Effektiv Isolasjon Protokoll for B og T-lymfocytter fra Menneskerettighets Palatine Mandlene

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Protokollen beskriver isolering av lymfoide celler fra human pasient materiale og krever derfor en etisk godkjenning. Arbeidet gjøres i denne studien ble gitt av Uppsala Ethical Review Board (Dnr. 2013/387).

1. Isolering av mononukleære celler (MNCs) fra Menneskerettighets Palatine Mandlene

FORSIKTIG: All uskjermet materiale av human opprinnelse som blod, vev eller kroppsvæsker bør anses som potensielt infisert materiale. Derfor bør anbefales for biologisk praksis for håndtering av humane vev følges.

Merk: For å unngå forurensning, må alle løsninger og cellekultur utstyr være steril. Alle buffere og løsninger bør være pre-avkjølt og holdt på is. Mandel vev og isolerte celler bør holdes og behandles på is.

  1. Skaff ferske mandlene fra pasienter som gjennomgår tonsillektomi eller tonsillotomy (figur 2). Stup vevet Clumps i et 50 ml sentrifugerør fylt med iskald steril Hanks balanserte saltløsning (HBSS) supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM glutamin, 0,05 mg / ml gentamicin og 1% Antibiotikum-fungal blanding (Penicillin, streptomycin og amfotericin B).
  2. Hold rørene med nedsenkede mandel vevsprøver til alle tider på is. Prøv å behandle mandlene så snart som mulig, og senest innen tre timer etter kirurgisk fjerning.
  3. Plasser mandel på en 60 mm plastcellekulturplate på is og holde vevet fuktet med HBSS. Fjerne synlige blodpropper, fet og bindevev med en ren pinsett fra mandel overflaten.
  4. Bruk en ny 60 mm cellekultur plate som inneholder 5 ml HBSS. Kutt mandel vevet klump i 3-10 mm fragmenter ved hjelp av en steril saks og / eller en skalpell.
  5. Forberede en ny 60 mm cellekultur plate som inneholder 10 ml HBSS og legg en 100 mikrometer plast celle sil i HBSS løsning.
  6. Overfør dissected mandel-fragmenter inn i cellefilter med en steril pinsett. Ved hjelp av stempelet ende av en plastsprøyte, jevnt presse vevfragmenter gjennom cellen sil. Pass på at mandel fragmenter totalt oppslukt i HBSS.
  7. Kast cellefilter med vevet restene og overføre den resulterende cellesuspensjonen fra 60 mm cellekulturplate i et 50 ml sentrifugerør av plast. La røret på is mens du fortsetter med trinn 1.8 og 1.9.
  8. I tilfelle av store mandlene, som er større enn 2 cm i størrelse (figur 2), presse mandel-fragmentene i to celle siler for å unngå tilstopping av maske i silen.
  9. Oppnå sluttvolum på 35 ml av cellesuspensjonen.
    Bemerk: Ved dette trinnet er det mulig å fremstille cellesuspensjonen for nedfrysing (se kapittel 2).
  10. Tilsett 10 ml densitetsgradient løsning slik som Ficoll inn i en ny 50 ml sentrifugerør. Forsiktig overlappe celle suspension (trinn 1.9) på toppen av densitetsgradienten løsningen. Unngå blanding av cellesuspensjonen og den densitetsgradient løsningen.
    Merk: densitetsgradient Løsningen må bli varmet opp til RT.
  11. Sentrifuger cellesuspensjonen i en swing-out rotor ved 700 xg i 20 min ved RT. Aktiver ikke bremsefunksjon på sentrifugen så fort bremsing kan forstyrre gradient. Også bruke den laveste akselerasjonsfunksjonen tilgjengelig på sentrifugen.
    Merk: Etter dette sentrifugeringstrinnet, observere MNCer som et luftig hvitt lag ved grenseflaten, og røde blodceller (RBC), fibroblaster og celleavfall som sedimentet i bunnen av røret.
  12. Samle MNCer lag forsiktig ved anvendelse av en 10 ml pipette. Plasser cellesuspensjonen inn i en ny 50 ml sentrifugerør.
  13. Legg 25 ml iskald PBS til cellesuspensjonen og spinne rør ved 300 xg i 5 minutter i en swing-out rotor ved 4 ° C.
  14. Fjern supernatanten ved bruk av en 25 ml pipetteog gjenta cellepelleten vasketrinn to ganger til. Endelig cellepelleten suspenderes i 15 ml PBS.
    Merk: Når det siste vasketrinn, er det mulig å cryopreservere cellesuspensjonen (se kapittel 2).
  15. Anvende 10 ul av cellesuspensjonen i hemocytometer celletellekammer, og telle antallet celler under et mikroskop. Tilsett passende mengde celler (f.eks, 2-3 x 10 7) i et 15 ml sentrifugerør for etterfølgende separasjon på magnetiske kuler. Hold denne delmengde på is inntil trinn 3.2.

2. kryokonservering Tonsillar Cells

  1. Forberede frysing medium (90% FBS og 10% DMSO) og holde den på is. For langtidslagring holde frysing media ved -20 ° C.
  2. Bestemme det totale antall celler ved hjelp av et hemocytometer celletellekammer (trinn 1.15). Beregne den nødvendige mengde av frysemedium i henhold til den ønskede frosne celletetthet (f.eks 10 7 celles / ml frysemedium).
  3. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 minutter. Dekanter supernatanten uten å forstyrre cellepellet og cellepelleten suspenderes i iskald frysemedium (fra trinn 2.1).
  4. Dispensere 1 ml alikvoter av cellesuspensjonen i sterile ampuller utformet for langtidslagring i flytende nitrogen. Fryse hetteglass i en isopropanol kammer og lagre dem ved -80 ° CO / N. For langsiktig bevaring overføre hetteglassene inn i en flytende nitrogen som inneholder lagringstank eller en -140 ° C celle fryser.
  5. For å tine ampuller med frosne celler, varme dem hurtig i et 37 ° C vannbad. Umiddelbart etter tining, dispergere cellesuspensjon i 10 ml av forvarmet HBSS (med kosttilskudd, trinn 1.1) i et 15 ml sentrifugerør. Spinne rør ved 300 xg i 5 minutter, fjern HBSS og cellepelleten suspenderes ved den ønskede celletetthet i HBSS (med kosttilskudd, trinn 1.1).
    Merk: levedyktighet av MNCs after tining er av betydning, ettersom nærværet av døde celler vil redusere den endelige utbyttet av renset B og T-lymfocytter.
    Merk: Ifølge vår erfaring cellen levedyktighet mindre enn 80% vil redusere celleisolasjon effektivitet.

3. Positive Valg av T lymfocyttpopulasjon fra Tonsillar MNCs

Note 1: Denne protokollen er basert på positiv seleksjon av humane CD3 + T-lymfocytter fra tonsillare MNCer ved hjelp av magnetiske kuler som er koplet til CD3-antistoff. Det er mulig å starte denne delen av ferske (§ 1) eller frosne (§ 2) MNCs.

Note 2: Start med 3 x 10 7 MNCs. Ikke overskrid denne celle nummer, ettersom separasjonskolonner kan tette og dette vil redusere isolasjon effektivitet. Bruk større kolonner hvis flere celler vil bli håndtert. Volumene anvendt i denne protokollen er blitt eksperimentelt optimalisert for antall celler ossed i vår eksperimentelle oppsett.

  1. Klargjør separasjonsbuffer [PBS (pH 7,2), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA]. Filtrer separasjons bufferen gjennom et 0,45 um filter og oppbevares ved 4 ° C.
  2. Snurr MNCs suspensjon (trinn 1.14) ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. Resuspender den resulterende cellepelleten i 240 ul (80 ul pr 10 7 celler) iskald buffer separasjon. Overfør cellesuspensjonen til en steril 2 ml rør.
  3. Tilsett 20 ul magnetisk CD3 antistoff til celleløsning. Inkuber rørene i 1 time ved 4 ° C under kontinuerlig forsiktig omrøring for å holde cellene i suspensjon.
  4. Overføre alle cellesuspensjonen i et 15 ml rør inneholdende 5 ml iskald buffer separasjon for å vaske cellene.
  5. Sentrifuger røret ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C i en swing-out rotor.
  6. Samtidig setter opp den magnetiske separator og kolonne. Fest magnetisk separator til stativet og plasser kolonne i separator. Vask kolonnen ved å anvende 500 mL iskald buffer separasjon. Kast strømningen gjennom.
  7. Plasser en ny 15 ml oppsamlingsrøret nedenfor kolonnen. Hold samlingen tube på is.
  8. Kast supernatanten (trinn 3.5) med en pipette og forsiktig cellepelleten suspenderes i 500 mL separasjon buffer. Påfør cellesuspensjonen på toppen av forvasket kolonne og la den gå gjennom.
    Merk: Celle klumper kan tette til kolonnen og derved redusere strømningshastigheten. For å unngå dette problemet, plasserer en 40 mikrometer plast celle sil på toppen av kolonnen. Passerer cellene gjennom denne mesh vil sterkt forbedre effektiviteten av denne metoden.
  9. Vask kolonnen 4 ganger med 1,5 ml buffer (500 atskillelse ul i 10 7 celler). Vent reservoar kolonnen for å være tom (ingen væske bør observeres i kolonnen) før påføring av det neste vasketrinn.
    Merk: Skaff CD3 umerkede celler, ansett som B lymfocyttfraksjonen, som de ereluert inn i oppsamlingsrøret.
  10. Fjerne kolonnen fra separatoren og inn i stedet en ny 15 ml oppsamlingsrør. Pipetter 2 ml buffer separasjon på kolonnen. Ved hjelp av stempelet som følger med kolonnen eluere positivt selekterte T-lymfocytter, som regnes som den T-lymfocytt-fraksjonen.
  11. Bestem antall rensede celler (trinn 1.15) om nødvendig. Cellesuspensjoner er nå klar for nedstrøms eksperimenter.

4. flowcytometrisystemer Analyse av Isolert Tonsillar B og T-lymfocytter

FORSIKTIG: Paraformaldehyde Løsningen er irriterende og mistenkt kreftfremkallende. Bruk egnede verneklær, hansker og vernebriller / ansiktsskjerm.

Note 1: Denne protokollen beskriver metoden for direkte farging av det isolerte B og T-celler ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) analyse. Hovedformålet med dette trinnet er å bedømme renheten av det isolerte cellepopulasjoner after CD3 magnetisk antistoff separasjon. For dette formål etableres B- og T-cellemarkører, fluoroforen-konjugerte monoklonale antistoffer CD20-FITC og CD2-APC, blir brukt. Også inkludering av isotypekontrollantistoffer er sterkt anbefalt å skille uspesifikke "bakgrunn" binding av CD2 og CD20 antistoffer (se trinn 4.8).

Note 2: Det er mulig å holde de rensede cellefraksjoner i en 1% paraformaldehyd (PFA) oppløsningen i mørke ved 4 ° C inntil tiden for farging (f.eks neste dag.). Også den samme fremgangsmåte kan anvendes hvis det er et gap mellom tidsfarging og FACS-analyse. Husk at i begge tilfeller celler skal vaskes godt med PBSA (PBS inneholdende 0,2% BSA) buffer, før farging eller FACS-analyse.

  1. Ta ut 6 x 10 6 celler av MNCs fra trinn 1,15 (før man søker til kolonnen), B lymfocyttfraksjonen fra trinn 3,9 og T lymfocyttfraksjonen fra trinn 3.10.
  2. Spin cellensuspensjoner ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C ved hjelp av en swing-out rotor.
  3. Fjern supernatanten med pipette og vask cellepelleten en gang med 1 ml iskald PBSA. Spinn cellesuspensjoner ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten med pipette og resuspender celler i 600 mL av iskald PBSA buffer.
  4. Tilsett 100 ul av cellesuspensjonen til bunnen av en FACS rør.
  5. Tilsett 100 ul PBS inneholdende 10% varmeinaktivert humant serum til hvert rør, bland godt og inkuber i ~ 1 min ved romtemperatur, eller 20 minutter på is.
    Merk: B-lymfocytter bære Fc reseptorer. For å blokkere Fc-reseptorer de rensede cellefraksjoner ble inkubert med 10% varmeinaktivert humant serum. Den humane serum er varmeinaktivert ved inkubering ved 56 ° C i 1 time. Fordel varmeinaktivert serum i små porsjoner og butikken frosset ved -20 ° C.
  6. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C i en SW-ing-out rotor.
  7. Fjern supernatanten med pipette og vask cellepelleten med 1 ml PBSA. Gjenta sentrifugering (300 x g i 5 min ved 4 ° C).
  8. Tilsett 100 pl PBSA til hvert rør på is. Tilsett passende mengde fluorofor-konjugert monoklonalt antistoff, i henhold til produsentens anbefaling (f.eks, 20 ul av anti-CD20 og / eller 5 ul av anti-CD2-antistoffer i 100 ul av PBSA). Merk: Ikke glem å tildele nok kontrollrørene for FACS analyse. I denne protokollen følgende kontroller bør inngå: 1) celler farget med anti-CD2 og anti-CD20 antistoff individuelt, 2) celler farget med anti-CD2 og anti-CD20 isotypekontrollantistoffer individuelt og, 3) celler uten tillegg av antistoffer.
  9. I korthet vortex tube og inkuberes i 30 min ved 4 ° C i mørket.
  10. Vask 2 ganger med PBSA. Tilsett 2 ml 1% PFA løsning til prøvene. Lar cellene forbli i PFA-løsning ved 476 C i mørket til den tiden av FACS analyse.
  11. Umiddelbart før kjøring av prøvene i FACS maskinen, vask cellene 2 ganger med PBSA (300 xg i 5 minutter ved 4 ° C). Resuspender prøvene i 1 ml PBS og holde ved 4 ° C (eller is), beskyttet mot lys, før separasjon på strømningscytometer.
  12. Gjør FACS sortering følge protokollen fra strømningscytometer produsenten.

5. PCR Påvisning av Adenovirus DNA i Isolert Tonsillar B og T-lymfocytter

Merknad 1: De adenovirus hekson genet primere er AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3) og AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3) 11. Disse primere generere en amplicon av 139 bp. Verten 18S rRNA-genet kan påvises med primere tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') og tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Den forventede amplicon størrelse er 300 bp.

Note 2: Hver PCRrun omfatter en negativ kontroll (destillert H2O), og en positiv kontroll DNA oppnådd fra human B-cellelinje (BJAB) infisert med human adenovirus type 5 12.

  1. Utdrag DNA (fra minst 1 x 10 celler 6, trinn 3.11) ved hjelp av silikakolonne membranbasert rensemetode. Utdrag RNA ved hjelp av fenol og guanidinisotiocyanat løsning 13.
  2. Tilsett 100 ng DNA fra B- og T-lymfocytter til en reaksjonsblanding inneholdende 1 x HF-buffer, 0,2 mM deoksynukleotidtrifosfat mix (dNTP), 0,25 uM av hver primer og en U hi-fi-DNA-polymerase i et totalvolum på 20 ul.
  3. Utføre PCR-amplifikasjon under følgende veksling: 30 sek denaturering ved 98 ° C, etterfulgt av 30 sykluser av 98 ° C i 10 sek, 67 ° C (hekson) eller 58 ° C (18S rRNA) i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek. PCR-reaksjonen ble avsluttet med en endelig forlengelse trinn i 7 minutter ved 72 ° C.
  4. Separer den resulterende PCR forsterker;ication produkter på en 1,5% agarosegel i 1 x TBE-buffer og visualisere de forventede bånd ved farging med nukleinsyre flekken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En effektiv separasjon av tonsillare MNCs resulterer i høy-rene subpopulasjoner av B og T-lymfocytter. Dette ble bekreftet ved FACS-analyse ved bruk av anti-CD20 og anti-CD2 antistoffer for påvisning av B- og T-lymfocytt-populasjoner, respektivt (figur 3A). I motsetning til dette en ineffektiv separasjon av MNC resultater i cellefraksjoner som er en blanding av celler fra både B- og T-lymfocytt-subpopulasjoner (figur 3B).

Det isolerte tonsill- B- og T-lymfocytter (figur 3A) er av tilstrekkelig kvalitet for nedstrøms analyser som nukleinsyreisolering. I den aktuelle protokoll, DNA og RNA ekstrahert fra B- og T-lymfocytter blir anvendt for påvisning av adenovirus-DNA og cellulær RNA. Resultatene viser spesifikk påvisning av adenovirus-DNA i tonsillare T-lymfocytter (Figur 4). Også isolert RNA fra tonsill- B og T-lymfocytter er av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for seg nedstrøms m applikasjoner (figur 5).

Figur 1
Figur 1. Oversikt over tonsill- lymfocytt isoleringsprosedyren. Palatine mandel prøvene blir behandlet og tonsillare MNCer er isolert fra cellesuspensjonen ved tetthetsgradient-sentrifugering. B- og T-lymfocytter ble renset inn i underpopulasjoner av en positiv utvelgelse av T-lymfocytt fraksjonen med humant CD3 magnetisk antistoff. Dette rensetrinn gjør det mulig å vurdere de isolerte cellefraksjonene videre; for eksempel for å finne ut om noen virusarter er beriket innenfor noen av undergruppene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

jpg "/>
Figur 2. kirurgisk fjernet Palatine mandlene. Mandlene fjernet av mandlene (til venstre) og tonsillotomy (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representant FACS Resultatene av anriket cellefraksjoner. (A) Forward vs side spredningsdiagram som viser B (CD20) og T (CD2) lymfocyttpopulasjoner i tonsillare MNCs, T-lymfocytter og effluentfraksjoner. Renheten av T- og B-lymfocytter i anrikede cellefraksjoner er mer enn 90%. Siden B-celler utgjør 92% av de totale utslipps celler, er denne fraksjonen navngitt som B-lymfocytter undergruppe. (B) FACS plott som viser ineffektiv separasjon av B og T-celle subpopulations, på grunn av ikke-optimalisert antall MNCs brukes på kolonnen og utilstrekkelige vasketrinn. Bortsett fra behovet for magnetisk aktivert celle sortering optimalisering, det er en høy bakgrunn av CD2 - / CD20 -. Celler, noe som viser at FACS flekker ikke er godt optimalisert Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. PCR-påvisning av adenovirus-DNA i tonsillare lymfocytt fraksjoner. Total DNA ble ekstrahert fra B- og T-lymfocytter isolert fra venstre og høyre mandlene fra en pasient som gjennomgår mandlene. Endepunkt PCR blir utført med 100 ng av det rensede DNA. Felt 1: B-lymfocytt fraksjon (B) av den venstre mandel; felt 2: T-lymfocytt fraksjon (T) av LEFt mandel; felt 3: B-lymfocytt fraksjon (B) i rett mandel; felt 4: T lymfocyttfraksjonen (T) av den rette mandel. Adenovirus (Ad) DNA er bare påvises i isolerte T lymfocyttfraksjonen. Cellular 18S rRNA-genet fungerer som en intern kontroll for å vise at samme mengde DNA brukes til PCR-reaksjon i alle prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Høy kvalitet RNA ekstrahert fra isolerte B og T-celle-subpopulasjoner. Total cytoplasmisk RNA ekstrahert fra den isolerte B og T-lymfocytter ble separert på en 1% agarose gel. Felt 1: B-lymfocytt fraksjon (B) av den venstre mandel; felt 2: T-lymfocytt fraksjon (T) av den venstre mandel; felt 3: B-lymfocytt fraksjon (B) i rett mandel; felt 4:T-lymfocytt fraksjon (T) av den rette mandel. Vandringsmønster av 28S rRNA, 18S rRNA og små RNA indikeres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En av de viktigste faktorene som påvirker utfallet av denne protokollen er bruk av frisk tonsill- materiale som utgangsmateriale. Derfor bør mandel prøvene behandles innen tre timer etter operasjonen. Mandlene kan fås fra både voksne og barn. Den tonsill- materiale fra barn vanligvis er mindre på grunn av den delvise kirurgisk fjerning av mandlene (tonsillotomy). Derfor er antall MNCer oppnådd fra tonsillotomy prøver (1 x 10 7 -1 x 10 8) er mindre i forhold til mandlene prøver (1 x 10 8 x -2 10 9). Imidlertid ville celleisolasjon prosessen være den samme uavhengig av hvilken type operasjon.

Maksimere renheten av celleunderpopulasjoner oppnådd fra magnetisk aktivert cellesortering metoden krever noen optimalisering. Mengden og Inkubasjonstiden med magnetisk CD3 antistoff og antall MNCer som utøves på søylen er de viktigste faktorer som skal optimized. Ved for mange celler vil resultere i tilstopping av kolonnen og ineffektiv anrikning av celle subpopulasjoner. Ved optimaliseringen av denne protokollen, har vi funnet at påføring av mer enn 3 x 10 7 MNCer på separasjonskolonnen vil føre til en tilstopping av kolonnen og etterfølgende celle urene fraksjoner (figur 3B). Således, som starter med 3 x 10 7 MNCer gir godt anrikede lymfocytt-fraksjoner med tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for DNA og RNA-ekstraksjon (figurene 4 og 5). Det endelige antall isolerte B og T-lymfocytter er forventet å være 1-2 x 10 7, og 5-7 x 10 6, henholdsvis. Således bruk av 20 ul magnetisk CD3 antistoff per 3 x 10 7 MNCer synes å være optimal for vellykket B- og T-lymfocytt separasjon (figur 3A).

En tidligere rapport har slått fast at B og T-lymfocytter utgjør 60-70% og 30-40% av tonsillære MNCs henholdsvis, mens andrecelletyper som makrofager, natural killer celler og dendrittiske celler utgjør 1-8% av tonsillære MNCs 14. Lignende celle-mengdeforhold ble oppnådd med vår isolasjonsprotokoll som vist ved immunfarging av B- og T-lymfocytter med FACS-teknikk (figur 3A).

Antallet vasketrinn og vaskebuffervolumet er kritiske parametre for et godt resultat. Følgelig vil overdreven vasking føre til CD3 magnetiske antistoff knyttet T-celler til å ende opp i gjennomstrømnings, mens utilstrekkelig vasking vil redusere renheten av T-cellefraksjon.

Når de kritiske trinn i protokollen blir optimalisert for vevstype og de forventede nedstrøms analysene, er denne metoden enkel, effektiv, enkel og tidsbesparende. Imidlertid en begrensning av denne metode er en forholdsvis høy pris på kommersiell magnetisk-assosierte cellesorterings reagenser, som kan begrense storskala rensing av tonsillar B- og T-lymfocytter.

Oppsummert denne protokollen gir en strategi for oppnåelse av B- og T-subpopulasjoner, Palatine mandlene, og kan bli modifisert for å isolere cellefraksjoner fra andre vev som milt, thymus, lymfeknuter og blod. Vi bruker denne metoden videre å vise at vi påvise et adenovirus-infeksjon spesielt i tonsill- T-cellefraksjon (figur 4). Derfor bør denne protokollen være nyttig for et bredt område av applikasjoner, inkludert studier på verts-patogen interaksjoner, T-celle cytotoksisitets, T-celle aktivering, cellesignale og B og T celleoverflaten markør uttrykk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics