유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Immunology and Infection

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Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

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Abstract

Introduction

인플루엔자 바이러스 (IAV)의 엔트리 (1) 표적 세포의 세포막 수용체에 바이러스의 결합으로 시작 다단계 공정이다. IAV의 수용체는 당 단백질과 당지질의 큰 다양성에 존재하는 시알 산이다. 바이러스 엔벨로프에 존재 IAV의 헤 마글 루티 닌 (HA) 단백질은 시알 산에 결합함으로써 표적 세포 (2)의 세포막에 바이러스 입자의 부착을 매개한다. 바이러스는 3-6 설명되었다 클라 트린 매개 엔도 시토 시스를 통하여 세포뿐만 아니라, macropinocytosis 같은 대체 입력 경로를 들어간다. HA 및 시알 산 사이의 상호 작용은 모두 중재 첨부 파일 및 바이러스 입자 (7)의 내재화를 유발하기에 충분한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 엔트리 수용체가 제안되었으며, IAV 항목의 역할은 현재 1,8,9을 연구되고있다.

똥개다발 적 노력 시급 신규 항 바이러스 요법 10-12을 개발 목표로 바이러스의 라이프 사이클에 관여하는 숙주 요인을 파악하게된다. 바이러스 엔트리는 그 최초의 지점에서 바이러스 감염을 차단하기 위해 IAV 성장 타겟팅 유리한 공정이 될 것이다. 바이러스 보통 다량 들어오는 바이러스를 검출하는 데 필요한대로 IAV 항목의 여러 단계를 측정하는 것은 실험적으로 도전. 또한, 바이러스 엔트리의 변화를 검출 범위 인해 바이러스 복제의 부족 만 선형이다. 이것은 고감도 분석에 대한 필요성을 강조한다.

우리는 여기에 제시 분석은 세포 - 관련 바이러스의 총량에 대해서, 세포 표면에 부착 된 바이러스의 검출뿐만 아니라 내면화 바이러스 검출 할 수있다. 비오틴 야생형 바이러스의 사용은 유동 세포 계측법에 의해 STV-Cy3에있는 염색 및 판독을 통해 편리하게 측정 할 수있다. 바이오틴 바이러스는 세포에 냉간 바인딩S는 첨부 파일을 허용하지만, 바이러스 입자의 국제화를 방지합니다. 세포를 고정 및 투과 화 바이러스 부착을 측정하는 STV-Cy3에 염색 할 수있다. 블로킹 단계는 세포가 비 - 표지 된 스트렙 타비 딘 (STV)와 함께 배양 된 정착 전에 적용하는 경우 외, 첨부 된 비리 온으로부터 신호가 폐기 될 수있다. 다음 단계에서, 바이오틴 IAV 부착 다음, 온도는 37 ° C로 시프트하고, 바이러스 입자의 내재화가 일어나는 것이 허용된다. 내면화 입자함으로써 외의의 뜻과 세포 내 바이러스 사이의 차별을 허용하는 STV의 결합으로부터 보호됩니다.

실험 조건 당 4 개의 샘플이 필요한 '0 분'첫번째 샘플, 표지 된 '0 분', 세포 표면에 결합 된 초기 바이러스를 측정하는 방법이다. '0 분 + STV': 제 2 샘플, '0 분 + STV'표시는, 실험의 기준 신호 강도를 제공한다. 첨부 된 바이러스는 재치 차단시간 STV와 STV-를 Cy3와 신호 다음 염색 '0 분'샘플에 비해 훨씬 낮은해야합니다. '30 분 '세 번째 샘플, '30 분'이 때문에 30 분 동안 37 ° C의 온도 변화에 부착 바이러스를 내면화 포함되어 있습니다. '30 분 + STV '네 번째 샘플, '30 분 + STV'조치 바이러스의 세포 내 부분. STV 차단 단계는 30 분 잠복기 후에 적용됩니다. 결과적으로, 세포 표면에 바이러스 입자가 STV-Cy3에 염색 만 내재화 바이러스 가능한 이탈 STV에 구속된다. 내재화 바이러스의 상대적인 양은 '(샘플 '30 분 설명) 바이러스의 총량으로 나눈 값 (샘플 '30 분 + STV 측정)'내재화 바이러스의 비율로 계산 될 수있다.

컨트롤로서 우리는 모의 감염된 세포를 포함하는 것이 좋습니다. 모의 - 감염된 세포의 STV-Cy3에 염색 다음 신호는 배경을 준다염색 프로토콜의 결과. IAV 부착용 제어 세균 뉴 라미니다 제 (NA)와 세포의 전처리이다. 세포 당 단백질의 시알 산 오프 NA 클리브는함으로써 세포 표면 수용체에서 부착을 제거하는 단계를 포함한다. 아 지드 화 나트륨 (SA)의 강력한 억제제 인 대사시켜 블록 (13)은 세포 내 이입. 아 지드 화 나트륨으로 처리 된 세포는 국제화를위한 바인딩 바이러스 양성하지만 부정적인해야한다.

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Protocol

전에 시작 주 : 사용 층류 후드 및 적절한 biocontainment을 라이브 바이러스에 작업 할 때. 여기서는 배양 인플루엔자 바이러스 균주 A / WSN / 33에 적합한 성장 조건을 설명한다. 감염의 다중성 (MOI)와 배양 시간은 사용 바이러스 균주에 따라 달라질 수 있습니다.

바이오틴 / WSN / 33 바이러스의 1. 준비

  1. 시드 Madin-다비 송곳니 kindey (MDCK), 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용하여 2 cm의 T175 플라스크에 세포. 약 70 %의 전면 생장까지 37 ℃에서 배양 된 세포로 진행한다.
  2. 감염 전에 배지 제거하고 세포 단층을 덮도록 충분한 양을 첨가하여 인산염 완충 식염수 (PBS, pH7.0-7.3)으로 세포를 세척 하였다.
  3. PBS를 제거하고 10-4의 방어와 A / WSN / 33 세포를 감염. PBS에 바이러스를 희석은 0.02 mg의 마그네슘 2+, 0.01 mg의 칼슘 2 + <보충/ SUP>, 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % 펜 / 스트렙토 (감염-PBS). T175의 CM 2 플라스크 4 ml로 접종을 사용합니다.
  4. 세포를 37 ℃에서 1 시간을 품어. 플라스크에 0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 펜 / 연쇄상 구균 보충 열망과 피펫 (10)의 ML의 DMEM에 의해 접종을 제거합니다.
  5. 다음 수확 뜨는 볼 수 있으며, 세포 변성 효과 (CPE)까지 약 3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품어. CPE는 분리 셀 (14)의 죽음 뒤에 세포의 반올림으로 인식 될 수있다.
  6. 세포 파편을 제거하기 위해 5 분 동안 450 XG에 뜨는 스핀. 새로운 팔콘 튜브에 뜨는을 전송하고이 단계를 한 번 더 반복한다. 알약을 폐기하십시오.
  7. 초 원심 분리기 튜브 및 NTE 완충액 (10 mM 트리스 [pH 7.4의, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)에 희석 30 % 수크로오스 5 ㎖와 언더 상청액에 넣고 상청액. 초 원심 분리하기 전에 튜브 균형 및 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 채워. 스핀 superna112,398 XG에 tants은 초 원심 분리기 90 분 (SW28 로터 25,000 RPM에 해당).
  8. 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS에 4 ℃에서 하룻밤 바이러스 펠렛을 흡수. 로 pipetting 아래로 재현 탁 펠렛. 브래드 포드 분석에 의해 정제하여 15 바이러스의 단백질 함량을 측정한다.
  9. 비오틴은 / WSN / 33을 생성하는 바이오 틸 키트를 사용합니다. 제조업체의 지시를 따르십시오.
  10. 간단히, 정제 된 바이러스에 비오틴을 적당량 추가하고 얼음에 2 시간 동안 배양한다. 초 원심 분리기 튜브에 바이러스를 옮기고 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 관을 채운다. 초 원심 분리기에서 90 분 동안 112,389 XG에 바이러스를 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 밤새 펠렛을 만끽 해보세요. 분취 량은 최소 24 개월 동안 안정 할 것이다 -80 ° C에 보관 비오틴 바이러스를 저장.
    참고 :이 바이오틴 (P)의 역가를 결정하는 데 도움이 될 수표준 상패 분석​​에 의해 IAV의 배상. 그러나, 후속 프로토콜 만 비오틴 바이러스 입자를 측정하는 것을 유의해야한다. 불완전한 바이오 틸 unbiotinylated 입자에 남은 플라크 분석으로 아니라 첨부 / 내재화 분석에서 측정 된 신호에 전염성 역가에 기여할 것이다.

2. 바이오틴 바이러스의 필요한 양을 결정

주 : 부착 / 내재화 분석이 수행되기 전에, 그 시료의 모든 세포를 감염시킬 필요 비오틴 바이러스의 양을 결정하는 것이 중요하다.

  1. 문화 및 제조자의 지시에 따라 세포를 Trypsinize A549. 셀 챔버를 사용하여 세포를 카운트. FACS 피펫 200,000 A549 세포 튜브 deepwell. 스핀 450 X g에서 3 분. 200 μL PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 쿨 세포 아래로 얼음에 10 분 동안.
  2. bioti의 5 배 연속 희석을 준비감염 PBS에서 nylated 바이러스 재고.
  3. 450 x g에서 3 분 동안 4 ℃에서 세포를 포함하는 스핀 튜브. 100 μL 바이러스 함유 감염 PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 바이오틴 바이러스없이 모의 제어 사용 감염 PBS로. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 품어.
  4. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복한다.
  5. 고정 용, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다.
  6. 투과성으로 들어, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 0.5 % 트리톤 X-100을 포함하는 100 μl의 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 6 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다.
  7. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거PBS가 STV-Cy3에 함유 희석 50 μL, 2 %의 BSA 등. (참고, STV-Cy3에 적절한 농도는 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다 (1)의 농도로 시작합니다. 배 2 희석 최대 1 200 시험 :. 2400 우리의 손에, 1의 희석 : 입증 1,000 최적합니다.)
  8. 실온에서 어둠 속에서 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에서 설명하지만 PBS에 희석 200 μL 2 % BSA의 펠렛을 재현 탁.
  9. 16 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. Cy3에 양성 인구에 문입니다. A549 인구를 Cy3 양성 세포의 최대 수의 결과 비오틴 화 바이러스의 최저 농도를 선택한다.

3. 스트렙 타비 딘의 필수 양을 결정


주 : 세포 바이러스로부터 유래 된 차단 신호의 효율 분석의 검출 범위를 결정한다. 따라서, 가능한 한 많이 STV-Cy3에 신호를 폐지하는 것이 중요하다. 목STV의 필요량이 필요 전자는 (섹션 2에서 결정)를 사용 바이오틴 바이러스 주식의 양에 따라 달라집니다.

  1. 단계 2.1-2.4를 수행하지만, 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용합니다.
  2. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 STV의 5 배 희석액을 준비한다.
  3. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 50 μL STV 희석에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 모의 제어 사용함없이 PBS STV는 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨을 함유. 얼음에 30 분 동안 튜브를 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명.
  4. 단계 2.5-2.9를 수행합니다. 국제화 분석의 경우, (더 STV가 존재하지 않는에서 샘플에 비해)를 Cy3 신호의 강력한 블록의 결과 STV의 가장 낮은 농도를 선택합니다. 이를 위해, CY3 양성 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. 이상적 STV - 처리 샘플의 신호를 Cy3 모의 감염된로부터의 신호에 가까워 야가능한 세포.

4. 첨부 파일 / 내면화 분석


참고 : 분석을 시작하기 전에 모든 시약을 준비해야합니다. 프로토콜에 대한 세 가지 제어 결과 섹션 (모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 사전 처리 된 세포 및 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포)에 제시된 그룹 작은 변화가 필요합니다.

  1. 각각 200,000 A549 세포를 함유하는 16 deepwell 튜브를 준비한다. 다음 4 관으로 구성된 실험 세트, 3 제어 조건, 각각의 요구 4 튜브가 : 모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 (NA) -pretreated 세포와 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포. 각 그룹은 '0 분', '0 분 + STV', '30 분 ', '30 분 + STV'로 표시 4 관으로 구성되어 있습니다.
  2. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
  3. 450 X g에서 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (배양 배지)을 함유하는 200 ㎕의 DMEM에서 등. 37 ℃에서 30 분 동안 품어.
    주 : 사용 세균 뉴 라미니다 아제 (시알 리다 아제 비브리오 콜레라부터) ml의 세포를 재현 탁하는 배양 배지에서 희석 / 200 무 농도 : 뉴 라미 제어 옵션.
  4. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 아래로 그리고,이 단계 시원한 튜브를 한 번 더 반복한다.
  5. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. (감염 PBS에 희석 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용) 바이러스를 비오틴 100 μL에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 얼음에 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명.
    참고 : 사용하여 감염 PBS 바이러스없이 : 모의에 감염된 제어하십시오. 아 지드 화 나트륨 컨트롤 : 감염 PBS에 희석 사용 바이러스 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충.
  6. 찬성얼음에 감염 후 샘플의 cessing :
    1. 다른 샘플이 고정 될 때까지 '0 분'샘플은 4 ℃에서 단계 2.5 저장 샘플을 따르십시오.
    2. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 0 분 + STV '샘플, 스핀 튜브하십시오. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오.
    3. 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 '30 분 '샘플, 스핀 튜브하십시오. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오.
      주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충.
    4. '30 분 + STV '샘플 450 x g에서 3 분 동안 4 ° C에서 튜브를 회전. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 그런 다음, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오.
      주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충.
  7. 단계 2.6-2.8에 따라 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 각 샘플에 Cy3에 양성 세포의 비율을 결정한다.
  8. 비율 부착 바이러스 및 내면화 바이러스의 상대적인 양을 계산합니다.
    1. 첨부 된 바이러스의 양을 계산하기 위해,는 Cy3-positi의 비율을 사용하여게이트 된 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도를했습니다. 비교를 위해, 100 % (그림 4B)에 처리되지 않은 세포를 설정합니다.
      참고 : 첨부 된 바이러스의 비율이 "0 분"샘플에 의해 설명되어 있습니다.
    2. 내재화 된 바이러스의 양을 계산하기 위해, "30 분"의 샘플 (도 5B)에 「30 분 + STV "시료의 비율을 취.
      주의 : 전술 한 바와 같이, 양의 게이트를 Cy3 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다.

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Representative Results

네 개의 다른 실험 조건을 나타내는 만화는도 1에 도시되는 대표적인 실험의 결과는도 2에 제시된다 -. 5. "0 분"샘플에서 바이오틴 바이러스 초기 바인딩 된 STV-Cy3에 염색으로 가시화 될 수있는 세포를 대상으로 (도 1 및도 2). ( "0 분 + STV"샘플에서) 차단하는 단계가 적용되는 경우, 세포 표면에서 바이러스가 더 이상 STV-Cy3에 염색에 의해 검출 될 수 없다. 결과적으로, "0 분 + STV"샘플 신호 강도가 강한 (도 12) "0 분」시료에 비해 감소된다. 37 ° C까지 온도를 상승시, 첨부 된 바이러스는 세포 ( "30 분"샘플)에 흡수된다. 내면화 바이러스는 & #에서 신호 강도에 덜 극적인 하락을 초래 레이블이없는 STV와 차단에 민감하지 않다8220 아니오 STV 차단이 적용되지시킨 30 분 "샘플을 30 분 + STV"에 대하여 샘플 "(도 1 및도 2).

대조군으로 우리는 모의 감염 NA 처리 및 SA 처리를 채용. 4. 모의 감염된 세포는 실험 배경 신호 강도를 제공하고 대한 음성 대조군으로서 작용 부에 기재된 모든 실험 조건에 대한 3 표시를 Cy3에 양성 세포의 비율도 바이러스 첨부 파일 (그림 4). 바이러스 첨부 파일에 대한 추가 제어 세균 표현 NA와 치료입니다. NA는 세포 표면상의 당 단백질의 시알 산, IAV 부착 대한 수용체를 제거함으로써 세포 (17)를 대상 바이러스의 결합을 감소시킨다. 도 4에 도시 된 바와 같이, NA 치료 강하게 미처리 세포에 비해 약 90 %만큼 IAV 첨부 abrogates. 국제화와 관련하여, 우리는 컨트롤로 SA를 사용했다. SA의 TR eatment 신속하여 세포 내 이입 (13)와 같은 에너지를 소비하는 과정을 억제 세포 ATP 수준을 고갈시킨다. 동안 바이러스 입자의 감염 억제 내재화 후 SA와 세포 배양. (도 5에 도시) 내재화 바이러스의 상대적인 양은 미처리 세포에서 30 분 동안 37 ℃에서 배양하여 45 %로 약 10 %로 상승시켰다. 그러나 SA 처리에 따라, 상대적으로 내면화 바이러스의 백분율은 모두 약 15 %, 0 배양 세포 및 37 ° C에서 30 분이었다. 이것은 참으로, SA는 세포에 바이러스 입자의 효과적인 흡수를 줄일 수 있음을 나타냅니다.

그림 1
첨부 / 내재화 분석의 원리를 설명하는도 1의 분석 원리. 만화.= "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
IAV 부착 및 내재화에 대한 결과를도 2 주제. 비 처리 된 세포를 Cy3 신호의 신호 강도를 나타내는 (A) 히스토그램. 도시 된 바와 같이, "0 분 + STV", "30 분"과 "30 분 + STV"샘플 "0 분"입니다. A.에서 Cy3에 양성 세포 (B)의 비율 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
통제를 포함한 첨부 파일 및 국제화 3. 대표 결과 그림. 룽> 표시된 다음과 같은 치료를 Cy3 양성 A549 세포의 백분율. 있는 바와 같다 모의 감염, 치료, NA 처리 및 세포 SA는 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
뉴 라미니다 아제에 의해 바이러스 첨부 4. 억제 그림. (A) 히스토그램은 "0 분"샘플 Cy3에 신호 강도 표시. 모의에 감염된 및 NA-처리 된 세포 (붉은 색과 오렌지색에 각각) : 치료 (파란색) 세포와 두 개의 제어 샘플이 표시됩니다. 표시됨 A.에서 Cy3에 양성 세포 (B) 비율, 모의 치료 및 "0 분"샘플에서 세포를 NA가 처리됩니다. 비 처리 된 세포에 대한 값은 100 %로 설정 하였다.COM / 파일 / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 아 지드 화 나트륨 (SA)에 의해 바이러스 내재화 5. 억제. (A) 히스토그램 "30 분"의 Cy3에 신호 강도를 표시하고 "30 분 + STV"치료에서 샘플 (붉은 색과 오렌지색에 각각)와 SA- 세포 (파란색과 각각 녹색) 처리. 0과 30 분 후 치료와 SA-처리 된 세포에서 상대적으로 내면화 바이러스 (B)의 비율입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리의 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 바이러스 첨부 파일 및 내재화를 측정하는 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 사용에 비해 더 가깝게 모방하는 바이러스 감염 표지 야생형 바이러스의 사용을 허용한다. 우리 프로토콜 IAV의 부착 및 내재화를 측정하는 데 최적화되어 있지만 이는 다른 바이러스를 쉽게 적용 할 수있다. 유동 세포 계측법은 판독에 사용되는 바와 같이 또한, 공동 착색을 용이하게 목적 단백질의 과발현 다음 최저 또는 발현 수준을 테스트하기 위해 프로토콜 등을 첨가 할 수있다. 따라서, 분석은 개인의 필요에 따라 프로토콜의 변형을 허용한다. 참고로, 분석은 또한 운동 시간 정보를 통해 바이러스 내재화를 측정하고 얻기 시점 일련에 대하여 수행 될 수있다. 분석 알 수없는 국제화 반응 속도와 다른 바이러스 적용 할 것 인 경우에 특히 중요 할 수 있습니다.

하우버전, 그것의 검출 창 인해 바이러스 복제의 부재에의 부착 또는 내재화에 차이가 리니어 스케일에서 발생하는 상대적으로 작다는 것을 주목해야한다. 신뢰를 높이기 위해 우리가 통제를 포함한 권장 소음을 줄이기 위해 (예를 들어, 컨트롤 위의 설명) 여러 복제합니다. 나타낸 결과는 대표적인 실험을 묘사하는 동안, 우리는 다른 실험에 걸쳐 양호한 일관성을 관찰 예를 들어, 부착, Cy3에 양성 세포의 비율 60 내지 80 %의 밀집 상태에서 ranged; 내면화 바이러스에 대해 우리는 40 % -60 % 사이의 범위 값을 얻을.

분석이 시작되기 전에, 이러한 STV, STV를 Cy3 및 바이오틴 - 바이러스의 양 사용될 시약의 농도를 적정 작동하는 것이 중요하다. 시약 및 배양 시간의 양이 사용되는 세포주 및 바이러스 균주에 따라 다양 할 수 있습니다. 검출 창 바이러스 부착 부에 대한 양성 세포의 백분율을 최대화 할t는 0 분 + STV "샘플"에서 가능한 낮게하고 (비오틴 사용 바이러스의 양에 따라) 샘플 ""0 분, 「30 분에 가능한 한 높아야한다 (STV의 양에 사용 따라 ). 또한, 노이즈를 원심 분리 동안 4 ℃에서 세포를 유지하여 빙냉 PBS로 세척함으로써 감소 될 수있다.

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Acknowledgements

이 작품은 SST에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (31003A_135278)에서 교부금에 의해 지원되었다. MOP는 AXA 연구 기금 박사 보조금의 수혜자입니다. 우리는 그림 1의 디자인에 대한 도움말은 패트리샤 Nigg 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

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References

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