Måling Vedlegg og internalisering av Influensa A virus i A549-celler ved flowcytometri

1Institute of Medical Virology, University of Zurich
Published 11/04/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Oppføringen av influensa A virus (IAV) er en flertrinnsprosess som starter med bindingen av viruset til reseptorer på plasmamembranen av målceller 1. Reseptoren for IAV er sialinsyre som er tilstede på et stort utvalg av glykoproteiner og glykolipider. Hemagglutinin (HA) av IAV protein som er tilstede i den virale kappe bindes til sialsyre og derved formidler festing av viruspartikler til plasmamembranen av målceller 2. Viruset kommer inn i cellene via clathrin endocytose, men også alternative inngangsveier, for eksempel macropinocytosis, har blitt beskrevet 3-6. Samspillet mellom HA og sialinsyre synes å være tilstrekkelig for å mediere både feste og utløsning internalisering av virale partikler 7. Likevel har alternative inngangs reseptorer blitt foreslått og deres roller i IAV oppføringen er for tiden under etterforskning 1,8,9.

Currently, søker man å identifisere vertsfaktorer som er involvert i den virale livssyklus med sikte på å utvikle haster nye antiviral terapi 10-12. Virus entry ville være en gunstig skritt for målretting IAV vekst for å blokkere viral infeksjon ved dens tidligste punkt. Måling forskjellige stadier av IAV inngangs eksperimentelt er utfordrende som vanligvis store mengder av virus er nødvendig for å detektere innkommende virus. I tillegg er deteksjonsområde for endringer i virus angivelse lineær på grunn av mangel på viral replikasjon. Dette understreker behovet for analyser med høy følsomhet.

Analysen vi presenterer her tillater påvisning av bundet virus ved celleoverflaten, samt påvisning av virus internalisert i forhold til den totale mengden av celle-assosiert virus. Bruken av biotinylert villtype-virus gir praktisk måling ved farging med STV-Cy3 og avlesning ved strømningscytometri. Biotinylated virus er kald-bundet til celles for å tillate vedlegg, men hindre internalisering av viruspartikler. Celler kan fikses, permeabilized og farget med STV-Cy3 å måle festet virus. Signalet fra ekstracellulære, festet virioner kan oppheves hvis en blokkeringstrinn påføres før fiksering i hvilken cellene blir inkubert med ikke-merket streptavidin (STV). I et neste trinn, etter feste av biotinylert IAV, blir temperaturen skiftet til 37 ° C og internalisering av virale partikler tillates å finne sted. Internalisert partikler er beskyttet mot binding av STV dermed tillater diskriminering mellom ekstra og intracellulære virus.

Per eksperimentell tilstand, er fire prøver kreves: '0 min': Den første prøven, merket '0 min', er å måle kald-bundet virus ved celleoverflaten. '0 min + STV': den andre prøven, merket '0 min + STV', gir referansesignalintensiteten av forsøket. Vedlagt virus blokkeres viddh STV og signalet etter farging med STV-Cy3 bør være mye lavere enn i '0 min' prøven. '30 Min ': Den tredje prøve, '30 min' inneholder bundet og internalisert virus på grunn av temperaturen skiftet til 37 ° C i 30 min. '30 Min + STV ': Den fjerde prøven, '30 min + STV' tiltak den intracellulære brøkdel av virus. Den STV blokkeringstrinn påføres etter 30 min inkubasjonstid. Som et resultat, er virale partikler på celleoverflaten bundet av STV slik at bare internaliserte virus er tilgjengelig for farging med STV-Cy3. Den relative mengde av internalisert virus kan beregnes som forholdet mellom internalisert virus (målt i '30 min + STV 'sample) dividert med den totale mengden av virus (beskrevet av '30 minutter "prøve).

Som kontroller vi foreslår å inkludere mock-infiserte celler. Signalet følgende STV-Cy3 farging av mock-infiserte celler gir bakgrunnsom følge av fargings protokollen. En kontroll for IAV vedlegget er forbehandling av celler med bakteriell neuraminidase (NA). NA spalter off sialinsyre fra cellulære glykoproteiner, for derved å fjerne feste reseptorer fra celleoverflaten. Natriumazid (SA) er et potent metabolsk inhibitor, og derved blokkerer endocytose 13. Celler behandlet med natriumazid bør være positivt for viruset bindende, men negativt for internalisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk før start: Bruk laminær hette og hensiktsmessig biocontainment når du arbeider med levende virus. Her beskriver vi vekstforhold som passer til kultur influensavirus A / WSN / 33. Multiplisitet av infeksjon (MOI), og inkubasjonstidene kan variere avhengig av virusstamme anvendes.

1. Fremstilling av biotinylert A / WSN / 33 virus

  1. Seed Madin-Darby hunde kindey (MDCK) celler inn i en T175 cm2 kolbe ved hjelp av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (Pen / Strep). Kultur celler ved 37 ° C inntil omtrent 70% konfluens er nådd.
  2. Før infeksjon, fjern mediet og vask celler med fosfat-bufret saltvann (PBS, pH7.0-7.3) ved tilsetning av et stort nok volum til å dekke cellemonolag.
  3. Fjern PBS og infisere celler med A / WSN / 33 med en MOI på 10 -4. Fortynn virus i PBS supplert med 0,02 mg Mg2 +, Ca2 + 0,01 mg </ sup>, 0,3% bovint serum albumin (BSA), og 1% Pen / Strep (smitte-PBS). Bruke et inokulum av 4 ml av en T175 cm2 kolbe.
  4. Inkuber cellene 1 time ved 37 ° C. Fjern inokulat ved aspirasjon og pipettes 10 ml DMEM supplementert med 0,3% BSA, 20 mM HEPES og 1% Pen / Strep inn i kolben.
  5. Inkuber cellene ved 37 ° C i ca. 3 dager til cytopatisk effekt (CPE) er synlig, og deretter høste supernatanten. CPE kan bli anerkjent som avrunding opp av celler etterfulgt av løsrivelse og død av celler 14.
  6. Spin supernatanten ved 450 xg i 5 min for å fjerne celleavfall. Overfør supernatanten til et nytt falk rør og gjenta dette trinnet en gang til. Kast pellets.
  7. Overfør supernatanten til ultrasentrifuge-rør og underlags supernatantene med 5 ml 30% sukrose fortynnet i NTE-buffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Balansere rør før ultrasentrifugering og fylle opp med PBS å nå en slutt volum på 30 ml. Spin supernatants ved 112398 x g (svarende til 25 000 rpm i en SW28 rotor) i 90 minutter i en ultrasentrifuge.
  8. Fjern forsiktig supernatanten ved pipettering og suge virus pellet natten ved 4 ° C i 250 mL PBS. Resuspender pellet ved å pipettere opp og ned. Måle proteininnholdet i renset virus ved Bradford assay 15.
  9. Bruk en biotinylering kit å generere biotinylerte A / WSN / 33. Følg instruksjonen på produsenten.
  10. I korte trekk, tilsett passende mengde av biotin til det rensede virus og inkuber i 2 timer på is. Overfør virus til et ultrasentrifugerør og fylle røret med PBS for å nå en sluttvolum på 30 ml. Spin virus på 112 389 xg i 90 minutter i en ultrasentrifuge. Fjern supernatanten ved pipettering og legge 250 mL PBS. Sug pellet over natten ved 4 ° C. Alikvot og lagre Biotinylert virus lagres ved -80 ° C, der den vil være stabil i minst 24 måneder.
    NB: Det kan være nyttig for å bestemme titeren av biotinylert poppreisning av IAV av standard plakk analysen. Imidlertid bør det bemerkes at den etterfølgende protokollen vil bare måle biotinylerte viruspartikler. Gjenværende unbiotinylated partikler på grunn av ufullstendig biotinylering vil bidra til den smittsomme titer ved plakk-analyse, men ikke til signalet målt ved festing / internalise assay.

2. Bestem nødvendige mengden av Biotinylated Virus

MERK: Før feste / internalise assay blir utført, er det viktig å bestemme mengden av biotinylert virus som kreves for å infisere alle celler i en prøve.

  1. Kultur og trypsineres A549 celler i henhold til produsentens instruksjoner. Tell cellene ved hjelp av en cellekammer. Pipettes 200.000 A549 celler i FACS Deepwell rør. Spin 3 min ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet med 200 mL PBS. Cool celler ned på is i 10 min.
  2. Forbered 5-fold serielle fortynninger av biotinylated virus lager i smitte-PBS.
  3. Spin rør inneholdende cellene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten med 100 mL virus-infeksjon-inneholdende PBS. Som mock kontroll bruk infeksjon-PBS uten biotinylerte virus. Inkuber rørene på is i 1 time.
  4. Spin rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 mL PBS. Gjenta dette trinnet en gang til.
  5. For fiksering, spinn rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 100 pl 3,7% paraformaldehyd (PFA). Inkuber i 10 min ved RT. Deretter gjentar vasketrinn beskrevet i 2.4).
  6. For permeabilization, ring rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 100 pl PBS inneholdende 0,5% Triton X-100. Inkuber i 6 min ved RT. Deretter gjentar vasketrinn beskrevet i 2.4).
  7. Spin rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pelli et 50 ul 2% BSA fortynnet i PBS inneholdende STV-Cy3. (Legg merke til den passende konsentrasjon av STV-Cy3 bør bestemmes før forsøket starter med en konsentrasjon på 1:. 200 og test 2-gangers fortynninger opptil 1:. 2400 I våre hender, en fortynning på 1: 1000 viste å være optimal.)
  8. Inkuber 1 time i mørke ved RT. Deretter gjenta vasketrinnet som er beskrevet i 2.4, men resuspender pelleten i 200 ul 2% BSA fortynnet i PBS.
  9. Analysere prøver av flowcytometri 16. Gate på Cy3-positive populasjonen. Velge den laveste konsentrasjon av biotinylert virus som resulterer i maksimalt antall Cy3-positive celler i populasjonen A549.

3. Bestem nødvendige mengden av streptavidin


MERK: Effektivitet blokkerer signal utledet fra ekstracellulære virus bestemmer deteksjons området av analysen. Derfor er det viktig å oppheve STV-Cy3-signalet så mye som mulig. The nødvendige mengde av STV er nødvendig er avhengig av mengden av biotinylert virus lager som brukes (bestemt i avsnitt 2).

  1. Følg trinn 2,1-2,4, men bruke virus konsentrasjonen fastsatt i § 2.
  2. Forbered fem-gangers seriefortynninger av STV fortynnet i PBS inneholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid.
  3. Spin rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 50 mL STV fortynning. Som mock-kontroll bruk PBS inneholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid uten STV. Inkuber rørene i 30 minutter på is. Deretter gjenta vasketrinn beskrevet i 2.4.
  4. Følg trinn 02.05 til 02.09. For internalise assay ved å velge den laveste konsentrasjon av STV resulterer i en sterk blokk av Cy3-signal (sammenlignet med prøven som ikke var til stede STV). For dette, kan prosentandelen av Cy3-positive celler eller den midlere fluorescensintensitet av Cy3 signal benyttes. Ideelt sett bør Cy3 signal av STV-behandlede prøvene, være så nær opp til signalet fra mock-infisertceller som mulig.

4. Tilbehør / Intern Assay


MERK: Sørg for å forberede alle reagenser før du starter analysen. For de tre kontrollgruppene som er presentert i resultatene delen (mock-infiserte celler, neuraminidase pre-behandlede celler og natriumazid behandlede celler) små endringer i protokollen er nødvendig.

  1. Forbered 16 Deepwell rør som hver inneholder 200.000 A549 celler. Ved siden av den eksperimentelle sett bestående av 4 rør, det er 3 kontroll forhold, hver krever 4 rør: mock-infiserte celler, neuraminidase (NA) -pretreated celler og natriumazid-behandlede celler. Hver gruppe består av 4 rør merket som '0 min', '0 min + STV', '30 min ', '30 min + STV'.
  2. Spin rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 mL PBS.
  3. Spin rør ved 4 ° C ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 ul DMEM inneholdende 0,3% BSA, 20 mM HEPES og 1% penicillin-streptomycin (inkubasjonsmedium). Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    NB: For den neuraminidase-kontroll: Bruk bakteriell neuraminidase (sialidase for eksempel fra Vibrio cholera) ved en konsentrasjon på 200 mU / ml fortynnet i inkubasjonsmedium for å resuspendere cellene.
  4. Spin rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 mL PBS. Gjenta dette trinnet en gang til, så kule rør ned på is i 10 min.
  5. Spin rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 100 mL biotinylerte virus (bruk virus konsentrasjonen fastsatt i § 2 fortynnet i smitte-PBS). Inkuber 1 time på is. Deretter gjenta vasketrinn beskrevet i 2.4.
    MERK: For mock-infiserte kontroll: Bruk infeksjon-PBS uten virus. For natriumazid kontroll: Bruk virus fortynnet i PBS-infeksjon supplert med 0,1% natriumazid.
  6. Proling av prøvene etter infeksjonen på is:
    1. For de "0 min 'prøver, følg trinn 2,5 og lagre prøvene ved 4 ° C til de andre prøvene er faste.
    2. For den "0 min + STV 'prøver, ring rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 50 mL STV (bruk konsentrasjonen bestemt i avsnitt 3) fortynnet i PBS inneholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid (for å hindre intern ved håndtering av prøven). Inkuber 30 min på is. Følg trinn 2,4-2,5 og lagre prøvene ved 4 ° C.
    3. For de '30 min 'prøver, ring rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 200 pl PBS inneholdende 2% BSA. Inkuber 30 min ved 37 ° C. Følg trinn 2,4-2,5 og lagre prøvene ved 4 ° C.
      NB: For natriumazid kontroll: Bruk PBS supplert med 2% BSA og 0,1% natriumazid i 30 min inkubasjon ved 37 ° C.
    4. For '30 min + STV 'prøver å spinne rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 200 pl PBS inneholdende 2% BSA. Inkuber 30 min ved 37 ° C. Deretter ring rørene ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 50 mL STV (bruk konsentrasjonen bestemt i avsnitt 3) fortynnet i PBS inneholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid (for å hindre intern ved håndtering av prøven). Inkuber 30 min på is. Følg trinn 2,4-2,5 og lagre prøvene ved 4 ° C.
      NB: For natriumazid kontroll: Bruk PBS supplert med 2% BSA og 0,1% natriumazid i 30 min inkubasjon ved 37 ° C.
  7. Følg trinn 2,6-2,8 og analysere prøver av flowcytometri. Bestemme prosentandelen Cy3-positive celler i hver prøve.
  8. Beregn prosentandelen er festet viruset, og den relative mengde av internalisert virus.
    1. For å beregne mengden av vedlagte virus, bruker andelen Cy3-positive gated celler eller den midlere fluorescensintensitet av Cy3 signal. Til sammenligning satt ubehandlede celler til 100% (figur 4B).
      MERK: Prosentandelen av vedlagte virus er beskrevet av "0 min" sample.
    2. For å beregne mengden av internalisert virus, ta forholdet mellom "30 min + STV" sample til "30 min" sample (figur 5B).
      MERK: Som nevnt ovenfor, kan prosentandelen av positive Cy3 gated celler eller den midlere fluorescensintensitet av Cy3 signal benyttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tegneserie beskriver fire forskjellige forsøksbetingelser er vist i Figur 1. Resultatene fra et representativt eksperiment er vist i figurene 2 -. 5. I "0 min" sample, er biotinylert virus kald bundet til målceller som kan bli visualisert ved STV-Cy3-farging (figur 1 og 2). Når en blokkeringstrinn (i "0 min + STV" sample) blir påført, kan virus ved celleoverflaten ikke lenger kan påvises ved STV-Cy3 farging. Som et resultat, er signalintensiteten i "0 min + STV" sample sterkt redusert i forhold til "0 min" sample (figur 1 og 2). Ved å heve temperaturen til 37 ° C, er festet virus tas opp i cellene ("30 min" sample). Internalisert virus er ikke følsom for blokkering med umerket STV som resulterer i en mindre dramatisk fall i signalintensitet i & #8220; 30 min + STV "samples i forhold til" 30 min "sample hvor ingen STV blokkering ble anvendt (figur 1 og 2).

Som kontroller vi ansatt mock infeksjon, NA behandling og SA behandling. Figur 3 viser prosenter av Cy3-positive celler for alle eksperimentelle forhold som er beskrevet i kapittel 4. mock-infiserte celler gi bakgrunnen signalintensitet for forsøket og fungere som negativ kontroll for virus vedlegg (figur 4). En ekstra kontroll for virus vedlegget er behandling med bacterially uttrykt NA. NA fjerner sialinsyre, reseptoren for IAV vedlegg fra glykoproteiner på celleoverflaten og derved reduserer binding av virus til målceller 17. Som vist i figur 4, behandling med NA opphever sterkt IAV feste med ca. 90% i forhold til ubehandlede celler. Angående intern brukte vi SA som kontroll. SA tr eatment raskt tapper cellulære ATP nivåer og dermed begrenser energikrevende prosesser som endocytose 13. Inkubering av celler med SA under og etter infeksjon hemmet internalisering av viruspartikler. Den relative mengde av internalisert virus (vist i figur 5) ble hevet fra omkring 10% til 45% av inkubering ved 37 ° C i 30 minutter i ubehandlede celler. Etter SA behandling er imidlertid prosentandelen av relative internalisert virus var rundt 15% for begge, celler inkubert for 0 og 30 min ved 37 ° C. Dette indikerer at faktisk reduserer SA den effektive opptak av viruspartikler inn i celler.

Figur 1
Figur 1. Prinsipp for analysen. Tegneserie forklare prinsippet for feste / internalise assay.= "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Representant resultat for IAV vedlegg og internalisering. (A) Histogram som viser signalstyrken for Cy3 signal for ubehandlede celler. Vist er "0 min", "0 min + STV", "30 min" og "30 min + STV" sample. (B) Prosent av Cy3-positive celler fra A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representant resultat for tilknytning og intern inkludert kontroller. rong> Andel Cy3-positive A549 celler følgende angitte behandling. Vist er mock-smittet, ubehandlet, NA-behandlet og SA-behandlede celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Hemming av virus vedlegg av neuraminidase. (A) histogram som viser Cy3 signalintensiteten fra "0 min" prøver. Viste er ubehandlede celler (i blått) og to kontrollprøver: mock-infiserte og NA-behandlede celler (i rødt og oransje, henholdsvis). (B) Prosent av Cy3-positive celler fra A. Vist er uekte, ubehandlet og NA-behandlede celler fra "0 min" sample. Verdien for ubehandlede celler ble satt til 100%.com / filer / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Inhibering av virus internalisering av natriumazid (SA). (A) histogram som viser Cy3 signalintensiteten av "30 minutter" og "30 min + STV" prøver fra ubehandlede (i de røde og orange, henholdsvis) og SA- behandlet (i blått og grønt, respektive) celler. (B) Prosent av relativ internalisert virus fra ubehandlede og SA-behandlede celler etter 0 og 30 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår protokollen beskriver en enkel måte å måle virus tilknytning og internalisering ved strømningscytometri. Det tillater bruk av merket villtype-virus som etterligner tettere virusinfeksjoner sammenlignet med anvendelsen av viruslignende partikler (VLP). Mens vår protokollen har blitt optimalisert for å måle tilknytning og internalisering av IAV det kan lett tilpasses for andre virus. I tillegg, som flowcytometri brukes for avlesning, co-stainings enkelt kan legges til protokollen f.eks å teste uttrykk nivåer etter knockdown eller overekspresjon av et protein av interesse. Dermed kan analysen for modifisering av protokollen, avhengig av de individuelle behov. Til opplysning kan analysen også utføres for en rekke tidspunkter for å måle virus internalisering over tid, og innhente bevegelsesinformasjon. Dette kan være spesielt viktig dersom analysen var å være tilpasset for et annet virus med ukjente internalisekinetikk.

However, bør det bemerkes at vinduet for påvisning er forholdsvis liten, som forskjeller i vedlegg eller internalisering forekommer på en lineær skala på grunn av fravær av viral replikasjon. Å øke tilliten og for å redusere støy vi anbefale inkludert kontroller (f.eks kontrollene beskrevet over) og flere paralleller. Mens resultatene vist skildre et representativt eksperiment, observerte vi god konsistens på tvers av ulike eksperimenter: For eksempel, for vedlegg, prosentandelen av Cy3-positive celler varierte fra 60-80%; for internalisert virus vi oppnådd verdier som varierer mellom 40-60%.

Før analysen ble startet, er det viktig å titrere arbeids konsentrasjoner av de anvendte reagenser slik som STV, STV-Cy3 og mengden av biotinylert virus. Legg merke til at mengden av reagenser og inkubasjonstider kan variere avhengig av cellelinjen og virusstamme anvendes. For å maksimere vinduet for gjenkjenning, prosentandelen av celler positivt for viruskoplet bør være så høyt som mulig i "0 min og" 30 min "sample (avhengig av mengden av biotinylert virus brukes), og så lavt som mulig i" 0 min + STV "sample (avhengig av mengden av STV brukt ). I tillegg kan støy reduseres ved å holde cellene ved 4 ° C i løpet av sentrifugering og ved vasking med iskald PBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra den sveitsiske National Science Foundation (31003A_135278) til SST. MOP er mottaker av et doktorgradsstipend fra AXA forskningsfond. Vi takker Patricia Nigg for hjelp med utforming av figur 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
  4. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
  5. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
  6. Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
  7. Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
  8. Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
  9. Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
  10. Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
  11. Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
  12. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
  13. Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
  14. Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  16. Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. Humana Press. (2007).
  17. Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats