Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

1Department of Genetics and Developmental Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology, 2Department of Ophthalmology, Hillel Yaffe Medical Center, 3Bioimging Center, Biomedical Core Facility, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion, Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally
Published 12/18/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Amitai-Lange, A., Berkowitz, E., Altshuler, A., Dbayat, N., Nasser, W., Suss-Toby, E., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. J. Vis. Exp. (106), e53370, doi:10.3791/53370 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Embriyo gelişimi sırasında, doku ve organ morfogenez hücre proliferasyonu, hücre göçü ve soy tarifnamede 1-4 cinsinden tanımlanabilir kesin bir program sayesinde yer almaktadır. Bu biyolojik süreçler de hücre yenilenmesini kök gerektirir yetişkin doku homeostazını, muhafaza katılmaktadırlar. Lineage izleme, kimlik ve hücre popülasyonunun belirli bir tip soyu takibi, embriyojenezi okuyan ve hücre homeostazı kök için önemli bir araç sunmaktadır. Gerçekten de, giderek araştırmanın pek çok alanında kullanılmaktadır. Özellikle, soy izleme homeostasis ve kanser gelişiminde kökeni ve kök hücrelerin kaderini belirlemede önemli bir araç haline geldi. Hücre izolasyonu ve in vitro kültürü veya transplantati içinde aksine minimal deneysel müdahale ile hücre sağlam doku veya organizmanın bağlamında nasıl davranacağını hakkında önemli bilgiler sağlayabilir Bunun nedeniBu istenmeyen önyargı neden olabilir.

Geleneksel olarak, hücrelerin plazma zarına dahil, lipid çözünür karbosiyanin boya olarak, soy izleme için kullanıldı. Deneylerde bu tür başarılı gelişim biyolojisi 5,6 önemli keşifler ve şekilli seminal kavramlara yol açmıştır rağmen, hedeflenen hücrelerin özgünlüğünü kontrol etmek için zorluk, hücre davranışı üzerindeki boyanın istenmeyen etkisi ve seyreltme dahil bazı sınırlamalar var zaman etiketi. Nükleotid analog etiketleme yaklaşımları muhtemelen kök hücreleri 7,8 sakin koşullarda uygun "etiket istinat hücreler" yavaş bisiklet varlığını belgeleyen sağlamıştır. Bu tekniğin sınırlı bir süre boyunca çoğalma kinetiği dayalı yavaş bisiklet hücrelerinin varlığını göstermek olabilir Bununla birlikte, bu kök hücrelerin işlevselliğini ilgili önemli anlayışlar temin edemedik. Optimal soy izleme metduğu işaretli hücrenin kendi döl veya komşularının özelliklerine etiketleme etkisini en aza indirmek gerekir. Ayrıca, bir sahne ve zamana bağlı bir şekilde de yanı sıra tek bir hücre (klonal) şekilde ilgi hücre popülasyonu etiketlemek yeteneğine sahip, yani etiketleme indüksiyon kontrole sahip yararlı olacaktır. Etiket zamanla muhafaza ve komşu hücrelere transfer değil olacağını, böylece kurucu hücrenin tüm soyu aktarılır İstikrarlı ve geri dönüşümsüz etiketleme yöntemi çok önemlidir.

Daha yakın zamanlarda, hücre etiketleme genetik yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu sistemlerde, hücre spesifik promotörler, yeşil fluoresan protein ya da Β-galaktosidaz raportör genler gibi muhabir 9-13 genlerinin ifadesinin loxP-çevrili barikat çıkarın ve izin vermek için, Cre rekombinazın ifadesinin tetiklemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, sadece hücreler ve onların döl takibini mümkün kılan, aynı zamanda hücre izinolation ve moleküler karakterizasyonu. Tek hücre düzeyinde hücre takibi, tek bir floresan haberci genin ifadesinin indüksiyonu yoluyla mümkün hale geldi. Bu sistemin önemli bir sınırlama hücrelerinin çok düşük bir yüzde, ayrı ve tek tek klonlar izlemek mümkündür etiketli tek bir gerçektir. Renkli gazetecilere kullanılabilecek bu sınırlamayı aşmak için. Renkli etiketleme kullanırken, aynı niş komşu hücrelerin diferansiyel kaderin izleme verimli 14-17 elde edilebilir. Son zamanlarda, Brainbow (Br) alel çeşitli Cre / lox sistemi kullanılarak birden çok flüoresan raportör genlerin stokastik ifadesine imkan tanır, soy izleme deneyleri için geliştirilmiştir. Cre / lox sistemi algılar ve loxP sitelerinin gibi özel DNA dizilerine bağlanan Cre rekombinaz enzimin oluşur. Aşağıdaki Cre rekombinazın bağlanması site spesifik rekombinasyon oluşur loxP çıkarılması çevrili dizileri yolaçan neden olanFarklı floresan proteinleri rastgele ifadedeki g (mekanizması, aşağıda tarif edilmiştir) hazırlandı. Br hatlarının çeşitli (Değerlendirmeler 16,18,19 bakınız) kullanım için mevcuttur. Br suşları arasında büyük farklar 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) flüoresan genler arasında değişen, kaset dahil flüoresan genlerin sayısı (i) farklılıklar, , (ii) karşılıklı yönlendirilmiş lox mevkisi varlığı kullanılan lox mevkisi (iii) tipi, ve (iv) sentezleme veya floresan gen ekspresyonunun sessizlik önce Cre aktivasyonuna gen inversiyon (Br2.0-2.1) izin vermek. Yeni kurulan Br3 nöronların renkli görüntüleme için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu transkript ana özelliklerinden biri en iyi nöronal eşit bir boyama 20 süreçleri sağlayan ışığa farnesillenmiş floresan proteinleri, bir dizi yeni içermesidir.

Önemlisi, Br kasetlerinin farklı sürümleri Thy1 pr nöronal özgü içerebiliromoter veya ubiquitously CAG (CMV) promoteri dile getirdi. Br transgenik farelerin bazıları tek Br transgen içerebilirken Son olarak, diğerleri, böylece, her hücrede eksprese edilecek renk kombinasyonları olasılıklarının muazzam sayıda üretilmesini sağlayan, birden fazla transgen kopya içerebilir (örneğin 16).

Çalışmamızda, biz Br 2.1 kaset 21 içeren R26R-Konfeti fare kullanıldı. Br2.1 benzersiz Cre-aracılı DNA inversiyon nedeniyle loxP sitelerinin (Şekil 1) karşılıklı doğrultuda değil, sadece eksizyon izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Böylece, renk değişikliğine yol bu inversiyon / eksizyon olayları sürece Cre 16 mevcut olduğu gibi devam edebilirsiniz. Bu nedenle, bir indüklenebilir zamansal Cre sentezleme sistemi güvenilir hücre izleme Br2.1 kullanmak için gereklidir. Şekilde gösterildiği gibi,. 1, Br2.1 loxP-çevrili Neo R -casse ardından her yerde bulunan bir CAG promotörünü içerirbir transkripsiyon birlikte gösterim olarak hareket tte, iki tandem konumlandırılmış san bir yeşil için 4 flüoresan raportör genlerin kodlama (GFP), (YFP), kırmızı (RFP) ve mavi (CFP) floresan proteinleri takip eder. Resim floresans Cre aktivasyonu öncesinde ifade edilir. Cre rekombinazın indüksiyonu, belirli bir hücre içinde 4 floresan proteinleri bir rastgele ekspresyonunu sağlayan Neo-R kasetinin giderilmesini de sağlar. İkinci bölüm loxP-çevrili RFP ve ters CFP içerirken ilk parça, loxP-çevrili GFP ve ters YFP içerir. Bu DNA segmentleri sürekli sürece, Cre rekombinaz mevcut olduğu, (ters yönlenmede olduğunda loxP kullanılarak) ters veya çıkarılabilir. Bu nedenle, geçici ve kontrollü Cre transgen kullanılmalıdır. YFP ekspresyonunu ve RFP sitoplazmiktir, GFP, nükleer ve CFP hücre membranına bağlanır: Br2.1 kaseti sinyal konumuna bağlı örtüşen emisyonlar arasında ayırt etmeye yönelik mükemmel bir sistem sağlar. GFPve RFP emisyon kolayca geleneksel fluoresan mikroskobu ile ayrılır. YFP / GFP / CFP emisyon ayırmak amacıyla, bir spektral konfokal görüntüleme sistemi gereklidir. Toplamda, Br2.1 kaset hedeflenen her hücrede dört takım farklı floresan genlerin rastgele indüklenebilir ve doku spesifik ifadesini verir. Renk kombinasyonları daha büyük bir sayı gerektiğinde Aslında, bir bu şekilde her hücre için 2 renkli etiketleri sentezlenmesi ve 10 olası renk kombinasyonların sayısını artırmak sonuçlanan Br2.1 2 alellerini içeren homozigot fareler üretebilir Kasetin birden çok kopyası genomları 16 entegre çünkü 22. Br fare suşlarının bazı olası renk kombinasyonları çok daha büyük bir sayısının ifadesini mümkün kılar. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek bir Br2.1 alel tarafından temin edilen, dört renk kombinasyonları yeterlidir. Burada sağlanan protokol izlenerek, tek bir spectr nispeten basit bir düzeneği kullanılarak, bu yöntem kurabilirKalibrasyon için çok az, eğer herhangi bir ihtiyacı ile al mikroskopi.

Burada korneal epitelyumun soyu takip deneyler için, tek bir Br2.1 alel ihtiva R26R-Konfeti farelerin kullanım için uyarlanabilir bir protokol sağlar. Bu transgenik fare suşu kolon 21,23 ve kornea epitel kök hücrelerin 22,24 kökeni ve kaderi çalışmak için kullanılır olmuştur, ve fokal segmental glomerüloskleroz böbrek Podosit vasıflandırılması için bağırsak kanserine 25 kök hücre aktivitesinin varlığı (FSGS) 17.

Protocol

Etik Beyanı: Bu çalışmada hayvan bakımı ve kullanımında Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO tablosuna conformed bulundu. Tüm deneyler, yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır.

Fare ve Strain ifade bir Uygun Cre-recombinase seçin 1.

  1. Araştırılması için satın alma 26 ve hedeflenen dokuya bağlı olarak kullanılabilir Cre transgenik hatların çok çeşitli dışında, Cre rekombinaz gen, ilgi konusu doku için spesifik olan bir promoter tarafından kontrol edildiği bir transjenik fare suşu Cre seçin. Olgu zamansal kontrol gereklidir ise, indüklenebilir Cre satırını seçin.
    Not: Biz özellikle limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücreler 24 etiket tamoksifen indüklenebilir K14-Cre ERT transgen seçti. Di Girolamo ve arkadaşları onların K1 için kornea ifade ile limbal özgüllük bildirdiği gibi, suşları arasında farklılıklar olabileceğini unutmayın4-Cre ERT 22. Indüklenebilir transgenik fareler Cre kullanarak bir avantajı çok yönlü zaman dilimlerinde de izleme soy uyarılmasını izin vermesidir.

2. Uygun Br Fare Gerinim seçin

  1. Araştırma sorusu ve mevcut Cre hat 16,18,20 bağlı olarak uygun Br kasetini seçin.
    1. Olmayan bir uyarılabilir Cre fare suşu kullanıldığında, sürekli bir DNA inversiyon / eksizyon izin ve böylece 16 (örneğin Br1.0 ya Br1.1 için) kör uçlu ürünlere neden olmayan bir Br kaseti seçin.

3. İlgi Transgenik Hatları Çapraz

  1. Burada gösterilen protokolü için, hemizigot Yavrularda elde etmek için homozigot Cre ERT suşu (Cre ERT / Cre ERT) ile homozigot R26R-Konfeti zorlanma (Br2.1 / Br2.1) çapraz (Br2.1 / +; Cre / +) mono-allelik hepsi tek bir Br2.1 alel ihtiva olarak izleme soy ve hazır olduklarınıTek Cre alel.
    Not: bir iki Cre allel (Br2.1 / +; Cre / Cre) içerebilir fareler yaratacaktır etiketleme verimliliğini artırmak için, süre iki Br2.1 aleli (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) olur (22 ayrıntılı olarak) renk kombinasyonları artar.

4. kre-rekombinazı İndüksiyon

Not: Bu deneylerde Tamoksifen uygulanması limbal ve korneal bazal K14 pozitif kök / progenitor çekirdeği içine Cre rekombinazın ERT translokasyonunu teşvik etmek için, 3-4 günlük bir süre için, günlük intraperitoneal enjeksiyon ile gerçekleştirilmiştir epitel hücreleri. Aşağıdaki protokol dört fareden enjeksiyonu için kullanılabilir. Alternatif olarak, oküler yüzeye Tamoksifen topikal uygulama daha yüksek verim verir. Tamoksifen Çözelti bir haftaya kadar 4 ° C'de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın.

  1. Tamoksifen 100 mg tartılır ve mısır yağı, 5 ml kadar içeri çözülür20 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak.
  2. Intraperitonal 3-4 ardışık gün boyunca 8 haftalık farelere Tamoksifen (4 mg) çözeltisi 200 ul enjekte edilir.
    Not: Tamoksifen çözeltisi bir haftaya kadar 4 ° C'de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın.
  3. Topikal uygulama için: Tamoksifen 60 mg ağırlığında ve 60 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak için mısır yağı, 1 ml içinde çözülür. Vorteks ve 65 ° C'de muhafaza edilen bir sallanan sulu banyo içindeki çözümü ayarlamak ° C kullanımda kadar banyosunda açık bırakın onu oluncaya kadar.
    1. Dikkatle fare her göz yüzeyine Tamoksifen çözeltisi 100 ul uygulayın.

Görüntüleme için 5. Doku Hazırlanması

  1. Izofluran kullanarak Kurban hayvanlar Tamoksifen enjeksiyonu ve col aşağıdaki uygun zaman noktalarında CO 2 inhalasyon ardından anestezi (refleksleri eksikliği tarafından uygun anesthetization onaylayın) (% 2 oksijen buharlaşmış)İlgili doku Öğr.
    1. Bu deneyler için, aşağıdaki zaman noktalarında, gözler enükleasyonu: 1, 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra Tamoksifen enjeksiyon. Kavisli bir forseps kullanarak enükleasyon ulaşmak. Göz küresi, göz soket dışına pop neden göz kapaklarını basın. Optik siniri tutan göz küresi arkasında forseps yerleştirin. Yavaşça göz küresi çekin ve çıkartın.
      Not: Aşağıda tarif edildiği gibi, bu aşamada, dokular işaretli hücrelerin wholemount analiz için hazırlanabilir. Normal dondurulmuş doku bölümleri de PFA sabit ve aşağıda tarif edildiği gibi (bakınız bölüm 6 ve 22) görüntülü hazırlanabilir.
  2. PBS ile doldurulmuş bir 60 mm çanak her göze yerleştirin.
  3. Stereo-mikroskop altında kullanarak forseps aşağı bakacak kornea ile optik sinir yakınında göz tutun ve optik sinir, kas ve bağ dokusu kaldırmak ve gözün arka kısmında küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz.
  4. Yaylı makas kullanma dikkatle büyütmekObjektif dışarı pop ve forseps kullanarak iris kaldırmak icar kesti.
  5. Bir neşter kullanılarak çevreye doğru merkezden başlayarak 4-5 radyal kesiler yaparak kornea düzleştirin.
  6. Limbusun ötesinde aşırı periferik dokuyu kesmek için bir neşter kullanın.
  7. Daha sonra kısa bir süre PBS ile yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 PFA korneaları sabitleyin.
  8. 10 dakika boyunca DAPI ile inkübe örnekleri ve kısaca PBS ile yıkayın.
  9. Epitel tarafı yukarı bakacak şekilde cam slaytlar Dağı kornealar. Bir kapak camı ile kornea ve kapağın üstüne montaj medya bir damla yerleştirin. Slaytlar RT O / N kurumasını bekleyin. 4 ° C 'de slaytlar tutun.

6. Konfokal Mikroskopi ve Görüntüleme Analizi

  1. YFP / GFP / OBP emisyonlarının ayrılmasını sağlayan bir spektral konfokal sistemi kullanın. Set flüoresan uyarma ve Br'dir kasetinin floresan proteinleri bağlı olarak emisyon dalga boylarında. Minimize haç amaçlayan her protein için en uygun dalgaboyu seçinuyarım. Farklı protein gelen sinyallerin sızıntısı en aza indirmek için, dar emisyon aralıkları seçin.
    1. Br2.1 kaset için bir başlangıç ​​noktası olarak floresan uyarma (eski) ve emisyon (em) arasında kurulan aşağıdaki kullanın: - CFP ex 405 nm / em 420-480 nm - DAPI ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm ve RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
  2. Yüksek çözünürlüklü geniş doku alanları görselleştirmek için, kiremit görüntüleme kazanır. Yani Şekil 2A-B, görüntünün 12 x 12 görüntülerin bir dizi alarak tüm kornea, gösterilen sonuçlar için, her alanda 4 floresan kanalları kullanarak 144 alanları (512 x 512) kazanır. Toplamda 576 görüntüleri toplamak ve daha sonra birleştirme.
  3. Farklı derinliklerde ve doku yapılarına etiketlenmiş hücrelerin lokalizasyonu keşfetmek için, farklı ilgi bölgelerin Z-yığını görüntüler elde. Sipariş to görüntü korneanın tam derinliği, 3 mikron aralıklarla 8 optik bölümleri kazanır. Maksimum şiddeti göre resim çıkıntılar olarak da toplanmıştır bölümlerin Ortogonal incelemeler geleneksel görüntüleme yazılımları 24 kullanılarak inşa edilebilir.

Tamoksifen İndüksiyon 7. Kornea Yaralanma Kombine

  1. Izofluran ile fareler (oksijen buharlaşmış% 2) anestezisi ve yönetimi analjezikler (10 mg / kg Carpofen, deri altından enjekte). Ayak tutam yanıtsızlık tarafından uygun anesthetization onaylayın.
  2. Tamoksifen tozu, 1 g tartılır ve 200 mg / ml konsantrasyon solüsyonu elde etmek için, steril DMSO, 5 ml içinde çözülür.
  3. Çözelti berrak hale gelinceye kadar bir su banyosu içinde 65 ° C'ye kadar Tamoksifen çözeltisi ısıtın. Kullanılıncaya kadar banyosunda çözüm tutun.
  4. Anestezi sırasında su kaybını önlemek için tedavi edilmeyen kontralateral göze göz merhemi sürün. Yeterli con kazanmış olan gözetimsiz kadar bir hayvan bırakmayınsternal yatma korumak için bilinç. Tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirkete yaralama göz geçirmiş fareler iade etmeyin. Fareler yakın yaralanmadan sonra izlenmelidir. Onların vücut ağırlığının% 10'undan fazlasını kaybetmek durumda, kornea erozyonu veya rahatsızlık muzdarip, deney durdurulmalıdır. Tekrarlama analjezikler idaresi bütün deney boyunca her 24 saatte.
  5. Buna bağlı bir iğne olmadan Steril bir şırıngayı kullanarak, topikal her fare tek gözün tüm kornea yüzeyinde 200 ul Tamoksifen çözümü uygulayın.
    Not: Sıvı çözelti, oda sıcaklığında göz yüzeyine hızlı bir şekilde katılaşır. Kornea hasarı etkisi yara şiddetine bağlıdır. Tamoksifen / DMSO çözeltisi bir uygulamasında sonra hiçbir yan etki farelerde gözlenmiştir. Tekrarlı uygulamalar durumunda kornea opasitesi gözlenebilir.
  6. Mezhep (bkz doku hazırlama ve görüntüleme ile devamiyonlar 5 ve ilgili zaman noktalarında 6). Bir hafta sonrası yaralama (Şekil 2 ve 24) (evre 5.1 ayrıntılı olarak) Burada gösterilen sonuçlar, fareler kurban için.

Representative Results

Son zamanlarda, biz kök hücre ve kornea epitelinin 24 progenitör hücrelerin köken, hayatta kalma ve göç belirlenmesi amaçlanmıştır. Biriken deliller kornea epitel limbal niş, kornea periferinde bir halka şeklinde bölgede münhasıran bulunan kök hücreler tarafından yenilenir dogma destekler. Bu teori, in vitro ve in vivo verilerin ve başarılı öncü limbal kök hücre tedavisi 27-29 temelini sağlanan klinik kanıtlarla desteklenmektedir. Ancak, bu konu son derece bağlı fare limbus korneal yenileme 30 katılmaz önerdi limbal aşılama deneyleri dayalı bir çalışmaya son yıllarda tartışılan kaldı. Bu ilginç hipotezi test etmek için, R26R-Konfeti fareler yapıldı kullanarak soy izleme deneyleri 120 gün 24 için kararlı hal koşulları altında limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücrelerin kaderini takip etmek.Gözler enüklee ve düz monte kornealar 10 ve 120 gün Tamoksifen enjeksiyon sonrası spektral konfokal lazer tarama floresan mikroskop ile analiz edilmiştir. Beklendiği gibi kornea merkezine doğru limbus uzanan 1-4 ay sonra (Şekil 2B ve 24), uzunlamasına çizgiler yavaş geliştirilmiş olup, küçük flöresanlı hücre kümeleri ara sıra, 10 gün sonra aynı oküler yüzey boyunca gözlenmiştir. Bu sonuç kornea kornea merkezine doğru limbustan göç hücreleri tarafından yeniden düşündürmektedir. Sonra, yaralama koşullarda kornea rejenerasyon incelenmiştir. Etkin hücre izleme indüklerken koşullar altında yaralama K14 pozitif limbal / kornea hücrelerin kaderini test etmek için, biz, topikal uygulamaya bağlı kornea yaralanması neden dimetil sülfoksitte Tamoksifen (DMSO), eritilir. Tek bir topikal uygulaması (Şekil 2C), mo uygulandı Bu şekilde biz hafif yaralama ikna etmek için başardı Ek DMSO yalnız tedavi Tamoxifen indüksiyon veya DMSO yalnız topikal Tamoksifen indüksiyon öncesinde 2 ardışık günlerde uygulanan ağır yara gün önce uygulandı ise yaralama yükünü azaltır.

Yavaş geliştirilen ve durağan hal koşulları altında 4 ay içinde kornea merkezine ulaştığı ince limbal çizgili aksine, yaralanmadan sonra hücre göçü hızlıydı. Dikkate değer, uzun ve kalın çizgili limbal zaten 7 gün içinde bu koşullar altında geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, renk çeşitliliği, bazen çok az (Şekil 2B) idi. Bizim ellerde, bazen, özellikle kırmızı kan hücrelerinin spesifik fluorophores karşı önyargılı olabilir renk çeşitliliği gösteren tüm kornea tespit edilmiştir. Br1.0L 31 ve Br2.1 21'de daha önce bildirildiği gibi, istenmeyen bu eğilim doz tepki deneyleri ile kalibre edilebilir.

les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
R26R-Konfeti yapısının Şekil 1. şematik gösterimi. (A) R26R-konfeti yapı yüksek ekspresyon düzeyleri için bir CAG destekçisi içeren bir loxP (siyah üçgen) Neo R -roadblock ve Rosa26 lokus 16,21 at Brainbow2.1 kaseti -flanked. Brainbow2.1 kaset, iki baş-kuyruk loxP-flanked dimerlerini içerir. Bir dimer nükleer lokalize yeşil floresan proteini (GFP) ve bir geri odaklı sitoplazmik sarı floresan proteini (- olması yoluna götürdü ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş YFP) oluşur. 16 - İkinci dimer sitoplazmik RFP ve bir ters dönük, zara bağlı mavi floresan proteinin (PFC ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş CFP) içerir. (B - E) Cre-rekombinaz aktivasyonu üzerine, farklı eksizyon ve inversiyon olaylar meydana gelebilir; Olası sonuçlar exemplifi vardırB ed - E. Cre aktivite ve böylece gen taşınma ve / veya inversiyon ve dört floresan proteinleri birinin rastgele ifadesi sonuçlar giden kasetin stokastik yeniden düzenlenmesine neden olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Homeostaz ve yaralanma altında izleme Kornea soyu. R26R-confetti / protokol ayrıntılı olarak K14-Cre farenin 4 mg Tamoksifen enjekte edilmiştir. (- B A) puan sonrası belirtilen süre içinde endüksiyon kornealar görüntülenmiştir basık. Cre indüksiyonu ile birleştiğinde Kornea yaralama DMSO içinde çözülmüş Tamoksifen topik uygulama ile elde edilmiştir (Cı - D). Mozaik görüntüler eldespektral konfokal mikroskopi fayans kanallı gösterilmektedir (A - D). Homeostazındaki yavaş göç hücrelerin radyal limbal çizgili limbus ve kornea merkezi arasında uzanıyordu. Bu şeritler 4-5 ay (B) içinde kornea merkezine ulaşan yavaş gelişti. Kornea hücre kümeleri de (beyaz oklar, B) belirgindi. Buna karşılık, büyük limbal çizgiler yaralama koşullarında (C) altında, tek bir hafta içinde ortaya çıktı. Kırmızı hücrelerin (D) doğru renk çeşitliliğinin önyargı bir örnek. Limbal-kornea sınır kesik çizgi ile açıklamalı. Ölçek çubuğu 500 mikron olduğunu. Kısaltmalar: CFP, mavi floresan proteini; GFP, yeşil flüoresan proteini; RFP, kırmızı floresan proteini; YFP, sarı floresan protein. Bu rakam 24 modifiye edilmiştir. Büyük halini görmek için tıklayınızBu rakam.

Discussion

Köken izleme deneyler yıllardır gerçekleştirilmiştir. Son teknolojik gelişmeler ve Confetti fare suşlarının ortaya çıkması araştırma için yeni yollar açtı. Günümüzde, ticari olarak temin edilebilen araştırmacılar dokuya-özgü Cre hatları nakavt fareler ve transjenik farelerin çok sayıda yararlanabilir. Bu sağlam ve güvenilir veri sağlarken, zahmetli uygulama kaçınarak, temel uzmanlık bilimsel sorulara yanıt için çok yönlü deneysel sistemler tasarlamak için bir fırsat sağlar.

R26R-Konfeti fareler verimli izleme ve canlı bir organizmada hücrelerin yapısını ve davranışlarını incelemek için şık bir araçtır. Sistem kurmak kolaydır ve, embriyogenez sırasında tek hücre non-invaziv soy izleme izin verir kök hücre yenilenmesini homeostazında altında, ya da yaralanma, enflamasyon ve kanser gibi farklı koşullarda. Elde veriler sağlam descript sağlarölçülebilir bir şekilde hedeflenen hücrelerin konumunun, klonal hücre genişlemesi ve hücre göçü hayatta kalma, iyonu. Bir kritik bir adım güvenilir bir kesin gelişim aşamasında etkin doku spesifik etiketleme izin verebilir uygun genetik fare zorlanma seçmek olacaktır. Bu sistemin bir sınırlama canlı bir organizmaya izlenmesi için, doku erişilebilir ve şeffaf olmasıdır. Benzer şekilde, bir canlı hayvan içinde kalın bir doku izlemenin yalnızca iki foton veya çoklu foton mikroskobu ile kolaylaştırılabilir. Ancak, hücre izleme postmortem doku bölümleri mevcuttur ve CLARITY yöntemiyle 32,33 ile şeffaf olmak dönüştürülmüştür sonra belki sağlam doku incelenebilir. Dikkate alınması gereken bir başka sınırlama, aynı fluorofor ifade komşu hücreler, büyük olasılıkla aynı klonal soy ait olsa da, bu rastgele kişi aynı flüoresan gen ifade bağımsız hücre kökenli türetilebilir da mümkündür olmasıdır. Bu possibiliÇok sayıda renk kombinasyonları izin birden Br allelleri kullanırken ty çok olası hale gelir.

Gelecekte, genlerin ve sağlık ve patoloji kendi mutasyonların çalışma izin verecektir mevcut genetik araçlar (yani, nakavt, knockin ve transgenik fare modelleri) ile Confetti sistemini birleştirerek. Aynı şekilde, soy hücre kaderinin kararları sinyal yolları katılımı üzerine yeni anlayışlar getirecektir farklı sistem pertürbasyonlar (yani, hücre yıkımını niş, lazer aracılı hücre ablasyon, ilaç tedavisi kök) kapsamında izleme. Sonuçta, floresan ve biyoışıldama etiketleme kombinasyon kullanımı, kenar mikroskopi sinyal yollarının ve kesme genetik gazetecilere araştırmacılara onların kendi doğal ortamında çevredeki nasıl tepki tek hücre öğrenmek için sağlam bir sistem sağlayacaktır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette Jackson strain #013731
K14-CreERT mice Jackson strain #005107
tamoxifen Sigma T5648
isoflurane USP Terrell Piramal Critical Care
Carprieve 30 b.wt
DMSO Sigma D2650
DAPI Sigma D9542 used at concentration of 4 µg/ml
Immu Mount Thermo Scientific 9990402
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage Zeiss The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Imaging Software Zeiss
Duratears-eye ointment Alcon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
  2. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  3. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
  4. Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
  5. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
  6. Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
  7. Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
  8. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
  9. Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).
  10. Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
  11. Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
  12. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  13. Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
  14. Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
  18. Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. 763-769 (2011).
  19. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
  20. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
  21. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  22. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
  23. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
  24. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
  25. Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
  26. Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).
  27. Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
  28. Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
  29. Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
  30. Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
  31. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  32. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
  33. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats