Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Het protocol beschrijft de isolatie van lymfoïde cellen van menselijke patiënt materiaal en vereist daarom een ​​ethische goedkeuring. Het werk in het huidige onderzoek werd door de Uppsala Ethische Review Board (DNR. 2013/387) toegekend.

1. Isolatie van mononucleaire cellen (MNC) van Human Palatine Amandelen

LET OP: Alle niet-afgeschermde materiaal van menselijke oorsprong, zoals bloed, weefsels of lichaamsvloeistoffen moet worden beschouwd als potentieel besmet materiaal. Daarom moet bioveiligheidspraktijken aanbevolen voor de behandeling van het menselijk weefsel te volgen.

Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten alle oplossingen en celcultuur apparatuur steriel zijn. Alle buffers en oplossingen moeten vooraf worden gekoeld en op ijs bewaard. Tonsillen weefsels en geïsoleerde cellen moet worden behandeld en verwerkt op ijs.

  1. Verkrijgen verse amandelen uit patiënten die tonsillectomie of tonsillotomy (figuur 2). Dompelen het weefsel Clumps in een 50 ml centrifugebuis gevuld met ijskoude steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 10 mM glutamine, 0,05 mg / ml gentamicine en 1% antibiotica Antimycoticum mix (Penicillin, streptomycine en amfotericine B).
  2. Laat de buizen met de ondergedompelde tonsil weefsel monsters te allen tijde op ijs. Proberen om de amandelen zo snel mogelijk te verwerken, en niet later dan 3 uur na operatieve verwijdering.
  3. Plaats de tonsillen op een 60 mm plastic celcultuur plaat op ijs en houden het weefsel bevochtigd met HBSS. Verwijder toegankelijk bloedstolsels, vet en bindweefsel met een schone pincet uit de tonsil oppervlak.
  4. Gebruik een nieuwe 60 mm celcultuur plaat met 5 ml HBSS. Snijd de tonsil weefsel klomp in 3-10 mm fragmenten met een steriele schaar en / of een scalpel.
  5. Bereid een nieuwe 60 mm celcultuur plaat met 10 ml HBSS en plaats een 100 micrometer plastic cel zeef in de HBSS oplossing.
  6. Breng de Dissecteerd tonsil fragmenten in de cel zeef met een steriele pincet. De zuiger uiteinde van een plastic injectiespuit, soepel knijp het weefsel fragmenten door de cel zeef. Zorg ervoor dat de tonsillen fragmenten volledig worden ondergedompeld in de HBSS.
  7. Gooi de cel zeef met het weefsel blijft en breng de verkregen celsuspensie van 60 mm celkweek plaat in een 50 ml plastic centrifugebuis. Laat de buis op het ijs, terwijl u doorgaat met de stappen 1.8 en 1.9.
  8. Bij grote amandelen, groter dan 2 cm in grootte (figuur 2), knijp de tonsillen fragmenten twee cel zeven om verstopping van de mazen van de zeef te voorkomen.
  9. Verkrijgen van het eindvolume van 35 ml van de celsuspensie.
    Opmerking: In deze stap is het mogelijk om de celsuspensie te bereiden op cryopreservatie (zie paragraaf 2).
  10. Voeg 10 ml dichtheidsgradiënt oplossing zoals Ficoll een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Voorzichtig overlay de cel suspension (stap 1,9) bovenop de dichtheidsgradiënt oplossing. Vermijd mengen van de celsuspensie en de dichtheidsgradiënt oplossing.
    Opmerking: De dichtheidsgradiënt oplossing op te warmen tot kamertemperatuur.
  11. Centrifugeer de celsuspensie in een swing-out rotor bij 700 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Heeft de remfunctie op de centrifuge zo hard remmen kan het verloop verstoren niet activeren. Gebruik ook de laagste versnelling functie beschikbaar is op de centrifuge.
    Opmerking: Hierna centrifugefase waarnemen MNO als een pluizige witte laag bij het ​​grensvlak, en rode bloedcellen (RBC's), fibroblasten en celresten als sediment op de bodem van de buis.
  12. Het verzamelen van de multinationals laag zorgvuldig met behulp van een 10 ml pipet. Plaats de celsuspensie in een nieuwe 50 ml centrifugebuis.
  13. Voeg 25 ml ijskoud PBS aan de celsuspensie en draai de buis bij 300 g gedurende 5 min in een swing-out rotor bij 4 ° C.
  14. Verwijder het supernatant met behulp van een 25 ml pipeten herhaal celpellet wasstap twee keer. Tenslotte resuspendeer de celpellet in 15 ml PBS.
    Opmerking: Na de laatste wasstap, is het mogelijk om de celsuspensie (zie punt 2) cryopreserveren.
  15. Breng 10 pl celsuspensie in hemocytometer cel telkamer en tel het aantal cellen onder een microscoop. Verdeel de juiste hoeveelheid cellen (bijvoorbeeld 2-3 x 10 7) in een 15 ml centrifugebuis voor daaropvolgende magnetische korrel scheiding. Houd dit monster op ijs tot stap 3.2.

2. cryopreservatie van de keelamandelen Cells

  1. Bereid bevriezing medium (90% FBS en 10% DMSO) en houd het op het ijs. Voor de lange termijn opslag houdt de bevriezing media bij -20 ° C.
  2. Bepaal het totale aantal cellen met een hemocytometer cel telkamer (stap 1.15). Bereken het vereiste hoeveelheid freezing medium volgens de gewenste ingevroren celdichtheid (bijvoorbeeld 10 7 cells / ml bevriezing gemiddeld).
  3. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 min. Schenk het supernatans zonder de celpellet en resuspendeer de celpellet in ijskoude freezing medium (uit stap 2.1).
  4. Verdeel 1 ml porties van de celsuspensie in steriele flesjes gemaakt voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Bevries de flacons in een isopropanol kamer en bewaar ze bij -80 ° CO / N. Voor de lange termijn bewaring overbrengen van de flesjes in een vloeibare stikstof bevattende opslagtank of -140 ° C cel vriezer.
  5. Om flesjes met bevroren cellen ontdooien, warm ze snel in een 37 ° C waterbad. Onmiddellijk wanneer ontdooid, verspreiden de celsuspensie in 10 ml voorverwarmde HBSS (met supplementen, stap 1,1) in een 15 ml centrifugebuis. Spin de buis bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder HBSS en resuspendeer de celpellet bij de gewenste celdichtheid in HBSS (met supplementen, stap 1,1).
    Opmerking: De levensvatbaarheid van de multinationals after ontdooien van belang, omdat de aanwezigheid van dode cellen de uiteindelijke opbrengst aan gezuiverd B en T-lymfocyten afnemen.
    Opmerking: Volgens onze ervaring van de levensvatbaarheid van de cellen minder dan 80% zal de celisolatie efficiency verminderen.

3. positieve selectie van T-lymfocyten bevolking van de keelamandelen multinationals

Opmerking 1: Dit protocol is gebaseerd op positieve selectie van humane CD3 + T-lymfocyten van keelamandelen MNCs via magnetische partikels gekoppeld aan het CD3-antilichaam. Het is mogelijk om dit onderdeel te starten van verse (deel 1) of de bevroren (hoofdstuk 2) multinationals.

Noot 2: Begin met 3 x 10 7 multinationals. Neem niet meer dan dit aantal cellen, omdat de scheiding kolommen kunnen verstoppen en dit zal de isolatie efficiency verminderen. Gebruik groter kolommen als er meer cellen worden behandeld. De in dit protocol volumes experimenteel geoptimaliseerd om het aantal cellen onsed in onze experimentele opstelling.

  1. Bereid de scheiding buffer [PBS (pH 7,2), 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA]. Filtreer de scheiding buffer door een 0,45 urn filter en bewaar bij 4 ° C.
  2. Draai de MDL suspensie (stap 1,14) bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de verkregen celpellet in 240 ui (80 ul per 10 7 cellen) ijskoude buffer scheiding. Breng de celsuspensie in een steriele 2 ml buis.
  3. Voeg 20 ul van magnetische CD3 antilichaam aan de celoplossing. Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voortdurend zachtjes mengen aan cellen in suspensie te houden.
  4. Overdracht van al de celsuspensie in een 15 ml buis met 5 ml ijskoude buffer scheiding om de cellen te wassen.
  5. Centrifugeer de buis bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een swing-out rotor.
  6. Inmiddels is het opzetten van de magnetische separator en de kolom. Bevestig de magnetische separator de stand en plaats de kolom in de SEPARator. Was de kolom door toepassing van 500 pl ijskoude buffer scheiding. Gooi de stroom door.
  7. Plaats een nieuwe 15 ml collectie buis onder de kolom. Houd de collectie buis op ijs.
  8. Verwijder het supernatant (stap 3,5) door pipet en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 500 ui buffer scheiden. Breng de celsuspensie bovenop de voorgewassen kolom en laat deze door.
    Opmerking: Cel klonten kan de kolom verstoppen en dus vermindering van het debiet. Om dit probleem te voorkomen, plaats een 40 urn plastic cel zeef bovenaan de kolom. Het passeren van de cellen door het gaas zal sterk de efficiëntie van deze werkwijze.
  9. Was de kolom 4 maal met 1,5 ml scheidingsbuffer (500 gl van 10 7-cellen). Wacht tot de kolom reservoir leeg is (geen vloeistof worden waargenomen in de kolom) alvorens de volgende wasstap.
    Opmerking: Haal de CD3 ongelabelde cellen, beschouwd als B-lymfocyt fractie, aangezien zijuitgewassen in de collectie buis.
  10. Verwijder de kolom uit de afscheider en plaats in een nieuwe 15 ml collectie buis. Pipetteer 2 ml scheidingsbuffer op de kolom. De aan de kolom toegevoerd plunjer elueren de positief geselecteerde T-lymfocyten, waarbij de T lymfocyt fractie worden beschouwd.
  11. Bepaal het aantal gezuiverde cellen (stap 1,15) indien nodig. Celsuspensies zijn nu klaar voor downstream experimenten.

4. Flowcytometrie Analyse van geïsoleerde keelamandelen B- en T-lymfocyten

LET OP: Paraformaldehyde oplossing is irriterend en verdacht carcinogeen. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en bescherming voor de ogen / het gezicht.

Opmerking 1: Dit protocol beschrijft de werkwijze voor de directe kleuring van de geïsoleerde B- en T-cellen door Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) analyse. Het hoofddoel van deze stap is om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulaties aF beoordelenter CD3 magnetische antilichaam scheiding. Hiertoe vastgestelde B- en T-cel markers, fluorofoor geconjugeerde monoklonale antilichamen CD20-FITC en CD2-APC worden gebruikt. Ook de opname van isotype controle antilichamen wordt sterk aanbevolen om de niet-specifieke "achtergrond" binding van CD2 en CD20-antilichamen (zie stap 4,8) onderscheiden.

Noot 2: Het is mogelijk om de gezuiverde celfracties in een 1% paraformaldehyde houden (PFA) oplossing in het donker bij 4 ° C tot de tijd van kleuring (bijvoorbeeld, de volgende dag.). Ook dezelfde procedure van toepassing als er een tijd tussen kleuring en FACS analyse. Bedenk dat in beide gevallen cellen goed moeten worden gewassen met PBSA (PBS met 0,2% BSA) buffer vóór kleuring en FACS analyse.

  1. Neem 6 x 10 6 cellen van multinationals uit stap 1,15 (voorafgaand aan het aanbrengen van de kolom), B-lymfocyt fractie uit stap 3.9 en T-lymfocyt fractie uit stap 3.10.
  2. Spin de celschorsingen bij 300 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C met behulp van een swing-out rotor.
  3. Verwijder het supernatant met pipet en was de celpellet eenmaal met 1 ml ijskoude PBSA. Draai de celsuspensies bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met pipet en resuspendeer de cellen in 600 ul ijskoude PBSA buffer.
  4. Voeg 100 ul van de celsuspensie op de bodem van een FACS buis.
  5. Voeg 100 ul PBS dat 10% hitte geïnactiveerd humaan serum aan elke buis, mengen en incuberen gedurende ~ 1 min bij kamertemperatuur of 20 minuten op ijs.
    Opmerking: B-lymfocyten dragen Fc-receptoren. Om het Fc receptoren blokkeren de gezuiverde celfracties worden geïncubeerd met 10% hitte geïnactiveerd humaan serum. Het menselijke serum wordt geïnactiveerd door incubatie bij 56 ° C gedurende 1 uur. Verdeel de warmte geïnactiveerd serum in kleine porties en bewaar bij -20 ° C ingevroren.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een swing-out rotor.
  7. Verwijder het supernatant met pipet en was de celpellet met 1 ml PBSA. Herhaal de centrifugatie (300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C).
  8. Voeg 100 ul PBSA in elke buis op ijs. Voeg de juiste hoeveelheid fluorofoor geconjugeerd monoklonaal antilichaam, volgens de aanbevelingen van de fabrikant (bijvoorbeeld 20 pl anti-CD20 en / of 5 ul van anti-CD2 antilichamen in 100 pl PBSA). Opmerking: Vergeet niet om voldoende controle buizen te wijzen voor de FACS analyse. In dit protocol dient de volgende controles worden opgenomen: 1) cellen gekleurd met anti-CD2 en anti-CD20 antilichamen afzonderlijk 2) cellen gekleurd met anti-CD2 en anti-CD20 isotype controle antilichamen individueel en 3) cellen zonder toevoeging van antilichamen.
  9. Kort vortex de buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker.
  10. Was 2 maal met PBSA. Voeg 2 ml van 1% PFA oplossing van de monsters. Laat de cellen blijven het PFA oplossing bij 476; C in het donker tot de tijd van FACS analyse.
  11. Onmiddellijk voor de monsters in de FACS-machine, was de cellen 2 maal met PBSA (300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C). Resuspendeer monsters in 1 ml PBS en bewaren bij 4 ° C (of ijs), beschermd tegen licht, vóór de scheiding op de flowcytometer.
  12. Doe de FACS sortering volgens het protocol van de flowcytometer fabrikant.

5. PCR Detectie van adenovirus DNA in geïsoleerde keelamandelen B- en T-lymfocyten

Opmerking 1: De adenovirus hexon gen primers AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') en AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Deze primers genereren van een amplicon van 139 bp. De gastheer 18S rRNA-gen kan worden gedetecteerd met tp206 primers (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') en tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). De verwachte amplicon grootte is 300 bp.

Noot 2: Elke PCRrun omvat een negatieve controle (gedestilleerd H 2 O) en een positieve DNA verkregen uit menselijke B-cellijn (BJAB) controle geïnfecteerd met het humaan adenovirus type 5 12.

  1. Extraheer DNA (uit ten minste 1 x 10 6 cellen, stap 3,11) met silicagel membraangebaseerde kolom zuiveringsmethode. Extract RNA met behulp van fenol en guanidine isothiocyanaat oplossing 13.
  2. Voeg 100 ng DNA van B- en T-lymfocyten van een reactiemengsel dat 1x HF buffer, 0,2 mM deoxynucleotidetrifosfaat mix (dNTP), 0,25 pM van elke primer en 1 U van High-Fidelity DNA polymerase in een totaal volume van 20 pl.
  3. Voer PCR-amplificatie onder de volgende cyclingcondities: 30 sec denaturatie bij 98 ° C, gevolgd door 30 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 67 ° C (hexon) of 58 ° C (18S rRNA) gedurende 30 sec en 72 ° C 30 sec. De PCR reactie werd beëindigd met een laatste verlenging stap van 7 minuten bij 72 ° C.
  4. Scheid de verkregen PCR-versterker;icatie producten op een 1,5% agarosegel in 1x TBE buffer en zichtbaar de verwachte banden door kleuring met nucleïnezuur kleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een efficiënte scheiding van tonsillar MNO resulteert in sterk gezuiverde subpopulaties van B- en T-lymfocyten. Dit werd bevestigd door FACS analyse met anti-CD20 en anti-CD2 antilichamen voor B en T-lymfocyt populaties, respectievelijk (figuur 3A) te detecteren. Daarentegen, een inefficiënte scheiding van MNO leidt celfracties die een mengsel van cellen van zowel B- en T-lymfocyt subpopulaties (Figuur 3B).

De geïsoleerde tonsillaire B- en T-lymfocyten (figuur 3A) van voldoende kwaliteit zijn voor downstream analyses zoals nucleïnezuur isolement. In het huidige protocol, DNA en RNA geëxtraheerd uit de B- en T-lymfocyten worden gebruikt voor detectie van adenovirus DNA en cellulaire RNA. De resultaten tonen specifieke detectie van DNA in adenovirus tonsillaire T-lymfocyten (Figuur 4). Ook geïsoleerd RNA van tonsillaire B en T-lymfocyten van voldoende kwaliteit en hoeveelheid van downstrea m toepassingen (figuur 5).

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van de tonsillar lymfocyten isolatie procedure. Keeltonsil monsters worden verwerkt en tonsillar multinationals zijn geïsoleerd van cel schorsing door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. B en T lymfocyten worden gezuiverd in subpopulaties met een positieve selectie van de T lymfocyt fractie met humane CD3 magnetische antilichaam. Deze zuiveringsstap maakt het mogelijk om de geïsoleerde celfracties verder te evalueren; bijvoorbeeld, om te bepalen of sommige virale soorten worden verrijkt in een van de subpopulaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

jpg "/>
Figuur 2. operatief verwijderd palatine amandelen. Amandelen verwijderd door tonsillectomy (links) en tonsillotomy (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Vertegenwoordiger FACS resultaten van de verrijkte cel fracties. (A) Forward versus kant scatterplot toont B (CD20) en T (CD2) lymfocytenpopulaties in tonsillaire multinationals, T-lymfocyten en effluent fracties. De zuiverheid van de T- en B-lymfocyten in verrijkte celfracties meer dan 90%. Aangezien B-cellen omvatten 92% van de totale uitstroom cellen, wordt deze fractie genoemd als de B-lymfocyt subpopulatie. (B) FACS plots tonen inefficiënte scheiding van B en T-cel subpaginaopulations, wegens niet geoptimaliseerde aantal MNO aangebracht op de kolom en stappen onvoldoende wassen. Afgezien van de noodzaak van magnetische-geactiveerde cel sortering optimalisatie, is er een grote achtergrond van CD2 - / CD20 -. Cellen, waaruit blijkt dat FACS kleuring is niet goed geoptimaliseerd Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. PCR detectie van adenovirus DNA in tonsillar lymfocyten fracties. Totaal DNA wordt geëxtraheerd uit de B- en T-lymfocyten geïsoleerd uit links en rechts amandelen van een patiënt ondergaan tonsillectomie. Eindpunt PCR wordt uitgevoerd met 100 ng van het gezuiverde DNA. Laan 1: B-lymfocyt fractie (B) van de linker tonsil; laan 2: T lymfocyt fractie (T) van het left tonsillen; laan 3: B-lymfocyt fractie (B) van de rechter tonsil; laan 4: T lymfocyt fractie (T) van de rechter tonsil. Adenovirus (Ad) DNA alleen detecteerbaar in geïsoleerde T-lymfocyt fractie. Cellulaire 18S rRNA-gen werkt als een interne controle aan te tonen dat dezelfde hoeveelheid DNA wordt gebruikt voor de PCR-reactie in alle monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Hoge kwaliteit RNA geëxtraheerd uit geïsoleerde B- en T-cel subpopulaties. Totaal cytoplasmatisch RNA geëxtraheerd uit de geïsoleerde B- en T-lymfocyten gescheiden op een 1% agarosegel. Laan 1: B-lymfocyt fractie (B) van de linker tonsil; laan 2: T lymfocyt fractie (T) van de linker tonsil; laan 3: B-lymfocyt fractie (B) van de rechter tonsil; laan 4:T lymfocyt fractie (T) van de rechter tonsil. Migratiepatroon van 28S rRNA, 18S rRNA en kleine RNA wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een van de belangrijkste factoren die de resultaten van dit protocol is het gebruik van verse tonsillar materiaal als het uitgangsmateriaal. Daarom moet de tonsil monsters wordt binnen 3 uur na de operatie. Amandelen kan worden verkregen van zowel volwassenen als kinderen. De tonsillar materiaal uit de kinderen gewoonlijk kleiner vanwege de gedeeltelijke chirurgische verwijdering van de amandelen (tonsillotomy). Daarom is het aantal MNO verkregen uit tonsillotomy monsters (1 x 10 7 x 10 -1 8) minder ten opzichte van tonsillectomie monsters (1 x 10 8 x 10 -2 9). Echter, zou de cel isolèringsproces hetzelfde ongeacht het type operatie.

Het maximaliseren van de zuiverheid van de cel subpopulaties verkregen van magnetisch geactiveerde celsortering methode vereist enige optimalisatie. De hoeveelheid en de incubatietijd met magnetische CD3 antilichaam en het aantal MNO op de kolom zijn de belangrijkste factoren die moeten worden kiezenimized. Het toepassen van te veel cellen leidt tot verstopping van de kolom en inefficiënte verrijking van cel subpopulaties. Bij het ​​optimaliseren van dit protocol, vonden we dat het toepassen van meer dan 3 x 10 7 MNO de scheidingskolom een verstopping van de kolom en daaropvolgende onzuivere celfracties (figuur 3B) veroorzaken. Dus, beginnend met 3 x 10 7 MNO geeft ook verrijkte lymfocyt fracties met voldoende kwaliteit en hoeveelheid van DNA en RNA-extractie (figuren 4 en 5). Het uiteindelijke aantal geïsoleerde B-lymfocyten en T wordt verwacht respectievelijk te 1-2 x 10 7 en 5-7 x 10 6,. Derhalve lijkt het gebruik van 20 gl magnetische CD3 antilichaam per 3 x 10 7 MNC optimum voor succesvolle B en T lymfocyten scheiden (figuur 3A) zijn.

Een vorige verslag heeft vastgesteld dat B en T-lymfocyten omvatten 60-70% tot 30-40% van de tonsillar multinationals respectievelijk, terwijl andereceltypes zoals macrofagen, natural killer cellen en dendritische cellen maken 1-8% van de tonsillar multinationals 14. Soortgelijke cellen percentages werden bereikt met onze isolatieprotocol zoals getoond door immunokleuring van de B- en T-lymfocyten met de FACS-techniek (figuur 3A).

Het aantal wasstappen en de wasbuffer volume zijn kritische parameters voor een goed resultaat. Dienovereenkomstig zal leiden excessieve wassen de CD3 magnetische antilichaam geassocieerd T-cellen om te eindigen in de doorstroom, terwijl onvoldoende wassen de zuiverheid van de T-cel fractie zal verminderen.

Wanneer de kritische stappen in het protocol geoptimaliseerd voor het weefseltype en de verwachte downstream analyses Deze methode is eenvoudig, efficiënt, eenvoudig en tijdbesparend. Maar een beperking van deze methode is relatief hoge kosten van commercieel magnetische celsortering geassocieerde reagentia die kunnen beperken grootschalige zuivering van tonsillar B- en T-lymfocyten.

Samengevat dit protocol voorziet in een strategie voor het verkrijgen van B en T subpopulaties van palatine amandelen en kan worden aangepast naar cel fracties te isoleren van andere weefsels zoals de milt, thymus, lymfeklieren en bloed. We deze werkwijze verder toepassing laten zien dat we detecteren een adenovirus infectie specifiek de tonsillar T-cel fractie (Figuur 4). Daarom moet dit protocol nuttig voor een breed gebied van toepassingen, waaronder studies op gastheer-pathogeen interacties, T-cel cytotoxiciteit, T-celactivering, celsignalen en B- en T-celoppervlak marker expressie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics