मानव तालु Tonsils से बी और टी lymphocytes के लिए कुशल अलगाव प्रोटोकॉल

Immunology and Infection

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Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

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Abstract

Protocol

प्रोटोकॉल मानव रोगी सामग्री से लसीकावत् कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है और इसलिए एक नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता है। वर्तमान अध्ययन में किए गए कार्य अपसला एथिकल समीक्षा बोर्ड (DNR। 2013/387) द्वारा प्रदान की गई थी।

मानव तालु Tonsils से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) के 1. अलगाव

चेतावनी: रक्त, ऊतकों या शरीर के तरल पदार्थ की तरह मानव उत्पत्ति के सभी बेपर्दा सामग्री संभावित संक्रमित सामग्री के रूप में माना जाना चाहिए। इसलिए, मानव ऊतकों से निपटने के लिए सिफारिश की जैव सुरक्षा प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए।

नोट: संक्रमण से बचने के लिए, सभी समाधान और सेल संस्कृति उपकरण बाँझ होना चाहिए। सभी buffers और समाधान पूर्व ठंडा और बर्फ पर रखा जाना चाहिए। Tonsil ऊतकों और अलग कक्षों रखा है और बर्फ पर नियंत्रित किया जाना चाहिए।

  1. तोंसिल्लेक्टोमी या tonsillotomy (चित्रा 2) के दौर से गुजर रोगियों से ताजा टॉन्सिल प्राप्त करते हैं। ऊतक clum डुबकी5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10 मिमी glutamine, 0.05 मिलीग्राम / जेंटामाइसिन और 1% एंटीबायोटिक antimycotic मिश्रण मिलीलीटर (पेनिसिलिन के साथ पूरक ठंडा बाँझ हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ भरा एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पी एस, स्ट्रेप्टोमाइसिन और Amphotericin बी)।
  2. बर्फ पर हर समय जलमग्न गलतुंडिका ऊतकों के नमूनों के साथ ट्यूबों रखें। जितनी जल्दी हो सके टॉन्सिल संसाधित करने का प्रयास है, और कोई बाद में शल्य हटाने के बाद 3 घंटा से अधिक है।
  3. बर्फ पर एक 60 मिमी प्लास्टिक सेल कल्चर प्लेट पर tonsil रखें और HBSS के साथ सिक्त ऊतक रहते हैं। Tonsil सतह से एक साफ संदंश के साथ दिखाई रक्त के थक्के, वसायुक्त और संयोजी ऊतक निकालें।
  4. 5 मिलीलीटर HBSS युक्त एक नया 60 मिमी सेल कल्चर प्लेट का प्रयोग करें। कैंची और / या एक छुरी का एक बाँझ जोड़ी का उपयोग 3-10 मिमी टुकड़ों में tonsil ऊतक पेड़ों का झुरमुट कट।
  5. HBSS के 10 मिलीग्राम से युक्त एक नया 60 मिमी सेल संस्कृति की थाली तैयार है और HBSS समाधान में एक 100 माइक्रोन के प्लास्टिक सेल झरनी जगह है।
  6. Diss स्थानांतरणएक बाँझ संदंश के साथ सेल झरनी में ected गलतुंडिका टुकड़े। एक प्लास्टिक सिरिंज के सवार अंत का उपयोग करना, सुचारू रूप से सेल झरनी के माध्यम से ऊतक टुकड़े निचोड़। गलतुंडिका टुकड़े पूरी तरह से HBSS में डूब रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  7. ऊतक अवशेषों के साथ सेल झरनी त्यागें और एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 60 मिमी सेल संस्कृति की थाली से उत्पन्न सेल निलंबन हस्तांतरण। कदम 1.8 और 1.9 के साथ आगे बढ़ने जबकि बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें।
  8. बड़ा टॉन्सिल के मामले में, आकार में बड़ा से 2 सेमी (चित्रा 2), झरनी में जाल के clogging से बचने के लिए दो सेल झरनी में tonsil टुकड़े निचोड़।
  9. सेल निलंबन के 35 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करते हैं।
    नोट: इस चरण में यह cryopreservation (धारा 2 देखें) के लिए सेल निलंबन तैयार करने के लिए संभव है।
  10. एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में Ficoll के रूप में इस तरह के घनत्व ढाल समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे सेल सस्पेंस उपरिशायीआयन घनत्व ढाल समाधान के शीर्ष पर (कदम 1.9)। सेल निलंबन और घनत्व ढाल समाधान के मिश्रण से बचें।
    नोट: घनत्व ढाल समाधान आरटी के लिए गरम हो गया है।
  11. आरटी पर 20 मिनट के लिए 700 XG पर एक स्विंग बाहर रोटर में सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। ढाल को बाधित कर सकते तेजी से ब्रेक लगाना के रूप में सेंट्रीफ्यूज पर ब्रेक समारोह को सक्रिय नहीं है। इसके अलावा, सेंट्रीफ्यूज पर उपलब्ध सबसे कम त्वरण समारोह का उपयोग करें।
    नोट: इस centrifugation कदम के बाद, ट्यूब के नीचे तलछट के रूप में एक इंटरफेस में शराबी सफेद परत, और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी), fibroblasts और सेल मलबे के रूप में बहुराष्ट्रीय कंपनियों का पालन।
  12. ध्यान से एक 10 मिलीलीटर pipet का उपयोग करके बहुराष्ट्रीय कंपनियों परत लीजिए। एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन रखें।
  13. सेल निलंबन के लिए ठंडा पीबीएस के 25 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्विंग बाहर रोटर में 5 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब स्पिन।
  14. एक 25 मिलीलीटर pipet का उपयोग तैरनेवाला निकालेंऔर सेल गोली धोने कदम दो बार दोहराएँ। अंत में पीबीएस के 15 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
    नोट: अंतिम धोने कदम के बाद, यह सेल निलंबन (खंड 2 देखें) cryopreserve के लिए संभव है।
  15. Hemocytometer सेल गिनती के चेंबर में सेल निलंबन के 10 μl लागू करें और एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल संख्या गिनती। कोशिकाओं की उचित मात्रा में बांटना (जैसे, 2-3 10 x 7) बाद में चुंबकीय मनका अलग होने के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में। 3.2 कदम तक बर्फ पर इस विभाज्य रखें।

गलसुआ सम्बन्धी प्रकोष्ठों के 2. Cryopreservation

  1. ठंड मध्यम (90% FBS और 10% DMSO) तैयार है और बर्फ पर रहते हैं। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंड मीडिया रखने के लिए।
  2. एक hemocytometer सेल गिनती चैम्बर (कदम 1.15) का उपयोग कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित है। वांछित जमे हुए सेल घनत्व के अनुसार ठंड माध्यम के लिए आवश्यक राशि की गणना (जैसे, 10 7 सेलठंड माध्यम की / एमएल)।
  3. 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला छानना और (2.1 कदम से) बहुत ठंडा ठंड माध्यम में सेल गोली resuspend।
  4. तरल नाइट्रोजन में लंबी अवधि के भंडारण के लिए डिज़ाइन किया गया बाँझ शीशियों में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर aliquots बांटना। एक isopropanol के चैम्बर में शीशियों रुक और -80 डिग्री सीओ / एन पर उन्हें दुकान। लंबी अवधि के संरक्षण के लिए भंडारण टैंक या एक -140 डिग्री सेल्सियस सेल फ्रीजर से युक्त तरल नाइट्रोजन में शीशियों हस्तांतरण।
  5. जमे हुए कोशिकाओं के साथ शीशियों पिघलना करने के लिए, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उन्हें तेजी से गर्म है। Thawed तुरंत जब, (पूरक आहार के साथ 1.1 कदम) पूर्व गर्म HBSS के 10 मिलीलीटर में सेल निलंबन फैलाने एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में। (1.1 कदम, पूरक आहार के साथ), 5 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब स्पिन HBSS हटाने और HBSS में वांछित सेल घनत्व में सेल गोली resuspend।
    नोट: बहुराष्ट्रीय कंपनियों वायुसेना की व्यवहार्यताआतंकवाद विगलन मृत कोशिकाओं की उपस्थिति शुद्ध बी और टी लिम्फोसाइटों के अंतिम उपज कम हो जाएगा, के बाद से महत्व का है।
    नोट: सेल अलगाव क्षमता को कम करेगा सेल व्यवहार्यता कम से कम 80% तो हमारे अनुभव के अनुसार।

गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों से टी लिम्फोसाइट जनसंख्या 3. सकारात्मक चयन

नोट 1: इस प्रोटोकॉल CD3 एंटीबॉडी करने के लिए मिलकर चुंबकीय मोतियों का उपयोग गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों से मानव CD3 + टी लिम्फोसाइटों के सकारात्मक चयन पर आधारित है। यह ताजा (खंड 1) या फ्रोजन (धारा 2) बहुराष्ट्रीय कंपनियों से इस खंड शुरू करने के लिए संभव है।

नोट 2: 3 10 x 7 बहुराष्ट्रीय कंपनियों के साथ शुरू करो। जुदाई स्तंभों रोकना कर सकते हैं और इस अलगाव क्षमता कम हो जाएगा, के बाद से इस सेल नंबर से अधिक नहीं है। अधिक कोशिकाओं नियंत्रित किया जाएगा, तो बड़ा कॉलम का प्रयोग करें। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की मात्रा प्रयोगात्मक कोशिकाओं हमें की संख्या के लिए अनुकूलित किया गया हैहमारे प्रयोगात्मक सेटअप में एड।

  1. जुदाई बफर [पीबीएस (पीएच 7.2), 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 2 मिमी EDTA] तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से जुदाई बफर फ़िल्टर।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर बहुराष्ट्रीय कंपनियों के निलंबन (कदम 1.14) स्पिन। ठंडा जुदाई बफर के 240 μl में जिसके परिणामस्वरूप सेल गोली (10 7 कोशिकाओं प्रति 80 μl) Resuspend। एक बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण।
  3. सेल के समाधान के लिए CD3 चुंबकीय एंटीबॉडी के 20 μl जोड़ें। निलंबन में कोशिकाओं को रखने के लिए निरंतर सौम्य मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ट्यूबों सेते हैं।
  4. कोशिकाओं को धोने के लिए 5 मिलीलीटर ठंडा जुदाई बफर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन के सभी स्थानांतरण।
  5. एक स्विंग बाहर रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  6. इस बीच चुंबकीय विभाजक और स्तंभ की स्थापना की। खड़ा करने के लिए चुंबकीय विभाजक देते हैं और separ में स्तंभ जगहअभिनेता। ठंडा जुदाई बफर के 500 μl लगाने से स्तंभ धो लें। के माध्यम से प्रवाह त्यागें।
  7. स्तंभ के नीचे एक नया 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब रखें। बर्फ पर संग्रह ट्यूब रखें।
  8. Pipet से सतह पर तैरनेवाला (3.5 चरण) त्यागें और धीरे 500 μl जुदाई बफर में सेल गोली resuspend। पूर्व धोया स्तंभ के शीर्ष पर सेल निलंबन लागू करें और इसके माध्यम से चलाते हैं।
    नोट: सेल झुरमुटों स्तंभ रोकना है और इस तरह प्रवाह दर को कम कर सकते हैं। इस समस्या को रोकने के लिए, स्तंभ के शीर्ष पर एक 40 माइक्रोन के प्लास्टिक सेल झरनी जगह है। इस जाल के माध्यम से कोशिकाओं पासिंग अत्यधिक इस विधि की दक्षता में सुधार होगा।
  9. जुदाई बफर के 1.5 मिलीलीटर (10 7 कोशिकाओं के लिए 500 μl) के साथ स्तंभ 4 बार धोएं। अगले धोने कदम लागू करने से पहले (कोई तरल स्तंभ में मनाया जाना चाहिए) खाली हो स्तंभ जलाशय के लिए प्रतीक्षा करें।
    नोट: बी लिम्फोसाइट अंश के रूप में माना जाता CD3 लेबल हटाया कोशिकाओं को प्राप्त, वे कर रहे हैंसंग्रह ट्यूब में eluted।
  10. एक नया 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में विभाजक और जगह से स्तंभ निकालें। पिपेट स्तंभ पर जुदाई बफर के 2 मिलीलीटर। टी लिम्फोसाइट अंश के रूप में माना जाता है, जो सकारात्मक चयनित टी lymphocytes, elute स्तंभ के साथ आपूर्ति सवार का उपयोग करना।
  11. शुद्ध कोशिकाओं (कदम 1.15) यदि आवश्यक हो तो की संख्या निर्धारित है। सेल निलंबन अब बहाव के प्रयोगों के लिए तैयार हैं।

पृथक 4. फ्लो विश्लेषण गलसुआ सम्बन्धी बी और टी lymphocytes

चेतावनी: paraformaldehyde समाधान अड़चन और संदिग्ध कैसरजन है। उपयुक्त सुरक्षात्मक कपड़े, दस्ताने, और आंख / चेहरे की सुरक्षा पहनें।

1 नोट: इस प्रोटोकॉल (FACS) के विश्लेषण प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा पृथक बी और टी कोशिकाओं की प्रत्यक्ष धुंधला के लिए विधि का वर्णन है। इस कदम का मुख्य उद्देश्य आबादी वायुसेना पृथक सेल की शुद्धता का आकलन करने के लिए हैआतंकवाद CD3 चुंबकीय एंटीबॉडी जुदाई। इस उद्देश्य से स्थापित बी और टी सेल मार्कर के लिए, fluorophore संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी CD20 FITC और CD2 एपीसी, इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के शामिल किए जाने के अत्यधिक CD2 और CD20 एंटीबॉडी (कदम 4.8 देखें) के बंधन गैर विशिष्ट "पृष्ठभूमि" भेद करने के लिए सिफारिश की है।

2 नोट: यह धुंधला के समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 1% paraformaldehyde में अंधेरे में (पीएफए) समाधान शुद्ध सेल अंशों रखना संभव है (उदाहरण के लिए, अगले दिन।)। धुंधला और FACS विश्लेषण के बीच एक समय अंतराल है, तो भी एक ही प्रक्रिया लागू है। दोनों ही मामलों में कोशिकाओं PBSA धुंधला हो जाना या FACS विश्लेषण करने से पहले बफर (पीबीएस 0.2% BSA युक्त) के साथ ठीक से धोया जाना चाहिए कि याद रखें।

  1. कदम 3.10 से कदम 3.9 और टी लिम्फोसाइट अंश से, बी लिम्फोसाइट अंश (पहले स्तंभ के लिए आवेदन करने के लिए) कदम 1.15 से बहुराष्ट्रीय कंपनियों के 6 x 10 6 कोशिकाओं बाहर ले जाओ।
  2. सेल स्पिनएक स्विंग बाहर रोटर का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर निलंबन।
  3. Pipet के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंडा PBSA के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार सेल गोली धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन स्पिन। Pipet के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और resuspend ठंडा PBSA बफर के 600 μl में कोशिकाओं।
  4. एक FACS ट्यूब के नीचे करने के लिए सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें।
  5. पीबीएस प्रत्येक ट्यूब 10% गर्मी निष्क्रिय मानव सीरम युक्त के 100 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और ~ आरटी पर 1 मिनट या बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: बी लिम्फोसाइट्स एफसी रिसेप्टर्स ले। एफसी ब्लॉक करने के क्रम में शुद्ध सेल अंशों 10% गर्मी निष्क्रिय मानव सीरम के साथ incubated हैं रिसेप्टर्स। मानव सीरम 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा निष्क्रिय गर्मी है। -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए छोटे aliquots और दुकान में गर्मी निष्क्रिय सीरम फूट डालो।
  6. एक दप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्रआईएनजी-बाहर रोटर।
  7. Pipet के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर PBSA के साथ सेल गोली धो लें। Centrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG) दोहराएँ।
  8. बर्फ पर प्रत्येक ट्यूब में 100 μl PBSA जोड़ें। निर्माता की सिफारिश के अनुसार, fluorophore संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की उचित मात्रा में जोड़ें (जैसे, विरोधी CD20 के 20 μl और / या PBSA के 100 μl में विरोधी CD2 एंटीबॉडी के 5 μl)। नोट: FACS विश्लेषण के लिए पर्याप्त नियंत्रण ट्यूबों आवंटित करने के लिए मत भूलना। इस प्रोटोकॉल में निम्न नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए: व्यक्तिगत रूप से विरोधी CD2 और विरोधी CD20 एंटीबॉडी के साथ दाग 1) कोशिकाओं, इसके बिना व्यक्तिगत रूप से विरोधी CD2 और विरोधी CD20 निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी और, 3) कोशिकाओं के साथ दाग 2) कोशिकाओं एंटीबॉडी की।
  9. संक्षेप में ट्यूब भंवर और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. PBSA के साथ 2 बार धोएं। नमूने के लिए 1% पीएफए ​​समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 4 कोशिकाओं पर पीएफए ​​समाधान में रहते हैं76; FACS विश्लेषण के समय तक अंधेरे में सी।
  11. इसके तत्काल बाद FACS मशीन में नमूने को चलाने से पहले, (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG) PBSA के साथ कोशिकाओं को 2 बार धो लें। पीबीएस के 1 मिलीलीटर और में Resuspend नमूने से पहले प्रवाह पर अलग करने के लिए, प्रकाश से सुरक्षित, 4 डिग्री सेल्सियस (या बर्फ पर) में रहते हैं।
  12. निर्माता प्रवाह से प्रोटोकॉल के बाद FACS छँटाई करो।

पृथक गलसुआ सम्बन्धी बी और टी lymphocytes में Adenovirus डीएनए के 5. पीसीआर जांच

नोट 1: एडीनोवायरस hexon जीन प्राइमरों AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA -3 ') कर रहे हैं और AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11। इन प्राइमरों 139 बीपी के एक amplicon उत्पन्न करते हैं। मेजबान 18S rRNA जीन प्राइमरों tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG -3 ') और tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3') के साथ पाया जा सकता है। उम्मीद amplicon आकार 300 बीपी है।

नोट 2: हर पीसीआरचलाने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (आसुत एच 2 ओ) और मानव एडीनोवायरस प्रकार 5 से 12 से संक्रमित मानव बी सेल लाइन (BJAB) से प्राप्त एक सकारात्मक डीएनए नियंत्रण भी शामिल है।

  1. सिलिका झिल्ली आधारित स्तंभ शुद्धि विधि का उपयोग (कम से कम 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं, 3.11 कदम से) डीएनए निकालें। फिनोल और guanidine आइसोथियोसाइनेट समाधान 13 का उपयोग करते हुए शाही सेना निकालें।
  2. 1x एचएफ बफर, deoxynucleotide ट्रायफ़ोस्फेट मिश्रण 0.2 मिमी (dNTP), 0.25 प्रत्येक प्राइमर के माइक्रोन और 20 μl की कुल मात्रा में उच्च फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ 1 यू युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए बी और टी लिम्फोसाइट्स से 100 एनजी डीएनए जोड़ें।
  3. निम्नलिखित साइक्लिंग की शर्तों के तहत पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करना: 10 सेकंड, 67 डिग्री सेल्सियस (hexon) या 58 डिग्री सेल्सियस (18S rRNA) 30 सेकंड के लिए और 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्रों के बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के विकृतीकरण, 30 सेकंड के लिए। पीसीआर प्रतिक्रिया 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट की एक अंतिम विस्तार कदम के साथ समाप्त हो गया था।
  4. जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर amplif अलग करें1x TBE में 1.5% agarose जेल पर ication उत्पादों बफर और न्यूक्लिक एसिड दाग साथ धुंधला द्वारा की उम्मीद बैंड कल्पना।

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Representative Results

बी और टी लिम्फोसाइटों के उच्च शुद्ध उप-जनसंख्या में गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों के परिणामों के एक कुशल जुदाई। यह बी और टी लिम्फोसाइट आबादी, क्रमशः (चित्रा 3) का पता लगाने के विरोधी CD20 और विरोधी CD2 एंटीबॉडी का उपयोग FACS विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई। इसके विपरीत, बी और टी लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या (चित्रा 3 बी) दोनों से कोशिकाओं का मिश्रण हैं कि सेल भागों में बहुराष्ट्रीय कंपनियों के परिणामों के एक अक्षम जुदाई।

पृथक गलसुआ सम्बन्धी बी और टी लिम्फोसाइटों (चित्रा 3) न्यूक्लिक एसिड अलगाव की तरह नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, डीएनए और आरएनए बी से निकाले और टी lymphocytes एडीनोवायरस डीएनए और सेलुलर आरएनए का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। परिणाम गलसुआ सम्बन्धी टी lymphocytes में एडीनोवायरस डीएनए की विशिष्ट पहचान (चित्रा 4) दिखा। गलसुआ सम्बन्धी बी और टी लिम्फोसाइट्स से भी पृथक शाही सेना downstrea के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा की है मीटर अनुप्रयोगों (चित्रा 5)।

चित्र 1
चित्रा गलसुआ सम्बन्धी लिम्फोसाइट अलगाव की प्रक्रिया की 1. अवलोकन। तालु गलतुंडिका नमूने कार्रवाई कर रहे हैं और गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों घनत्व ढाल centrifugation द्वारा सेल निलंबन से अलग कर रहे हैं। बी और टी लिम्फोसाइट्स मानव CD3 चुंबकीय एंटीबॉडी के साथ टी लिम्फोसाइट अंश का एक सकारात्मक सेलेक्शन उप-जनसंख्या में शुद्ध कर रहे हैं। इस शुद्धि कदम आगे पृथक सेल अंशों का आकलन करने के लिए यह संभव बनाता है; कुछ वायरल प्रजातियों उप-जनसंख्या में से किसी में समृद्ध कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, निर्धारित करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. शल्य चिकित्सा तालु टॉन्सिल हटा दिया। तोंसिल्लेक्टोमी (बाएं) और tonsillotomy (दाएं) द्वारा हटाया Tonsils। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
समृद्ध सेल अंशों की चित्रा 3. प्रतिनिधि FACS का परिणाम है। (ए) आगे गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों, टी लिम्फोसाइट और प्रवाह भागों में पक्ष तितर बितर साजिश दिखा बी (CD20) और टी (CD2) लिम्फोसाइट आबादी बनाम। समृद्ध सेल भागों में टी और बी लिम्फोसाइटों की शुद्धता 90% से अधिक है। बी कोशिकाओं की कुल प्रवाह कोशिकाओं के 92% शामिल है, के बाद से इस अंश बी लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या के रूप में नामित किया गया है। (बी) FACS भूखंडों बी और टी सेल subp का अकुशल जुदाई दिखाकारण स्तंभ और अपर्याप्त कदम धोने के लिए आवेदन किया बहुराष्ट्रीय कंपनियों की गैर अनुकूलित संख्या के opulations। / CD20 - - एक तरफ चुंबकीय सक्रिय सेल अनुकूलन छंटाई के लिए जरूरत से, CD2 के एक उच्च पृष्ठभूमि है। कोशिकाओं, FACS धुंधला अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है जो दिखाता है कि यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
गलसुआ सम्बन्धी लिम्फोसाइट भागों में एडीनोवायरस डीएनए के चित्रा 4. पीसीआर का पता लगाने। कुल डीएनए बी से निकाला जाता है और टी lymphocytes एक मरीज ​​के दौर से गुजर तोंसिल्लेक्टोमी से छोड़ दिया और सही टॉन्सिल से अलग किया। अंत बिंदु पीसीआर शुद्ध डीएनए के 100 एनजी के साथ किया जाता है। लेन 1: वाम गलतुंडिका के बी लिम्फोसाइट अंश (बी); 2 लेन: LEF की टी लिम्फोसाइट अंश (टी)टी गलतुंडिका; लेन 3: सही गलतुंडिका के बी लिम्फोसाइट अंश (बी); लेन 4: सही गलतुंडिका की टी लिम्फोसाइट अंश (टी)। Adenovirus (विज्ञापन) डीएनए पृथक टी लिम्फोसाइट अंश में ही पता लगता है। एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेलुलर 18S rRNA जीन कृत्यों डीएनए की है कि एक ही राशि के सभी नमूनों में पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है दिखाने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
पृथक बी और टी सेल उप-जनसंख्या से निकाले चित्रा 5. उच्च गुणवत्ता आरएनए। पृथक बी और टी लिम्फोसाइट्स से निकाले कुल साइटोप्लास्मिक आरएनए एक 1% agarose जेल पर अलग हो गया था। लेन 1: वाम गलतुंडिका के बी लिम्फोसाइट अंश (बी); 2 लेन: वाम गलतुंडिका की टी लिम्फोसाइट अंश (टी); लेन 3: सही गलतुंडिका के बी लिम्फोसाइट अंश (बी); 4 लेन:सही गलतुंडिका की टी लिम्फोसाइट अंश (टी)। 28S rRNA के प्रवास पैटर्न, 18S rRNA और छोटे आरएनए संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में ताजा गलसुआ सम्बन्धी सामग्री का इस्तेमाल होता है। इसलिए, tonsil नमूने सर्जरी के बाद 3 घंटा के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए। टॉन्सिल दोनों वयस्क और बच्चों से प्राप्त किया जा सकता है। बच्चों से गलसुआ सम्बन्धी सामग्री की वजह टॉन्सिल (tonsillotomy) के आंशिक शल्य हटाने के लिए आम तौर पर छोटा होता है। इसलिए, बहुराष्ट्रीय कंपनियों की संख्या कम तोंसिल्लेक्टोमी नमूने (1 एक्स 10 8 -2 एक्स 10 9) की तुलना में है tonsillotomy नमूने (1 10 x 7 -1 एक्स 10 8) से प्राप्त की। हालांकि, सेल अलगाव की प्रक्रिया की परवाह किए बिना सर्जरी के प्रकार का एक ही होगा।

विधि छँटाई चुंबकीय सक्रिय सेल से प्राप्त सेल उप-जनसंख्या की पवित्रता को अधिकतम कुछ अनुकूलन की आवश्यकता है। CD3 चुंबकीय एंटीबॉडी के साथ राशि और ऊष्मायन समय और स्तंभ के लिए लागू बहुराष्ट्रीय कंपनियों की संख्या चुनते किया जाना चाहिए कि मुख्य कारक हैंimized। भी कई कोशिकाओं को लागू करने स्तंभ और सेल उप-जनसंख्या का अकुशल संवर्धन के clogging में परिणाम होगा। इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, हम जुदाई स्तंभ पर अधिक से अधिक 3 10 x 7 बहुराष्ट्रीय कंपनियों को लागू करने के स्तंभ और बाद में अशुद्ध सेल भिन्न (चित्रा 3 बी) के एक clogging के कारण होगा कि पाया। इस प्रकार, 3 एक्स 10 7 बहुराष्ट्रीय कंपनियों के साथ शुरू डीएनए और आरएनए निकासी के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा के साथ अच्छी तरह से समृद्ध लिम्फोसाइट अंशों देता है (आंकड़े 4 और 5)। पृथक बी और टी lymphocytes की अंतिम संख्या क्रमश: 1-2 10 x 7 और 5-7 एक्स 10 6 होने की उम्मीद है। इस प्रकार, 3 एक्स 10 7 बहुराष्ट्रीय कंपनियों के प्रति CD3 चुंबकीय एंटीबॉडी के 20 μl के उपयोग के सफल बी और टी लिम्फोसाइट जुदाई (चित्रा 3) के लिए इष्टतम प्रतीत होता है।

पिछले एक रिपोर्ट बी और टी लिम्फोसाइट्स जबकि अन्य में क्रमश: 60-70% और गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों की 30-40% शामिल है कि स्थापित किया हैमैक्रोफेज की तरह सेल प्रकार, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं गलसुआ सम्बन्धी बहुराष्ट्रीय कंपनियों के 14 में से 1-8% तक है। FACS तकनीक (चित्रा 3) के साथ बी और टी lymphocytes के immunostaining के रूप में दिखाया इसी सेल अनुपात हमारे अलगाव प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया गया।

वाशिंग चरणों की संख्या और वाशिंग बफर मात्रा एक अच्छा परिणाम के लिए महत्वपूर्ण मानकों हैं। तदनुसार, अत्यधिक धोने अपर्याप्त धोने टी सेल अंश की शुद्धता कम हो जाएगा, जबकि CD3 चुंबकीय एंटीबॉडी जुड़े टी कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह में खत्म करने के लिए प्रेरित करेगा।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम ऊतक प्रकार है और उम्मीद बहाव के विश्लेषण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, इस विधि सरल, कुशल, ईमानदार और समय की बचत है। हालांकि इस विधि से एक सीमा tonsilla की बड़े पैमाने पर शुद्धि की सीमा हो सकती है, जो वाणिज्यिक चुंबकीय जुड़े सेल छँटाई अभिकर्मकों की एक अपेक्षाकृत उच्च लागत है,आर बी और टी लिम्फोसाइट्स।

सारांश में इस प्रोटोकॉल तालु टॉन्सिल से बी और टी उप-जनसंख्या प्राप्त करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है और तिल्ली, थाइमस, लिम्फ नोड्स और खून की तरह अन्य ऊतकों से सेल अंशों को अलग-थलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हम आगे हम गलसुआ सम्बन्धी टी सेल अंश में विशेष रूप से (चित्रा 4) एक adenovirus संक्रमण का पता लगाने दिखाने के लिए कि इस पद्धति लागू होते हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, टी सेल cytotoxicity, टी सेल सक्रियण, सेल संकेतन और बी और टी कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति पर अध्ययन सहित आवेदन की एक व्यापक क्षेत्र है, के लिए उपयोगी होना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

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References

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