Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Immunology and Infection

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Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

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Abstract

Introduction

La entrada de los virus de influenza A (IAV) es un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión del virus a los receptores en la membrana plasmática de las células diana 1. El receptor para IAV es el ácido siálico que está presente en una gran variedad de glicoproteínas y glicolípidos. La hemaglutinina (HA) de proteína de IAV que está presente en la envoltura viral se une al ácido siálico y por lo tanto media en la unión de las partículas virales a la membrana plasmática de las células diana 2. El virus entra en las células a través de endocitosis mediada por clatrina, sino también a las vías de entrada alternativos, como macropinocitosis, se han descrito 6.3. La interacción entre HA y ácido siálico parece ser suficiente para mediar tanto, el apego y desencadenar la internalización de las partículas virales 7. Sin embargo, se han propuesto los receptores de ingreso alternativas y sus roles en la entrada IAV están siendo investigados 1,8,9.

Canallatualmente, se hacen esfuerzos para identificar los factores del huésped que están involucrados en el ciclo de vida viral con el objetivo de desarrollar urgentemente necesarias nuevas terapias antivirales 10-12. La entrada del virus sería un paso favorable para orientar el crecimiento IAV con el fin de bloquear la infección viral en su punto más temprano. Medición de las diferentes etapas de la entrada IAV experimentalmente es un reto ya que se requieren por lo general grandes cantidades de virus para detectar virus entrante. Además, el rango de detección de los cambios en la entrada del virus es solamente lineal debido a la falta de replicación viral. Esto pone de relieve la necesidad de ensayos con alta sensibilidad.

El ensayo que aquí presentamos permite la detección de virus unido a la superficie celular, así como la detección de virus internalizado en relación con la cantidad total de virus asociado a células. El uso de virus de tipo salvaje biotina permite la medición conveniente a través de tinción con STV-Cy3 y lectura por citometría de flujo. Virus biotinilado es frío ligado a la células para permitir la unión, sino evitar la internalización de las partículas virales. Las células pueden ser fijos, permeabilizaron y se tiñeron con STV-Cy3 para medir virus adjunto. La señal procedente de viriones extracelulares, adjuntos puede ser derogada si se aplica una etapa de bloqueo antes de la fijación en la que las células se incuban con estreptavidina no marcada (STV). En un siguiente paso, después de la fijación de biotina IAV, la temperatura se desplaza a 37 ° C y la internalización de las partículas virales se dejó que tuviera lugar. Partículas internalizadas están protegidos de la unión de STV permitiendo así que la discriminación entre virus extra e intracelulares.

Por condición experimental, se requieren cuatro muestras: '0 min': La primera muestra, con la etiqueta "0 min ', es medir el virus frío con destino en la superficie celular. '0 min + STV': La segunda muestra, con la etiqueta "0 min + STV ', da la intensidad de la señal de referencia del experimento. Virus adjunto se bloquea ingenioh STV y la señal después de la tinción con STV-Cy3 deberían ser mucho menor en comparación con la muestra '0 min'. '30 Minutos ': La tercera muestra, '30 minutos' contiene adjunta y el virus internalizado debido al cambio de temperatura a 37 ° C durante 30 minutos. '30 Min + STV ': La cuarta muestra, '30 minutos + STV' mide la fracción intracelular de virus. La etapa de bloqueo STV se aplica después del período de incubación 30 min. Como resultado, las partículas virales en la superficie celular están obligados por STV dejando solamente los virus internalizados disponible para la tinción con STV-Cy3. La cantidad relativa de virus internalizado se puede calcular como la relación de virus internalizado (medido en el '30 min + STV 'muestra) dividido por la cantidad total de virus (descrito por el '30 min' muestra).

Como controles se sugiere incluir las células infectadas. La señal después de la tinción STV-Cy3 de células infectadas da el fondoresultante de el protocolo de tinción. Un control para la fijación IAV es el pre-tratamiento de las células con neuraminidasa bacteriana (NA). Escinde NA fuera de ácido siálico de las glicoproteínas celulares, eliminando de este modo los receptores de unión de la superficie celular. La azida de sodio (SA) es un potente inhibidor metabólico y por lo tanto bloquea la endocitosis 13. Las células tratadas con azida de sodio deben ser positivos para la unión virus pero negativo para la internalización.

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Protocol

Nota antes del comienzo: la campana de flujo laminar y Uso biocontención adecuada cuando se trabaja con virus vivo. A continuación, describimos las condiciones de crecimiento adecuadas a la tensión virus de la influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidad de infección (MOI) de incubación y tiempos pueden variar dependiendo de la cepa de virus utilizada.

1. Preparación de biotinilado A / WSN / 33 Virus

  1. Las células en un matraz T175 cm 2 utilizando Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby Seed kindey canino (MDCK). Células de cultivo a 37 ° C hasta aproximadamente el 70% de confluencia se alcanza.
  2. Antes de la infección, retire medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH7.0-7.3) mediante la adición de un volumen lo suficientemente grande como para cubrir la monocapa de células.
  3. Retire PBS e infectar las células con A / WSN / 33 con una MOI de 10 -4. Diluir virus en PBS suplementado con 0,02 mg de Mg 2 +, 0,01 mg de Ca2 + </ sup>, 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA), y 1% Pen / Strep (infección-PBS). Utilice un inóculo de 4 ml para un matraz T175 cm 2.
  4. Se incuban las células 1 hora a 37 ° C. Retire inóculo por aspiración y pipeta 10 ml de DMEM suplementado con 0,3% de BSA, 20 mM HEPES, y el 1% penicilina / estreptomicina en el matraz.
  5. Se incuban las células a 37 ° C durante aproximadamente 3 días hasta que el efecto citopático (CPE) es visible, y después de la cosecha sobrenadante. CPE puede ser reconocido como el redondeo de las células seguido de desprendimiento y muerte de las células 14.
  6. Girar sobrenadante a 450 xg durante 5 min para eliminar restos celulares. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon y repita este paso una vez más. Deseche los pellets.
  7. Sobrenadantes de transferencia en tubos de ultracentrífuga y sobrenadantes de capas de base con 5 ml de sacarosa al 30% diluido en tampón NTE (10 mM de Tris [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibre los tubos antes de la ultracentrifugación y se llenan con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Girar supernatantes en 112.398 xg (correspondiente a 25.000 rpm para un rotor SW28) durante 90 min en una ultracentrífuga.
  8. Retire con cuidado el sobrenadante con la pipeta y disfrutar sedimento de virus durante la noche a 4 ° C en 250 l de PBS. Resuspender pellet pipeteando arriba y abajo. Mida el contenido de proteínas del virus purificado por Bradford ensayo 15.
  9. Utilice un kit de biotinilación para generar biotina A / WSN / 33. Siga las instrucciones del fabricante.
  10. En resumen, añadir la cantidad apropiada de biotina para el virus purificado y se incuba durante 2 h en hielo. Transferencia de virus a un tubo de ultracentrífuga y llenar el tubo con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Haga girar virus a 112.389 xg durante 90 minutos en una ultracentrífuga. Aspirar el sobrenadante con la pipeta y añadir 250 l de PBS. Remoje pellet durante la noche a 4 ° C. Alícuota y almacenar el virus biotinilado se almacenó a -80 ° C donde va a ser estable durante al menos 24 meses.
    NOTA: Puede ser útil para determinar el título de la p biotiniladoreparación de IAV por ensayo de placa estándar. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el protocolo posterior sólo medir partículas de virus biotinilado. Restante partículas no biotinilados debido a biotinilación incompleta contribuirá a la título infeccioso mediante ensayo en placa pero no a la señal medida en el ensayo de unión / internalización.

2. Determinar la cantidad necesaria de Biotinylated Virus

NOTA: Antes de realizar el ensayo de unión / internalización, es importante para determinar la cantidad de virus requerida para infectar biotinilado todas las células de una muestra.

  1. Cultura y células A549 trypsinize de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Contar las células por medio de una cámara de celular. Pipeta células 200.000 A549 en FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 200 l de PBS. Hacia abajo en hielo durante 10 min Super células.
  2. Preparar 5 veces diluciones seriadas del biotistock de virus en la infección por nylated-PBS.
  3. Centrifugar los tubos que contienen las células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l infección PBS que contiene el virus. Como el uso de control de la infección maqueta-PBS sin virus biotinilado. Incubar los tubos en hielo durante 1 hr.
  4. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más.
  5. Para la fijación, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l de 3,7% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4).
  6. Para permeabilización, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 l de PBS que contiene 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4).
  7. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet en 50 l 2% de BSA diluido en PBS que contenía STV-Cy3. (Tenga en cuenta que la concentración apropiada de STV-Cy3 debe determinarse antes de iniciar el experimento Comience con una concentración de 1:. 200 y la prueba 2 veces diluciones de hasta 1:. 2400 En nuestras manos, una dilución de 1: 1000 probado a ser óptimo.)
  8. Incubar 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4, pero resuspender el precipitado en 200 l 2% de BSA diluido en PBS.
  9. Analizar muestras por citometría de flujo 16. Puerta de la población Cy3-positivo. Elige la concentración más baja de virus biotinilado resultante en el número máximo de células Cy3-positivas en la población A549.

3. Determine la cantidad necesaria de estreptavidina


NOTA: La eficiencia de bloquear la señal derivada de virus extracelular determina el rango de detección del ensayo. Por lo tanto, es importante que se suprime la señal de STV-Cy3 tanto como sea posible. The cantidad necesaria de STV necesario depende de la cantidad de stock de virus biotinilado utilizado (determinado en la sección 2).

  1. Siga los pasos 2.1-2.4, pero el uso de concentración del virus determina en el apartado 2.
  2. Preparar diluciones seriadas de cinco veces de STV diluidos en PBS que contenía 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio.
  3. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV dilución. Como el uso de control de simulacro de PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio y sin STV. Incubar los tubos durante 30 min en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4.
  4. Siga los pasos 2,5-2,9. Para el ensayo de internalización, elegir la concentración más baja de STV que resulta en un fuerte bloque de la señal de Cy3 (en comparación con la muestra en la que no estaba presente STV). Para ello, el porcentaje de células Cy3-positivo o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar. Idealmente, la señal de Cy3 de muestras tratadas con STV debe ser lo más cercano a la señal de infectados por el simulacrocélulas como sea posible.

4. Adjunto / Ensayo Internalización


NOTA: Asegúrese de preparar todos los reactivos antes de comenzar el ensayo. Para los tres grupos de control que se presentan en la sección de resultados (células infectadas simuladas, las células pre-tratadas de la neuraminidasa y células azida sódica tratados) pequeñas alteraciones en el protocolo son obligatorios.

  1. Preparar 16 tubos para pozos profundos que contienen cada 200.000 células A549. Al lado del conjunto experimental que consta de 4 tubos, hay 3 condiciones de control, cada uno que requieren 4 tubos: las células infectadas, la neuraminidasa (NA) células -pretreated y células tratadas con azida de sodio. Cada grupo consta de 4 tubos etiquetados como "0 min", "0 min + STV ', '30 minutos', '30 minutos + STV '.
  2. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS.
  3. Centrifugar los tubos a 4 ° C a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet 200 en DMEM que contiene 0,3 l% de BSA, HEPES 20 mM y 1% (medio de incubación) penicilina-estreptomicina. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
    NOTA: Para el control de la neuraminidasa: Uso neuraminidasa bacteriana (por ejemplo, la sialidasa de Vibrio cholera) a una concentración de 200 mU / ml diluido en medio de incubación para resuspender las células.
  4. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más, a continuación, los tubos se enfríe en hielo durante 10 min.
  5. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l virus biotinilado (utilizar la concentración de virus determina en el apartado 2 diluido en la infección-PBS). Incubar 1 hora en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4.
    NOTA: Para el control de modelo de infectados: Uso infección PBS sin virus. Para el control de azida de sodio: Uso virus diluido en PBS-infección suplementado con 0,1% de azida de sodio.
  6. Proprocesamiento de las muestras después de la infección en hielo:
    1. Para las muestras '0 min', siga el paso 2.5 y almacenar las muestras a 4 ° C hasta que se fijan las otras muestras.
    2. Para el '0 min + STV' muestras, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C.
    3. Para las muestras de '30 minutos ', tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C.
      NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C.
    4. Para el '30 min + muestras STV 'giran tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Entonces, los tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C.
      NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C.
  7. Siga los pasos 2.6-2.8 y analizar muestras por citometría de flujo. Determinar el porcentaje de células Cy3-positivos en cada muestra.
  8. Calcular el porcentaje adjunta virus y la cantidad relativa de virus internalizado.
    1. Para calcular la cantidad de virus adjunto, utilice el porcentaje de Cy3-positive células cerradas o la intensidad de fluorescencia media de la señal de Cy3. Para la comparación, establezca las células no tratadas a 100% (Figura 4B).
      NOTA: El porcentaje de virus adjunto se describe por la muestra "0 min".
    2. Para calcular la cantidad de virus interiorizado, tomar la relación entre el "30 min + STV" muestra al "30 minutos" de la muestra (Figura 5B).
      NOTA: Como se mencionó anteriormente, el porcentaje de células cerradas positivos Cy3 o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar.

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Representative Results

Un dibujo animado que describe las cuatro condiciones experimentales diferentes se muestra en la Figura 1 Los resultados de un experimento representativo se presentan en las Figuras 2 -. 5. En la muestra "0 min", virus biotinilado es frío unida a células que pueden ser visualizadas por tinción STV-Cy3 objetivo (Figuras 1 y 2). Cuando se aplica una etapa de bloqueo (en el "0 min + STV" muestra), el virus en la superficie celular ya no puede ser detectado por tinción STV-Cy3. Como resultado, la intensidad de la señal en el "0 min + STV" muestra se reduce fuertemente en comparación con la muestra "0 min" (Figuras 1 y 2). Al aumentar la temperatura a 37 ° C, virus adjunto se recoge en las células (la muestra "30 minutos"). Virus internalizada no es sensible a bloqueo con STV no marcado que se traduce en una caída de menos dramático en la intensidad de señal en el & #8220; 30 min + STV "muestras relativas a la" muestra de 30 minutos "en la que se aplicó ningún bloqueo STV (Figuras 1 y 2).

Como controles se emplearon infección simulada, el tratamiento y el tratamiento NA SA. Figura 3 muestra los porcentajes de células Cy3-positivos para todas las condiciones experimentales descritas en el apartado 4. células infectadas dan la intensidad de la señal de fondo para el experimento y actúan como control negativo para fijación del virus (Figura 4). Un control adicional para la fijación del virus es el tratamiento con bacterias expresado NA. NA elimina el ácido siálico, el receptor para la unión IAV, a partir de las glicoproteínas en la superficie celular y por lo tanto reduce la unión del virus a las células 17 objetivo. Como se muestra en la Figura 4, el tratamiento con NA abroga fuertemente fijación IAV en aproximadamente un 90% en comparación con las células no tratadas. En cuanto a la internalización, se utilizó como control SA. SA tr atamiento agota rápidamente los niveles celulares de ATP inhibiendo así los procesos consumidores de energía, como la endocitosis 13. La incubación de las células con SA durante y después de la infección inhibida internalización de partículas virales. La cantidad relativa de virus internalizado (representado en la Figura 5) se elevó de aproximadamente 10% a 45% por incubación a 37 ° C durante 30 min en células no tratadas. Después del tratamiento SA sin embargo, el porcentaje de virus internalizado relativo fue de alrededor de 15% para ambos, células incubadas durante 30 min y 0 a 37 ° C. Esto indica que, efectivamente, SA reduce la absorción eficaz de partículas virales en las células.

Figura 1
Figura 1. Principio del ensayo. Dibujos animados que explica el principio del ensayo de fijación / internalización.= "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. resultado representativo para IAV unión e internalización. (A) Histograma que muestra la intensidad de señal de la señal de Cy3 para las células no tratadas. Se muestran el "0 min", "0 min + STV", "30 minutos" y la muestra "30 min + STV". (B) Porcentaje de células Cy3-positivos de A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. resultado Representante para la unión y la internalización incluidos los controles. rong> Porcentaje de células A549 Cy3-positivos después del tratamiento indicado. Se muestran infectados de forma simulada, no se trata, NA-tratada y células SA-tratada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. La inhibición de la unión del virus de la neuraminidasa. (A) Histograma que muestra la intensidad de la señal Cy3 de muestras "0 min". Se muestra son células no tratadas (en azul) y dos muestras de control: las células maqueta infectados y tratados con NA (en rojo y naranja, respectivamente). (B) Porcentaje de células Cy3-positivos de A. Se muestra son simulacro, sin tratar y células NA-tratada de la muestra "0 min". El valor para las células no tratadas se fijó en 100%.com / files / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Inhibición de la internalización del virus por azida de sodio (SA). (A) Histograma que muestra la intensidad de la señal del Cy3 "30 min" y las muestras sin tratar de "30 min + STV" (en rojo y naranja, respectivamente) y SA- tratado (en azul y verde, respectivamente) células. (B) Porcentaje de virus interiorizado relativa de las células tratadas y no tratadas-SA después de 0 y 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Nuestro protocolo describe una manera fácil de medir la fijación del virus y la internalización por citometría de flujo. Se permite el uso de virus de tipo salvaje marcado que imita más estrechamente las infecciones de virus en comparación con el uso de partículas similares a virus (VLP). Mientras que nuestro protocolo se ha optimizado para medir unión e internalización de IAV puede ser fácilmente adaptado para otros virus. Además, como la citometría de flujo se utiliza para la lectura, los compañeros de tinciones pueden ser fácilmente añadidos al protocolo por ejemplo, para poner a prueba los niveles de expresión después de caída o sobreexpresión de una proteína de interés. Por lo tanto, el ensayo permite modificaciones del protocolo dependiendo de las necesidades individuales. De nota, el ensayo también se puede realizar para una serie de puntos de tiempo para medir la internalización del virus en el tiempo y obtener información cinética. Esto podría ser particularmente importante si el ensayo fueron a ser adaptado para un virus diferente con la cinética de internalización desconocidos.

However, hay que señalar que la ventana de detección es relativamente pequeño como las diferencias en apego o internalización se producen en una escala lineal debido a la ausencia de la replicación viral. Para aumentar la confianza y para reducir el ruido se recomienda incluidos los controles (por ejemplo, los controles describen más arriba) y varias repeticiones. Mientras que los resultados mostrados representan un experimento representativo, se observó una buena consistencia a través de diferentes experimentos: Por ejemplo, para la fijación, el porcentaje de células positivas Cy3-oscilaba entre 60-80%; para el virus internalizada obtuvimos valores que oscilan entre 40 a 60%.

Antes de iniciar el ensayo, es importante para valorar las concentraciones de trabajo de los reactivos utilizados, tales como STV, STV-Cy3 y la cantidad de virus biotinilado. Tenga en cuenta que la cantidad de reactivos y tiempos de incubación puede variar dependiendo de la línea celular y la cepa del virus utilizado. Para maximizar la ventana de detección, el porcentaje de células positivas para attachmen virust debe ser tan alta como sea posible en el "0 min y" 30 min "de la muestra (en función de la cantidad de virus biotinilado utilizado) y tan bajo como sea posible en el" 0 min + STV muestra "(dependiendo de la cantidad de STV utilizado ). Además, el ruido puede reducirse manteniendo las células a 4 ° C durante la centrifugación y por lavado con PBS enfriado con hielo.

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Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31003A_135278) para SSt. MOP es el beneficiario de una beca de doctorado del Fondo de Investigación AXA. Agradecemos a Patricia Nigg en busca de ayuda con el diseño de la figura 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

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References

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