قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

1Institute of Medical Virology, University of Zurich
Published 11/04/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

دخول فيروس الانفلونزا (IAV) هو عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ربط الفيروس إلى المستقبلات على غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 1. مستقبلات للIAV هو الحامض اللعابي التي هي موجودة على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات السكرية والسكرية. وهيماغلوتينين (HA) البروتين من IAV التي هي موجودة في المغلف الفيروسي بربط الحامض اللعابي وبالتالي يتوسط مرفق من الجسيمات الفيروسية إلى غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 2. ويدخل الفيروس الخلايا عن طريق بوساطة بالكلاذرين الإلتقام ولكن أيضا مسارات دخول بديلة، مثل macropinocytosis، وقد وصفت 3-6. التفاعل بين HA والحامض اللعابي يبدو أن يكون كافيا للوساطة على حد سواء، والتعلق واثار استيعاب جزيئات فيروسية 7. ومع ذلك، فقد تم اقتراح مستقبلات دخول بديلة ويجري حاليا التحقيق دورهم في دخول IAV 1،8،9.

لئيماهلدف اليوم، وبذل الجهود لتحديد العوامل المضيفة التي تشارك في دورة حياة الفيروس بهدف تطوير العلاجات المضادة للفيروسات حاجة ماسة رواية 10-12. ان دخول الفيروس سيكون خطوة إيجابية لاستهداف النمو IAV من أجل منع العدوى الفيروسية في أقرب نقطة له. قياس مراحل مختلفة من دخول IAV هو تحدي تجريبيا كما هو مطلوب كميات كبيرة من الفيروس عادة للكشف عن الفيروسات واردة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة الكشف عن التغييرات في دخول الفيروس خطي الوحيد نظرا لعدم وجود تكاثر الفيروس. وهذا يؤكد الحاجة لفحوصات مع حساسية عالية.

مقايسة نقدم هنا يسمح للكشف عن فيروس تعلق على سطح الخلية وكذلك الكشف عن فيروس المنضوية في ما يتعلق المبلغ الإجمالي للفيروس الخلايا المرتبطة. استخدام فيروس wildtype المعقدة البيروكسيديز يمكن قياس مريحة من خلال تلطيخ مع STV-CY3 وقراءات التدفق الخلوي. فيروس المعقدة البيروكسيديز هو الباردة المنضم إلى خليةالصورة للسماح للمرفق ولكن منع تدخيل الجسيمات الفيروسية. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة، permeabilized وملطخة STV-CY3 لقياس الفيروسات المرفقة. إشارة من خارج الخلية، virions المرفقة يمكن إلغاؤها إذا تم تطبيق خطوة حجب قبل التثبيت التي يتم تحضين الخلايا مع streptavidin غير المسمى (STV). في الخطوة التالية، بعد الحجز على المعقدة البيروكسيديز IAV، هو تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ويتم السماح استيعاب الجسيمات الفيروسية لتأخذ مكان. محمية جزيئات المنضوية من ربط STV مما يسمح للتمييز بين الفيروسات من خارج وداخل الخلايا.

في حالة تجريبية، يطلب من أربع عينات: '0 دقيقة': العينة الأولى، وصفت '0 دقيقة، هو قياس فيروس البرد محددة على سطح الخلية. '0 دقيقة + STV': النموذج الثاني، المسمى '0 دقيقة + STV "، ويعطي خط الأساس كثافة إشارة من التجربة. تم منع الفيروسات المرفقة الطرافةيجب أن تكون ح STV والإشارة التالية تلطيخ مع STV-CY3 أقل بكثير مقارنة مع عينة '0 دقيقة. '30 دقيقة ': العينة الثالثة، '30 دقيقة' يحتوي المرفق والمنضوية الفيروس بسبب التحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. '30 دقيقة + STV ': العينة الرابعة، '30 دقيقة + STV "التدابير جزء داخل الخلايا من الفيروسات. يتم تطبيق الخطوة حجب STV بعد فترة الحضانة 30 دقيقة. ونتيجة لذلك، والجسيمات الفيروسية على سطح الخلية ملزمة STV ترك الفيروسات المنضوية متاحة فقط لتلطيخ مع STV-CY3. ويمكن حساب القيمة النسبية للفيروس المنضوية كنسبة من فيروس المنضوية (تقاس في دقيقة '30 + STV "عينة) مقسوما على المبلغ الإجمالي للفيروس (التي وصفها '30 دقيقة 'العينة).

والضوابط نقترح أن تتضمن خلايا وهمية المصابة. إشارة التالية STV-CY3 تلطيخ الخلايا وهمية المصابة يعطي الخلفيةالناتجة عن بروتوكول تلطيخ. عنصر تحكم لمرفق IAV هي المعالجة المسبقة من الخلايا البكتيرية مع النورامينيداز (NA). NA يشق قبالة الحامض اللعابي من بروتينات سكرية الخلوية، وبالتالي إزالة مستقبلات المرفق من سطح الخلية. أزيد الصوديوم (SA) هو المانع الأيضية قوية وبالتالي كتل الإلتقام 13. الخلايا تعامل مع أزيد الصوديوم يجب أن تكون إيجابية لفيروس ملزم ولكن السلبي لاستيعاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة قبل البداية: غطاء محرك السيارة استخدام تدفق الصفحي والاحتواء المناسب عند العمل مع فيروسات حية. هنا، نحن تصف ظروف النمو المناسبة لسلالة فيروس الإنفلونزا الثقافة A / WSN / 33. قد تختلف وافر من العدوى (وزارة الداخلية) وحضانة مرات اعتمادا على سلالة الفيروس المستخدمة.

1. إعداد البيروكسيديز A / WSN / 33 الفيروسات

  1. البذور مادين-داربي kindey الكلاب (MDCK) الخلايا في قارورة T175 سم 2 باستخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (القلم / بكتيريا). خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية حتى ما يقرب من 70٪ confluency يتم التوصل إليه.
  2. قبل الإصابة، وإزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، pH7.0-7.3) وذلك بإضافة كمية كبيرة كافية لتغطية أحادي الطبقة الخلية.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وتصيب الخلايا مع A / WSN / 33 مع وزارة الداخلية من 10 -4. تمييع الفيروس في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.02 ملغ المغنيسيوم 2+، 0.01 ملغ الكالسيوم 2+ </ سوب>، 0.3٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا (العدوى PBS). استخدام اللقاح من 4 مل لT175 سم 2 قارورة.
  4. احتضان خلايا 1 ساعة عند 37 ° C. إزالة اللقاح عن طريق الطموح وماصة 10 مل DMEM تستكمل مع 0.3٪ BSA، 20 ملي HEPES، و 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا في قارورة.
  5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 3 أيام حتى تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) مرئيا، ثم طاف الحصاد. ويمكن التعرف على CPE كما التقريب من الخلايا تليها مفرزة وموت خلايا 14.
  6. تدور طاف في 450 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلية. نقل طاف في أنبوب الصقر الجديد وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. تجاهل الكريات.
  7. supernatants نقل إلى أنابيب نابذة فائقة السرعة وsupernatants الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل من السكروز 30٪ المخفف في NTE العازلة (10 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 7.4]، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA). موازنة الأنابيب قبل تنبيذ فائق وملء مع PBS للوصول إلى وحدة تخزين نهاية 30 مل. تدور supernatants في 112398 x ج (الموافق 25،000 دورة في الدقيقة لمدة الدوار SW28) لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة.
  8. إزالة بعناية طاف قبل pipetting ونقع بيليه الفيروس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 250 ميكرولتر PBS. Resuspend بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. قياس محتوى البروتين من فيروس تنقيته بواسطة برادفورد مقايسة 15.
  9. استخدام مجموعة biotinylation لتوليد المعقدة البيروكسيديز A / WSN / 33. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
  10. وباختصار، إضافة كمية مناسبة من البيوتين للفيروس المنقى واحتضان ل2H على الجليد. نقل الفيروس إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى وحدة تخزين نهاية 30 مل. تدور الفيروس في 112389 x ج لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة. إزالة طاف قبل pipetting وإضافة 250 ميكرولتر PBS. نقع بيليه أكثر من ليلة 4 درجات مئوية. قسامة وتخزين الفيروس البيروكسيديز المخزنة في -80 ° C حيث أنها سوف تكون مستقرة لمدة 24 شهرا على الأقل.
    ملاحظة: قد يكون مفيدا لتحديد عيار من ع المعقدة البيروكسيديزجبر IAV بواسطة فحص اللوحة القياسية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول اللاحق سوف تقيس فقط جزيئات الفيروس المعقدة البيروكسيديز. سوف تبقى جسيمات unbiotinylated بسبب biotinylation ناقصة المساهمة في عيار المعدية عن طريق فحص اللوحة ولكن ليس على إشارة يقاس في فحص المرفق / تدخيل.

2. تحديد المبلغ المطلوب من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز

ملاحظة: قبل أن يتم تنفيذ فحص المرفق / تدخيل، فمن المهم تحديد كمية الفيروس المعقدة البيروكسيديز المطلوبة لتصيب جميع الخلايا لعينة.

  1. الثقافة والخلايا A549 يعرض للتريبسين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عد الخلايا باستخدام غرفة الخلية. ماصة الخلايا 200،000 A549 إلى FACS deepwell الأنابيب. تدور 3 دقيقة في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه مع 200 ميكرولتر PBS. خلايا يبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  2. إعداد 5 أضعاف التخفيفات التسلسلي للbiotiالأسهم فيروس nylated في العدوى PBS.
  3. أنابيب تدور تحتوي على خلايا في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه مع 100 ميكرولتر التي تحتوي على فيروس العدوى PBS. كما استخدام السيطرة وهمية العدوى PBS دون الفيروسات المعقدة البيروكسيديز. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة.
  4. أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  5. لتثبيت، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من 3.7٪ امتصاص العرق (PFA). احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. ثم، كرر الخطوة غسل موضح في 2.4).
  6. لpermeabilization، أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100. احتضان لمدة 6 دقائق في RT. ثم، كرر الخطوة غسل موضح في 2.4).
  7. أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيلوآخرون في 50 ميكرولتر 2٪ BSA مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على STV-CY3. (يرجى ملاحظة، ينبغي تحديد التركيز المناسب من STV-CY3 قبل بدء التجربة تبدأ بتركيز 1: 200 و اختبار التخفيفات 2-أضعاف ما يصل الى 1: 2400 في أيدينا، والتخفيف من 1: 1000 أثبت ليكون أفضل).
  8. احتضان 1 ساعة في الظلام في RT. ثم، كرر غسل خطوة وصفها في 2.4 ولكن Resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر 2٪ BSA مخففة في برنامج تلفزيوني.
  9. تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي 16. البوابة على السكان CY3 إيجابية. اختيار أقل تركيز من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز مما أدى إلى أكبر عدد ممكن من خلايا CY3 إيجابية في عدد السكان A549.

3. تحديد المبلغ المطلوب من Streptavidin


ملاحظة: كفاءة حجب إشارة المشتقة من الفيروس خارج الخلية تحدد اكتشاف مجموعة من الفحص. وبالتالي، فمن المهم لإلغاء إشارة STV-CY3 قدر الإمكان. عشرالبريد حاجة المبلغ المطلوب من STV يعتمد على كمية من الأوراق المالية الفيروسات المعقدة البيروكسيديز المستخدمة (المحدد في القسم 2).

  1. اتبع الخطوات 2،1-2،4، ولكن استخدام تركيز الفيروس المحددة في القسم 2.
  2. إعداد التخفيفات المسلسل خمسة أضعاف من STV المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم.
  3. أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV التخفيف. كما استخدام السيطرة وهمية PBS تحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم دون STV. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة على الجليد. ثم، خطوة تكرار غسل وصفها في 2.4.
  4. اتبع الخطوات 2،5-2،9. لفحص الداخلي، واختيار أقل تركيز من STV مما أدى إلى كتلة قوية من CY3 إشارة (مقارنة مع العينة التي لم STV الحالي). لهذا، فإن النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية أو كثافة مضان متوسط ​​للإشارة CY3 يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون إشارة CY3 العينات STV معاملة أقرب إلى إشارة من المصابين ساخرةالخلايا وقت ممكن.

4. المرفقات / التطبع الفحص


ملاحظة: تأكد من إعداد جميع الكواشف قبل بدء الفحص. لمجموعات المراقبة الثلاثة المقدمة في قسم النتائج (الخلايا المصابة وهمية، النورامينيداز خلايا ما قبل المعالجة وخلايا أزيد الصوديوم المعالجة) التعديلات الصغيرة على بروتوكول مطلوبة.

  1. إعداد 16 أنابيب deepwell تحتوي كل منها على 200،000 خلايا A549. إلى جانب مجموعة تجريبية مكونة من 4 أنابيب، وهناك 3 شروط السيطرة، يتطلب كل منها 4 أنابيب: خلايا وهمية المصابة، النورامينيداز (NA) خلايا -pretreated والخلايا المعالجة أزيد الصوديوم. وتتكون كل مجموعة من 4 أنابيب وصفها بأنها '0 دقيقة'، '0 دقيقة + STV'، '30 دقيقة '، '30 دقيقة + STV ".
  2. أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS.
  3. أنابيب تدور في 4 ° C في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيلوآخرون في 200 DMEM ميكرولتر تحتوي على 0.3٪ BSA، 20 ملي HEPES و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (الحضانة المتوسطة). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
    ملاحظة: للحصول على سيطرة النورامينيداز: استخدام النورامينيداز البكتيرية (مثل سياليداز من ضمة الكوليرا) بتركيز 200 مو / مل المخفف في الحضانة المتوسطة إلى resuspend الخلايا.
  4. أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. كرر هذه الخطوة أكثر مرة واحدة، ثم أنابيب يبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  5. أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر البيروكسيديز فيروس (استخدم تركيز الفيروس المحددة في القسم 2 مخففة في العدوى PBS). احتضان 1 ساعة على الجليد. ثم، خطوة تكرار غسل وصفها في 2.4.
    ملاحظة: للحصول على سيطرة وهمية المصابة: استخدم العدوى PBS دون الفيروس. لمراقبة أزيد الصوديوم: استخدام فيروس مخفف في العدوى PBS تستكمل مع 0.1٪ أزيد الصوديوم.
  6. بروcessing من العينات بعد الإصابة على الجليد:
    1. لعينات '0 دقيقة "، اتبع الخطوة 2.5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى يتم إصلاح عينات أخرى.
    2. ل'0 دقيقة + STV "العينات، أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV (استخدام تركيز محدد في القسم 3) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم (لمنع تدخيل أثناء التعامل مع العينة). احتضان 30 دقيقة على الجليد. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية.
    3. ل ''30 دقيقة العينات، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 2٪ BSA. احتضان 30 دقيقة عند 37 ° C. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: للحصول على سيطرة أزيد الصوديوم: استخدام PBS تستكمل مع 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم للحضانة 30 دقيقة عند 37 ° C.
    4. ل '30 دقيقة + عينات STV "تدور الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 2٪ BSA. احتضان 30 دقيقة عند 37 ° C. ثم، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV (استخدام تركيز محدد في القسم 3) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم (لمنع تدخيل أثناء التعامل مع العينة). احتضان 30 دقيقة على الجليد. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: للحصول على سيطرة أزيد الصوديوم: استخدام PBS تستكمل مع 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم للحضانة 30 دقيقة عند 37 ° C.
  7. اتبع الخطوات 2،6-2،8 وتحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. تحديد النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية في كل عينة.
  8. حساب نسبة تعلق الفيروس والكمية النسبية للفيروس المنضوية.
    1. لحساب كمية الفيروس المرفقة، استخدام النسبة المئوية من CY3-positiلقد الخلايا المغلقة أو متوسط ​​كثافة مضان إشارة CY3. وعلى سبيل المقارنة، تعيين الخلايا غير المعالجة إلى 100٪ (الشكل 4B).
      وصفت نسبة الفيروس التي توليها "0 دقيقة" عينة: ملاحظة.
    2. لحساب كمية الفيروس المنضوية، تأخذ نسبة "30 دقيقة + STV" عينة إلى "30 دقيقة" عينة (الشكل 5B).
      ملاحظة: كما ذكر أعلاه، فإن النسبة المئوية للCY3 الخلايا المغلقة إيجابية أو كثافة مضان متوسط ​​للإشارة CY3 يمكن استخدامها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد الكرتون واصفا الشروط الأربعة تجريبية مختلفة في الشكل 1 يتم عرض نتائج تجربة تمثيلية في الشكلين 2 - 5. في "0 دقيقة" عينة والفيروسات المعقدة البيروكسيديز بارد محددة لاستهداف الخلايا التي يمكن تصور من قبل STV-CY3 تلطيخ (الشكلان 1 و 2). عندما يتم تطبيق خطوة حجب (في "0 دقيقة + STV" عينة)، الفيروس على سطح الخلية لا يمكن الكشف عنها بواسطة STV-CY3 تلطيخ. ونتيجة لذلك، يتم تقليل كثافة إشارة في "0 دقيقة + STV" عينة بقوة مقارنة "0 دقيقة" عينة (الشكلان 1 و 2). على رفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ويتم أخذ فيروس المرفقة تصل إلى خلايا ("30 دقيقة" عينة). فيروس المنضوية ليست حساسة لحجب مع الخالي من الملصقات STV مما يؤدي الى انخفاض أقل دراماتيكية في شدة إشارة في & #8220؛ 30 دقيقة + STV "عينات النسبي إلى" 30 دقيقة "عينة التي تم فيها تطبيق أي حظر STV (الشكلان 1 و 2).

كما ضوابط نحن العاملين العدوى وهمية، والعلاج NA وSA العلاج. الشكل 3 يعرض النسب المئوية للخلايا CY3 إيجابية لجميع الظروف التجريبية هو موضح في القسم 4. الخلايا المصابة وهمية تعطي كثافة إشارة الخلفية للتجربة وقانون مراقبة سلبية ل مرفق فيروس (الشكل 4). عنصر تحكم إضافية لمرفق الفيروس هو العلاج مع أعربت البكتريا NA. NA يزيل الحامض اللعابي، ومستقبلات لمرفق IAV، من بروتينات سكرية على سطح الخلية، وبالتالي يقلل ملزمة للفيروس لاستهداف الخلايا 17. كما هو مبين في الشكل (4)، والمعاملة مع NA تلغي بقوة مرفق IAV قبل ما يقرب من 90٪ مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. وفيما يتعلق الداخلي، كنا SA عن السيطرة. SA TR eatment يستنفد بسرعة الخلوية مستويات ATP الأمر الذي يعيق عمليات الطاقة المستهلكة مثل الإلتقام 13. حضانة الخلايا مع SA أثناء وبعد الإصابة تحول دون استيعاب جزيئات الفيروس. تم رفع القيمة النسبية للفيروس المنضوية (كما هو مبين في الشكل 5) من حوالي 10٪ إلى 45٪ بحلول الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الخلايا غير المعالجة. التالي SA العلاج ومع ذلك، كانت نسبة الفيروس المنضوية النسبي حوالي 15٪ لكليهما، الخلايا المحتضنة ل0 و 30 دقيقة عند 37 ° C. هذا يدل على أن الواقع، SA يقلل من امتصاص فعال من الجسيمات الفيروسية في الخلايا.

الشكل 1
الشكل 1. مبدأ الفحص. الكرتون شرح مبدأ الفحص مرفق / تدخيل.= "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. نتيجة الممثل للIAV المرفق واستيعاب. (A) رسم بياني يبين شدة إشارة للإشارة CY3 عن الخلايا غير المعالجة. أظهرت هي "0 دقيقة"، "0 دقيقة + STV"، "30 دقيقة" و "30 دقيقة + STV" عينة. (B) النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية من A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نتيجة الممثل للمرفق واستيعاب بما في ذلك الضوابط. رونغ> النسبة المئوية للخلايا A549 CY3 إيجابية بعد العلاج المشار إليها. أظهرت هي المصابة وهمية، دون علاج، NA المعاملة والخلايا SA المعاملة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. تثبيط مرفق الفيروس عن طريق النورامينيداز. (A) رسم بياني يبين شدة إشارة CY3 العينات "0 دقيقة". عرض عدد الخلايا غير المعالجة (باللون الأزرق) وعينات ضبط اثنين: خلايا وهمية المصابة وNA المعاملة (باللون الأحمر والبرتقالي، على التوالي). (B) النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية من A. كما هو موضح هي وهمية، غير المعالجة والخلايا NA معاملته من "0 دقيقة" عينة. تم تعيين قيمة الخلايا غير المعالجة إلى 100٪.كوم / ملفات / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. تثبيط الفيروس عن طريق استيعاب أزيد الصوديوم (SA). (A) رسم بياني يبين شدة إشارة CY3 من "30 دقيقة" و "30 دقيقة + STV" عينات من دون علاج (باللون الأحمر والبرتقالي، على التوالي) وSA- المعالجة (في الزرقاء والخضراء، على التوالي) الخلايا. (B) النسبة المئوية للفيروس المنضوية النسبي من الخلايا غير المعالجة وSA المعاملة بعد 0 و 30 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف بروتوكول لدينا وسيلة سهلة لقياس مرفق الفيروس واستيعاب التدفق الخلوي. لأنها تتيح استخدام المسمى فيروس wildtype الذي يحاكي عن كثب العدوى بالفيروس مقارنة مع استخدام جزيئات الفيروسات مثل (فلب). في حين تم تحسين بروتوكول لدينا لقياس الحجز واستيعاب IAV يمكن بسهولة أن يتم تكييفها للفيروسات أخرى. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم استخدام التدفق الخلوي للقراءات، وشارك في stainings يمكن بسهولة إضافة إلى بروتوكول على سبيل المثال لاختبار مستويات التعبير التالي ضربة قاضية أو overexpression من البروتين من الفائدة. وهكذا، فإن فحص يسمح لإدخال تعديلات على بروتوكول اعتمادا على الاحتياجات الفردية. وتجدر الإشارة، يمكن للفحص أيضا أن يؤديها لسلسلة من نقاط زمنية لقياس استيعاب الفيروس مع مرور الوقت والحصول على معلومات الحركية. قد يكون هذا مهم بشكل خاص إذا كان الاختبار لتكييفها لفيروس مختلف مع حركية استيعاب مجهولة.

هاوالاصدار، تجدر الإشارة إلى أن نافذة الكشف صغير نسبيا كما تحدث الاختلافات في المرفق أو الداخلي على مقياس خطي نظرا لعدم وجود تكاثر الفيروس. لزيادة الثقة والحد من الضوضاء نوصي بما في ذلك الضوابط (على سبيل المثال الضوابط تصف أعلاه) والعديد من مكررات. في حين أن النتائج المعروضة تصور تجربة تمثيلية، لاحظنا الاتساق جيدة عبر تجارب مختلفة: على سبيل المثال، عن التعلق، تراوحت نسبة CY3 إيجابية الخلايا من 60-80٪. لفيروس المنضوية حصلنا على القيم التي تتراوح بين 40-60٪.

قبل بدء الفحص، من المهم أن يعاير تركيزات عمل الكواشف المستخدمة مثل STV، STV-CY3 وكمية الفيروس المعقدة البيروكسيديز. يرجى ملاحظة أن كمية المواد الكيميائية والأوقات الحضانة يمكن أن تختلف تبعا خط الخلية وسلالة الفيروس المستخدمة. لتحقيق أقصى قدر من نافذة الكشف، والنسبة المئوية للخلايا إيجابية لفيروس. الملحقر يجب أن تكون على أعلى مستوى ممكن في "0 دقيقة و" 30 دقيقة "عينة (اعتمادا على كمية من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز المستخدمة) وأدنى مستوى ممكن في" 0 دقيقة + STV "عينة (اعتمادا على كمية من STV المستخدمة ). بالإضافة إلى ذلك، الضوضاء يمكن أن تخفض عن طريق الحفاظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية خلال الطرد المركزي وغسل مع PBS الجليد الباردة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_135278) لطائرة أسرع من الصوت. MOP هو المستفيد من منحة الدكتوراه من صندوق البحوث AXA. نشكر باتريشيا Nigg للمساعدة في تصميم الشكل 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
  4. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
  5. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
  6. Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
  7. Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
  8. Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
  9. Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
  10. Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
  11. Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
  12. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
  13. Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
  14. Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  16. Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. Humana Press. (2007).
  17. Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats