävnadsberedning för Imaging

  1. Offer djur med användning av isofluran (2% förångas i syre) anestesi (bekräfta korrekt anesthetization av bristen av reflexer) följt av CO 2 inandning vid lämpliga tidpunkter efter Tamoxifen injektion och colLect den relevanta vävnaden.
    1. För dessa experiment enucleate ögon på följande tidpunkter: 1, 4, 8, 12 och 16 veckor efter Tamoxifen injektion. Uppnå enukleation med hjälp av böjda pincett. Tryck på ögonlocken orsakar ögongloben för att hoppa ut ur ögonhålan. Placera tången bakom ögongloben håller synnerven. Dra försiktigt ögongloben och lossa den.
      Anmärkning: I detta skede, såsom beskrivs nedan, vävnader kan förberedas för wholemount analys av märkta celler. Regelbundna frysta vävnadssnitt kan också framställas, fast i PFA och avbildas som beskrivs nedan (se avsnitt 6 och 22).
  2. Placera varje öga i en 60 mm skål fylld med PBS.
  3. Under ett stereomikroskop med hjälp av pincett hålla ögat nära synnerven med hornhinnan nedåt och använda en skalpell för att avlägsna synnerven, muskler och bindväv och göra ett litet snitt i den bakre delen av ögat.
  4. Använda våren sax försiktigt förstoraklippa låta objektivet hoppar ut och ta bort iris med hjälp av pincett.
  5. Platta hornhinnan genom att göra 4-5 radiella snitt med början från centrum mot periferin med hjälp av en skalpell.
  6. Använd en skalpell för att skära överskott perifera vävnaden bortom limbus.
  7. Fix hornhinnor i PFA 4% under 10 min, sedan kort tvätta dem med PBS.
  8. Inkubera proverna med DAPI för 10 min och kortfattat tvätta med PBS.
  9. Mount hornhinnor på objektglas med epitel sidan uppåt. Placera en droppe montering media ovanpå hornhinnan och täck med ett lock-glas. Låt bilderna torka O / N i RT Håll diabilder vid 4 ° C.

6. konfokalmikroskopi och bildanalys

  1. Använd en spektral konfokalt system som möjliggör separation av YFP / GFP / GFP utsläpp. Set fluorescensexcitation och emissionsvåglängder beroende på de fluorescerande proteinerna enligt Br kassetten. Välj den mest lämpliga excitationsvåglängden för varje protein som syftar till att minimera korsexcitering. Välj smala emissionsintervall för att minimera läckaget av signalerna från de olika proteinerna.
    1. För Br2.1 kassetten, använd följande inrättats av fluorescensexcitation (ex) och emission (em) som utgångspunkt: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, och RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
  2. För att visualisera stora vävnadsområden med hög upplösning, förvärvar kakel avbildning. För de resultat som visas i figur 2A-B, bild hela hornhinnan genom att erhålla en uppsättning av 12 x 12 bilder, dvs förvärva 144 fält (512 x 512) med 4 fluorescerande kanaler i varje fält. Sammanlagt samla 576 bilder och sedan slå ihop.
  3. För att undersöka lokaliseringen av märkta celler i olika djup och strukturer i vävnaden, förvärva z-stack bilder av olika regioner av intresse. För to bild hela djup hornhinnan, förvärva 8 optiska sektioner på 3 pm intervaller. Ortogonala utsikt över sektionerna insamlade samt bild prognoser baserade på högsta tillåtna kan konstrueras med användning av konventionella avbildnings programvaror 24.

7. hornhinneskadan kombinerat med Tamoxifen Induktion

  1. Söva möss med isofluran (2% förångas i syre) och administrera analgetika (10 mg / kg Carpofen, injiceras subkutant). Bekräfta korrekt anesthetization av okänslighet till tå-nypa.
  2. Väg 1 g av Tamoxifen pulver och lös den i 5 ml steril DMSO för att producera 200 mg / ml koncentration lösning.
  3. Värm Tamoxifen lösningen till 65 ° C i ett vattenbad tills lösningen blir klar. Förvara lösningen i badet fram till användning.
  4. Applicera ögonsalva till den obehandlade kontra ögat för att förhindra uttorkning under narkos. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt conmedvetslöshet att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka möss som hade genomgått öga såra till sällskap med andra möss tills återhämtat sig helt. Möss bör övervakas noga efter skadan. I fall de förlorar mer än 10% av sin kroppsvikt, lider av korneal erosion, eller obehag, bör försöket stoppas. Upprepa analgetika administration var 24 timmar under hela experimentet.
  5. Med hjälp av en steril spruta, utan en nål fäst vid den, tillämpa 200 pl Tamoxifen lösning lokalt över hela hornhinnans yta på ena ögat hos varje mus.
    Obs: Den flytande lösningen stelnar snabbt på ögats yta vid RT. Effekten av skada på hornhinnan beror på svårighetsgraden av såret. Efter en tillämpning av Tamoxifen / DMSO-lösning inga biverkningar observeras hos mössen. Vid upprepade ansökningar kan observeras hornhinnegrumling.
  6. Fortsätt med förberedelse och bildbehandling vävnad (se sektjoner 5 och 6) vid relevanta tidpunkter. För de resultat som visas här, offra mössen (som beskrivs i steg 5,1) en vecka efter sårskada (Figur 2 och 24).

Representative Results

Nyligen, vi syftar till att identifiera ursprunget, överlevnad och migration av stamceller och progenitorceller av hornhinneepitelet 24. Ackumulerande bevis stöder dogmen att hornhinneepitelet regenereras genom stamceller ligger uteslutande i limbal nisch, en ringformad zon på hornhinnans periferi. Denna teori stöds av in vitro och in vivo-data, och genom kliniska bevis som låg till grund för ett framgångsrikt banbrytande limbal stamcellsterapi 27-29. Förblev dock detta ämne mycket omdebatterat under de senaste åren på grund av en studie baserad på limbala ympning experiment som tydde på att musen limbus inte deltar i hornhinnan förnyelse 30. För att testa detta intressant hypotes, att härstamning spåra experiment med R26R-Konfettiar möss utfördes, följa öde limbala och korneaepitelet stam / progenitorceller under stationära förutsättningar för upp till 120 dagar 24.Ögon enukleation och platta montera hornhinnor analyserades genom spektral konfokal laserscanning fluorescensmikroskopi 10 och 120 dagar efter Tamoxifen injektion. Som väntat var små sporadiska kluster av fluorescerande celler observeras under hela den okulära ytan 10 dagar efter injektion, medan 1-4 månader senare (Figur 2B och 24), avlång strimmor som sträcker sig från limbus mot hornhinnans centrum utvecklas långsamt. Detta resultat tyder på att hornhinnan regenereras genom celler som migrerar från limbus mot centrum av hornhinnan. Därefter hornhinnan förnyelse enligt såra förhållanden undersöks. För att testa öde K14-positiva limbus / korneala celler under sårbildning förhållanden samtidigt inducera effektiv följcell, upplöst vi Tamoxifen i dimetylsulfoxid (DMSO), som orsakar skada på hornhinnan vid topisk applicering. På så sätt lyckades vi att framkalla lindrig sårskada om en enda topisk applicering applicerades (Figur 2C), mo stämpla ner sårade om ytterligare DMSO ensam behandling tillämpades i dagen innan Tamoxifen induktion eller svår sår när DMSO ensamt lokalt tillämpas i 2 sekventiella dagar före Tamoxifen induktion.

I motsats till de tunna limbala ränder som långsamt utvecklats och nått hornhinnans centrum inom 4 månader under stabila förhållanden, cellmigration efter skada var snabb. Anmärkningsvärt var långa och tjocka limbus ränder redan utvecklat under dessa förhållanden inom 7 dagar. Intressant, färg mångfald ibland minimal (figur 2D). I våra händer, ibland, främst röda blodkroppar identifierades i hela hornhinnan, vilket indikerar att färg mångfald kan vara partisk mot specifika fluoroforer. Denna oönskade fördomar kan kalibreras genom dos tester respons som tidigare rapporterats i Br1.0L 31 och i Br2.1 21.

les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk illustration av R26R-Confetti konstruktionen. (A) Den R26R-konfetti konstruktionen innehåller en CAG promotor för höga expressionsnivåer, en loxP (svart triangel) -flanked Neo R -roadblock och Brainbow2.1 kassetten på ROSA26 locus 16,21. Den Brainbow2.1 Kassetten innefattar två head-to-tail loxP-flankerad dimerer. En dimer består av kärn lokaliserad grönt fluorescerande protein (GFP) och en omvänd-orienterad cytoplasmatiskt gul fluorescerande protein (YFP, den inversed orienteringen betecknas - PU). Den andra dimer innehåller cytoplasma RFP och en omvänd orienterad membran bundna cyan fluorescerande protein (GFP, den inversed orienteringen betecknas - PFC) 16. (B - E) Vid Cre-rekombinas aktivering kan olika excision och inversions händelser inträffar; möjliga utfall är exemplified i B - E. Cre aktivitet inducerar stokastisk ombildning av kassetten som leder till gen flyttning och / eller inversioner och därmed resulterar i den slumpmässiga uttryck för en av de fyra fluorescerande proteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Hornhinnan härstamning spårning i homeostas och skador. R26R-konfetti / K14-Cre möss injicerades med 4 mg Tamoxifen som beskrivs i protokollet. I det angivna tidpunkter efter induktion tillplattad hornhinnor avbildades (A - B). Korneal sårbildning i kombination med Cre induktion uppnåddes genom topisk applicering av Tamoxifen löst i DMSO (C - D). Mosaic bilder erhållnaav flerkanalsplattsättning spektral konfokalmikroskopi visas (A - D). I homeostas, radiella limbus ränder av långsam migrerande celler utvidgas mellan limbus och hornhinnans centrum. Dessa ränder utvecklas långsamt, når hornhinnan centrum inom 4-5 månader (B). Kluster av hornhinnan celler var uppenbara samt (vita pilar, B). Däremot verkade stora limbus strimmor inom en enda vecka enligt såra betingelser (C). Ett exempel på partiskhet färg mångfald mot röda blodkroppar (D). Den limbal-hornhinnan gränsen kommenterad av en streckad linje. Skala bar är 500 pm. Förkortningar: GFP, cyan fluorescerande protein; GFP, grönfluorescerande protein; RFP, rött fluorescerande protein; YFP, gult fluorescerande protein. Denna siffra har ändrats från 24. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.

Discussion

Lineage spårande experiment har utförts i många år. Den senaste tidens tekniska förbättringar och framväxten av musstammar konfetti öppnat nya vägar för forskning. Idag kan forskare dra nytta av ett stort antal kommersiellt tillgängliga vävnadsspecifika Cre linjer, knockoutmöss och transgena möss. Detta ger en möjlighet för att utforma mångsidiga experimentella system för att hantera vetenskapliga frågor med grundläggande kompetens, undvika mödosam praxis, samtidigt som den ger robusta och tillförlitliga uppgifter.

R26R-Konfettiar möss är en elegant redskap för effektiv spårning och studera arten och beteendet hos celler i en levande organism. Systemet är lätt att etablera och det gör icke-invasiv härstamning spårning av enskilda celler under embryogenes, stamcells förnyelse enligt homeostas, eller under olika omständigheter såsom skada, inflammation och cancer. Den kan erhållas data ger en robust Uppgjon av överlevnaden av målceller, klonal expansion cell och cellmigration i ett kvantifierbart sätt. Ett kritiskt steg skulle vara att välja en lämplig genetisk musstam som tillförlitligt kan tillåta effektiv vävnadsspecifik märkning på en exakt utvecklingsstadium. En begränsning hos detta system är att för övervakning av en levande organism, måste vävnaden vara tillgängligt och öppet. På liknande sätt kan spåra en tjock vävnad i ett levande djur endast underlättas av två-foton eller multifoton mikroskopi. Men är det möjligt spårning cell på postmortem vävnadssnitt och kanske intakt vävnad kan studeras efter att den har transformerats för att bli tydligare genom CLARITY metoden 32,33. En annan begränsning som skall beaktas är att även om angränsande celler som uttrycker samma fluorofor hör sannolikt till samma klonala härstamning, är det även möjligt att de kan härledas från oberoende cellursprung som slumpmässigt uttryckte samma fluorescerande genen. Denna possibility blir mycket osannolikt när man använder flera Br alleler för att möjliggöra ett flertal färgkombinationer.

I framtiden kombinera Confetti systemet med tillgängliga genetiska verktyg (dvs. knockout, Knockin och transgena musmodeller) kommer att möjliggöra studier av gener och deras mutationer i hälsa och patologi. På samma sätt, härstamning spårning med olika systemstörningar (dvs stamceller nisch förstörelse, laser-medierad cell ablation, läkemedelsbehandling) kommer att ge nya insikter på medverkan av signalvägar i cellen öde beslut. I slutändan, den kombinatoriska användning av fluorescerande och mareld märkning, kommer genetiska reportrar signalvägar och banbrytande mikroskopi ge forskare ett robust system för att lära sig hur enstaka celler reagerar på sin omgivning i sin ursprungliga miljö.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette Jackson strain #013731
K14-CreERT mice Jackson strain #005107
tamoxifen Sigma T5648
isoflurane USP Terrell Piramal Critical Care
Carprieve 30 b.wt
DMSO Sigma D2650
DAPI Sigma D9542 used at concentration of 4 µg/ml
Immu Mount Thermo Scientific 9990402
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage Zeiss The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Imaging Software Zeiss
Duratears-eye ointment Alcon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
  2. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  3. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
  4. Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
  5. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
  6. Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
  7. Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
  8. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
  9. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).
  10. Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
  11. Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
  12. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  13. Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
  14. Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
  18. Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. 763-769 (2011).
  19. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
  20. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
  21. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  22. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
  23. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  24. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
  25. Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
  26. Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).
  27. Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
  28. Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
  29. Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
  30. Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
  31. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  32. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
  33. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats