Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

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Ormiston, M. L., Toshner, M. R., Kiskin, F. N., Huang, C. J., Groves, E., Morrell, N. W., Rana, A. A. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (106), e53384, doi:10.3791/53384 (2015).

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Abstract

Introduction

Hasta hace poco, se creía que la generación post-natal de nuevos vasos sanguíneos que se produzca exclusivamente a través de un proceso conocido como angiogénesis, definido como el surgimiento de nuevos vasos a partir de las células endoteliales de los vasos preexistentes. 1 Este proceso contrasta de la vasculogénesis, o la formación de novo de vasos sanguíneos a partir de progenitores endoteliales, que se cree que se producen exclusivamente durante la embriogénesis. 2 Sin embargo, estudios más recientes han identificado y aislado células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) en la sangre periférica de adultos. Estas células poseen la capacidad de diferenciarse en células endoteliales maduras en cultivo y se cree que participar en la vasculogénesis postnatal. 3,4

Los protocolos para el aislamiento y expansión de estas EPCs típicamente involucran el cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) en medios que contienen factores de crecimiento endoteliales, incluyendo vasculfactor de crecimiento endotelial ar (VEGF) y las culturas EPC factor de crecimiento fibroblástico-2 5-8. producen una variedad de diferentes tipos de células de manera espectacular. Culturas iniciales (<7 días) están dominados por un tipo celular de monocitos, conocida en la literatura como "primeros" EPC. A pesar de su nombre, estas células expresan el marcador CD14 de monocitos, son negativos para el marcador CD34 progenitor y expresan niveles sólo mínimas de la clásica marcadores endoteliales CD31 y VEGF receptor 2 (VEGFR2). 5 cultura Continuación da lugar a una población secundaria de las células, conocido como EPC finales de excrecencia o células endoteliales excrecencia de sangre (BOECs), que aparecen como colonias discretas de células similares a las endoteliales. A diferencia de los principios de EPCs monocíticas, BOECs, que también han sido llamados formadoras de colonias (células endoteliales ECFCs), células endoteliales o células endoteliales excrecencia late-excrecencia, exhiben la morfología de adoquines que es típico de monocapas de células endoteliales y son muy similares en marcador de superficie5 y la expresión génica 9 a madurar las células endoteliales.

La generación de células similares a las endoteliales de sangre periférica ofrece varias ventajas, en particular para el estudio de la disfunción de la célula endotelial asociada con trastornos vasculares tales como la hipertensión arterial pulmonar (HAP) 10 o von Willebrand enfermedad. 11 Antes de la disponibilidad de BOECs, endotelial células sólo se podrían derivar de órganos explantados en el momento de la muerte o el trasplante de órganos, o aislada de la vena umbilical en el nacimiento. Esta disponibilidad reducida representado una seria limitación para la comprensión de la biología de las células endoteliales de pacientes con trastornos cardiovasculares, así como las interacciones entre las células endoteliales y, o bien células de la sangre o células murales. Además, el aislamiento y el cultivo de una población pura de células endoteliales a partir de estas fuentes es técnicamente difícil y las células obtenidas por estos métodos exhiben solamente un limited capacidad proliferativa. Por lo tanto, BOECs ofrecen un sustituto valiosa para el aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias derivadas del paciente.

Además de sus aplicaciones in vitro, BOECs también son potencialmente útiles en terapias de trasplante de células autólogas. Estas aplicaciones incluyen tanto el trasplante de células endoteliales para promover la neovascularización (véase 12 y referencias en él), así como la generación de células madre pluripotentes inducidas (CMPI). 13 iPSCs derivados de BOEC se pueden utilizar para el modelado de la enfermedad y ofrecen un potencial inmenso como el de partida material para las terapias con células autólogas. BOECs reprogramar más rápido y con una mayor eficiencia que los fibroblastos de la piel. Además, BOECs también permite la generación de células iPS que están libres de anomalías del cariotipo, que es una característica esencial de cualquier tecnología que será adecuado para aplicaciones de traslación. La capacidad de generar iPSCs de una muestra de sangre de un pacientelso elimina la necesidad de una biopsia de piel y la generación de fibroblastos de la piel, facilitando de este modo la generación de células de pacientes con trastornos de la cicatrización de heridas, o los muy jóvenes.

El protocolo se detalla a continuación, aprobado por y realizadas de conformidad con las directrices del Comité de Servicio de Ética de la Investigación Nacional (este de Inglaterra), proporciona un método sencillo y fiable para la generación de BOECs con una eficiencia superior al 90% a partir de un volumen relativamente pequeño (60 ml) de sangre periférica. Estas células son altamente proliferativa y pueden ser pasados ​​repetidamente, lo que permite la generación de cientos de millones de células de una única muestra de sangre.

Protocol

A esquemática del protocolo de generación BOEC se muestra en la Figura 1.

1. Extracción de Sangre y gradiente de densidad de centrifugación

  1. Para cada donante, añadir 3 ml de citrato de sodio a cada uno de dos tubos de centrífuga de 50 ml cónicos. Recoger 60 ml de sangre por punción venosa y añadir 30 ml a cada tubo. Invierta suavemente 2-3 veces para mezclar. Utilice tan sólo 40 ml de sangre en el protocolo, con volúmenes de citrato ajustados en consecuencia.
    NOTA: Es esencial que las muestras de sangre se procesan dentro de 2 horas de la recolección. Retraso en el procesamiento de los resultados de sangre en una marcada reducción en el rendimiento colonia consecuencia.
  2. Preparar nuevos tubos cónicos que contienen medio de centrifugación en gradiente de densidad por primera invirtiendo el frasco varias veces para mezclar. En una campana estéril, añadir 15 ml de medio de centrifugación en gradiente de densidad por cada 50 ml tubo cónico (1 tubo por cada 10 ml de sangre, 6 tubos por donante).
  3. Diluir la sangre 1: 1 con fosfato de DulbeccoSaline -Buffered (DPBS). Incline el tubo que contiene el medio de centrifugación en gradiente de densidad a un ángulo de 20 ° con la superficie de trabajo. El uso de una ayuda de la pipeta y una pipeta serológica de 25 ml, la capa lentamente 21 ml de sangre diluida en la parte superior del medio mediante la adición gradual de sangre por la pared del tubo inclinado.
    NOTA: Si lo hace, minimizar la mezcla de la sangre con la capa de gradiente de densidad y producirá una capa leucocitaria más apretado, así como un rendimiento mejorado.
  4. Centrifugar las muestras a 400 xg durante 35 min a TA con el acelerador y el freno.
  5. Durante este período de centrifugación, comenzará el recubrimiento de colágeno se detalla en los pasos 2.1 - 2.4. Asegúrese de que estos pasos se han completado antes de proceder al paso 3.1.

2. El colágeno Recubrimiento de T-75 Frasco y Preparación del medio de cultivo

NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo celular.

  1. Preparar una solución de colágeno / ml 50 mg diluyendo Stock TyPE I colágeno en 10 ml de ácido acético 0,02 M Ejemplo:. para el colágeno de stock a una concentración de 4,05 mg / ml, añadir 123,5 l de colágeno a 10 ml de ácido acético 0,02 M. Filtro estéril suspensión de colágeno antes de su uso.
  2. Utilizando una pipeta serológica, añadir 7,5 ml de solución de colágeno a un matraz de cultivo de células T-75. Este volumen da 5 mg de colágeno / cm2 (o 375 mg / frasco). Escudo matraz durante 1 hora a RT.
  3. Preparar el medio de crecimiento endotelial utilizado para la generación BOEC completándolo medio basal endotelial con los suplementos de factores de crecimiento proporcionadas por el fabricante. Añadir todos los suplementos, pero no agregue suero. Para preparar 15 ml de medio de generación BOEC, añadir 2,5 ml de suero bovino fetal definido (FBS) a 12,5 ml de medio de crecimiento endotelial que contiene los suplementos de factores de crecimiento.
  4. Continúe con los pasos descritos en la sección 3. Después del período de recubrimiento 1 hr, aspirar la solución de colágeno y lava el ácido acético residual mediante pipeteoen 10 ml de DPBS. Aspirar el DPBS y repita este paso de lavado una vez más. Si la suspensión celular obtenida durante el paso 3.3 no está listo para el recubrimiento en este momento, añadir 5 ml de medio de generación BOEC al matraz para mantener el revestimiento de colágeno a partir de secado-out.

3. Recogida y Chapado de PBMNCs

  1. Después de la centrifugación en gradiente de densidad se indica en el paso 1.4, recoger cuidadosamente la capa leucocitaria usando una pipeta de transferencia de plástico estéril. Colección de la capa leucocitaria debe producir aproximadamente 20 ml de suspensión de células y plasma de cada tubo. Evitar la transferencia de el medio de gradiente de densidad.
  2. Diluir la suspensión de células mononucleares 1: 1 en DPBS e invierta para mezclar. Centrifugar a TA durante 20 min a 300 xg con freno y acelerador al máximo.
  3. Después de la centrifugación, aspirar las células sobrenadante y resuspender mediante la adición de 1 ml de medio de generación BOEC a cada pellet y pipeteando arriba y abajo varias veces. Celular piscina suspensiones und reponer volumen total de 10 ml con el medio restante.
  4. Para obtener una estimación del número total de células, muestra de 10 l de suspensión celular y se diluye 50x con 490 l de solución de Turk, que se lisar células rojas de la sangre. Contar una muestra de 10 l de la suspensión celular diluida usando un hemocitómetro.
    NOTA: 60 ml de sangre debe producir aproximadamente 100 a 150 x 10 6 células blancas de la sangre para la siembra.
  5. Placa suspensión celular entera en una sola, T-75 frasco de colágeno recubierto, top-up volumen medio a 15 ml / frasco y la cultura a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. Las células chapados en este momento representan el paso 0.
    NOTA: Es posible congelar las PBMNCs aislados antes del aislamiento BOEC con el fin de derivar las BOECs en un momento posterior o con el fin de transportar los PBMNCs a un laboratorio diferente, donde los BOECs se pueden generar. Sin embargo, es importante señalar que PBMNCs congelación podrían reducir la eficiencia de aislamiento BOEC. See sección 8 a continuación para el método.

Cultivo Celular 4. A largo plazo

  1. Cambio de medio cada 2 días mediante la adición de 15 ml de medio de generación BOEC fresco (5: 1 mezcla de medio de crecimiento de células endoteliales y definido FBS). Para fines de semana, cambios de medio pueden retrasarse a cada 3 días.
    NOTA: colonias consecuencia deben aparecer entre los 7 y 14 días de cultivo.
  2. Supervisar el frasco de cultivo BOEC en los días 7-14 de la aparición de colonias excrecencia. Identificar las colonias como grupos circulares de células que presentan un clásico morfología de adoquines endotelial.
  3. Una vez que una colonia o múltiples colonias se identifican en el matraz, continúe con cambios de medio y permitir que las colonias crezcan hasta aproximadamente 1.000 a 2.000 células por colonia antes de pases. Determinar el número de células por colonia a través de una estimación visual aproximada.
    NOTA: Como guía, se acostumbra a paso colonias excrecencia iniciales Una semana después de la identificación de la primera colonia consecuencia.
  4. <li> células paso por aclarado matraces dos veces con 10 ml de DPBS. Añadir 5 ml de 1X tripsina-EDTA y se incuban en una incubadora a 37 ° C durante 5 min. Después de 5 min, neutralizar la tripsina con 10 ml de medio (que contiene FBS) y llevar las células en suspensión con pipeteo repetido.
  5. Suspensión Centrifugar a 300 xg durante 5 min, se resuspende en 15 ml de medio fresco y generación BOEC placa entera suspensión celular a un nuevo matraz T-75 (que representa el paso 1, P1). No se requiere ningún recubrimiento de colágeno.
  6. Continuar cambios de medio como se describe más arriba hasta que las células son confluentes (aproximadamente 3-5 x 10 6 células por frasco). Una vez confluentes, las células de paso como se ha descrito en el paso 4.3.
    NOTA: Desde el paso 2 en adelante, las células ya no requieren la generación de medio BOEC y puede ser cultivado en un medio de crecimiento de células endoteliales y 10% estándar FBS inactivado por calor. Revestimiento de colágeno puede ser utilizado como un paso opcional en el futuro, ya que no hay evidencia que sugiere que la presencia de colágeno puede mejorar prolifer BOEClas tasas de inflación.
  7. Para pases continuación, la placa no menos de 750.000 células por matraz T-75 como bajas densidades celulares pueden causar los BOECs para detener la proliferación.

5. La congelación y descongelación Culturas BOEC

  1. Trypsinize células como se describe en la sección 4.3 y se centrifuga a 300 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de medio. Esto no requiere un medio de crecimiento de células endoteliales; DMEM con 10% FBS estándar será suficiente. Recoger una muestra de 10 l de la suspensión de células para llevar a cabo un recuento de células manual utilizando un hemocitómetro.
  2. Centrifugar de nuevo y resuspender en 2x10 6 células / ml en medio de criopreservación enfriado con hielo (40% de DMEM con 50% de FBS y 10% de DMSO). Añadir 0,5 ml (10 6 células) a cada vial, lugar viales en un hielo isopropanol frío recipiente de crioconservación y colocar en un congelador a -80ºC durante al menos 2 horas antes de transferir a nitrógeno líquido. No deje las células a -80 ° C durante más de 24 horas. Para descongelar las células, añadir 10 ml de medio precalentado a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
    NOTA: Al descongelar a cabo el paso 1 células, descongelar en un medio de crecimiento de células endoteliales suplementado con 20% FBS definido por los primeros 2 días después de la descongelación. Esto conduce a un aislamiento de células más estable en el futuro.
  3. Extraer células del nitrógeno líquido y descongelación en un 37 ° C baño de agua con agitación suave hasta que sólo un pequeño cristal de hielo se deja en el vial. Añadir el contenido del vial gota a gota al tubo de centrífuga cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de EGM-2MV + 10% de FBS. Añadir a T-75 frasco y medio superior hasta 15 ml.

6. Caracterización de BOECs por Citometría de Flujo

  1. Una vez que las colonias BOEC descritos en la sección 4 se les ha permitido ampliar, trypsinize células como se describe en la sección 4.4 y resuspender en una concentración de 10 6 células por ml en tampón de tinción (DPBS ingenioh 2% de FBS y EDTA 2 mM).
  2. Combine 10 5 células con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra CD45, CD14, CD34, CD31 (uso todos a la dilución 1:20) o VEGFR2 (diluir 1:10) (ver Tabla 1 para más detalles). Incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
  3. Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Sobrenadante Aspirar y resuspender en 400 l de tampón de tinción para el análisis. Mantenga las células a 4 ° C y protegido de la luz antes del análisis.
  4. Realizar análisis de citometría de un citómetro equipada en detectar los anticuerpos conjugados con fluorescencia utilizados en el ensayo.
  5. Utilice una muestra BOEC sin teñir para identificar la población de células en el citómetro mediante el ajuste hacia delante y voltajes de dispersión lateral, así como los voltajes para los canales de FITC y APC.
  6. Determinar gating umbrales utilizando células isotipo manchado para cada fluorocromo. Evaluar positividad para cada marcador de superficie celular basado en la presencestá analizando e de un cambio máximo en la intensidad de fluorescencia frente al control de isotipo para el fluorocromo.

7. Caracterización de BOECs por Microscopía de inmunofluorescencia

  1. BOECs placa en una pocillos 24, placa de cultivo tisular de fondo plano sin cubreobjetos a una densidad de 5 x 10 4 células en 500 l de medio de crecimiento de células endoteliales + 10% de FBS por pocillo y se dejó a adherirse y crecer a 37 inactivado por calor ° C, 5% de CO 2 hasta que las células cubrir al menos el 70-80% de la superficie de cada pocillo (estimación de confluencia mediante inspección visual bajo un Microscopio de luz).
  2. Lavar las células en cada pocillo durante 5 min con 1 ml de DPBS.
  3. Fijar las células O / N a 4 ° C con 500 l de solución de paraformaldehído al 4% en DPBS.
  4. Lavar las células de 3 x 5 min con 1 ml de DPBS por pocillo. Añadir y eliminar los DPBS utilizando una pipeta y un aspirador, respectivamente.
  5. Permeabilizar las células para 3 x 10 min con 0,2% de polisorbato 20 en DPBS. Se incuban las células durante 1 hora a RT en tampón de bloqueo que contiene 10% de FBS en DPBS.
  6. Células de la mancha a 4 ° CO / N en 300 l de tampón de dilución de anticuerpo (0,1% de albúmina de suero bovino en DPBS) que contiene anticuerpos primarios dirigidos contra CD34 (10 mg / ml), CD144 (1: 300) o vWF (1: 250) . Ver Tabla 1 para más detalles.
  7. Lavar anticuerpos primarios no consolidados para 5 x 10 min con DPBS.
  8. Se incuban las células durante 1 hora a RT con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia apropiada, como se detalla en la Tabla 1 (todos a 1: 200).
  9. Lavar secundaria de anticuerpos no unidos para 5 x 10 min con DPBS.
  10. Se incuban las células con 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en DPBS durante 10 min a RT.
  11. Lavar las células con DPBS durante otros 3 x 5 min.
  12. Celdas de imagen a 100 aumentos utilizando un microscopio invertido equipado con una fuente de luz externa para la excitación de fluorescencia, y capturar imágenes utilizando un adjuntarcámara digital ed para su posterior análisis fuera de línea.

8. congelación y descongelación PBMNCs

  1. Al final de la etapa 3.2, después de la centrifugación, aspirar el medio y alterar manualmente el sedimento celular con repetido pipeteado arriba y hacia abajo utilizando una punta de pipeta P1000. Añadir 1 ml de medio de congelación, 90% de suero y 10% de DMSO, asegurándose de mezclar suavemente para producir una suspensión celular. Transferir la suspensión celular a un criovial y congelar y descongelar como se describe en la Sección 5.

Representative Results

Aislamiento de células mononucleares de la capa leucocitaria de 60 ml de sangre normalmente produce 100-150x10 6 células blancas de la sangre totales. Cuando chapada en un solo matraz T-75, el gran número de células en la suspensión celular no lisadas hace que sea difícil de resolver células adherentes mediante microscopía de campo claro individuales. Cambios de medio repetidas dan lugar a la liquidación de las células no adherentes y permiten la visualización de la población adherente de monocitos "primeros" EPC. Al día 7, el T-75 contendrá aproximadamente 7x10 6 de estas células adherentes alargados. Desde el día 7 al 14, las colonias de BOECs deben aparecer dentro del matraz (Figura 2A). Colonias primero aparecen como 3 a 5 células adyacentes. Número de colonias excrecencia puede variar de 1 a 10 colonias por 60 ml de sangre. En general, los donantes más jóvenes (es decir, 20-25 años de edad) tienden a producir un mayor número de colonias excrecencia, que también aparecen antes en la cultura.BOECs proliferan de este grupo central de las células para formar colonias circulares que consisten en varios cientos de células. Las células dentro de estas colonias presentan una clásica morfología de adoquines endotelial.

Es preferible paso colonias iniciales cuando contienen aproximadamente 1.000 células por colonia. Colonias consecuencia suelen alcanzar este tamaño de 7 días después de su aspecto original en la cultura. Una vez que las colonias originales se pasan a un nuevo matraz T-75, deberían proliferar para formar una monocapa confluente (3-5x10 6 células por matraz) dentro de los 5 días o menos (Figura 2B). En un pequeño porcentaje de aislamientos (<10%), las colonias excrecencia no aparecen o no proliferan suficientemente tras este paso inicial pases. BOECs que exhiben baja proliferación después de su primer pases rara vez van a convertirse en aislamientos BOEC estables ya menudo detener la proliferación en dos o tres pasajes. El monocíticaEPC principios contenidos en las culturas BOEC son no proliferativa y típicamente se borran de las culturas dentro de 1-2 pasajes. Liquidación de estas células tempranas se debe a la muerte celular, la insuficiencia de las células tempranas de volver a adherirse después de pases y la dilución de los principios de EPCs no proliferativas con pases repetidos.

Células Passage 1 o bien se pueden pases más en la cultura o congelaron para su uso posterior. Una vez que se genera un aislamiento estable, las células pueden ser pasados ​​a una velocidad de 1 matraz confluente a 3-5 nuevos matraces T-75 hasta el paso 8 o 9 antes de convertirse en reposo. Una vez más, la densidad celular es crítica a través de la cultura. En nuestra experiencia, no menos de 750.000 células deben ser chapada en un matraz T-75, como densidades celulares más bajos puede causar la detención del crecimiento. A pesar del alto potencial proliferativo de BOECs, las células deben tampoco se les permitirá convertirse overconfluent (es decir.,> 5x10 6 células por frasco) ya que esto puede causar convers ion de BOECs a un fenotipo no proliferativa.

Proponemos que cualquier célula está etiquetado como un BOEC debe mostrar superficie celular apropiado y tinción intracelular de marcadores endoteliales. Caracterización de BOECs se puede lograr mediante citometría de flujo (Figura 3) o microscopía de fluorescencia (Figura 4), ​​después de la tinción para los marcadores típicos de células endoteliales. BOECs son positivas para el CD31 marcadores de superficie endotelial y VEGFR2 y son negativos para el marcador CD14 de monocitos y el marcador CD45 pan-leucocitario. BOECs también posess cuerpos de Weibel-Palade y así expresar el factor de Von Willebrand (vWF) como tinción citoplasmática discreta, punteada. A diferencia de otros tipos de células endoteliales maduras, tales como la arteria pulmonar o células endoteliales aórticas, BOECs también expresan el progenitor y la activación marcador CD34 en su superficie.

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Figura 1. Diagrama esquemático del protocolo de generación BOEC. Células mononucleares de sangre periférica son aisladas de sangre venosa mediante centrifugación en gradiente de densidad y se cultivaron en placas recubiertas con colágeno en medio de crecimiento endotelial con adición de FBS definidos. Colonias BOEC aparecen dentro de 7-14 días de cultivo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Imágenes campo claro de culturas BOEC representativos. (A) colonias consecuencia aparece en culturas entre los días 7 y 14. Las colonias se presentan como colecciones de células de tipo endotelial, que se disponen en una sola capa de adoquines y proliferan radialmente hacia fuera desde un punto central. Alrededor de las colonias excrecencia son el mono adherentecélulas cytic que componen la gran mayoría de las células en las primeras culturas. Estas células, previamente descritas como "principios" células progenitoras endoteliales, tienen una morfología de tipo huso y expresan el marcador CD14 monocitos. (B) A raíz de los pases, los BOECs altamente proliferativas hacerse cargo de las culturas, ya que las células monocíticas no proliferativas o bien mueren o dejan de volver a conectar después de pases. Barra de escala 250 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Caracterización de BOECs por citometría de flujo. BOECs se tripsinizaron y se tiñeron con anticuerpos de control de isotipo conjugados con fluorescencia (gris pico de llenado) o anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie específicos (línea roja). Marcadores de superficie para la caracterización de citometríaincluyen los marcadores hematopoyéticos CD45 y CD14, los marcadores endoteliales CD31 y VEGFR2 y la progentior y marcador de activación endotelial CD34. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. La tinción de inmunofluorescencia de BOECs para marcadores de células endoteliales. Inmunofluorescencia imágenes representativas de BOECs immunostained con anticuerpos dirigidos contra endotelial marcador de superficie celular CD144 (VE-cadherina, panel superior derecho) y la glicoproteína de sangre Factor von Willebrand (vWF, panel inferior derecho) . Paneles correspondientes que muestran tinción DAPI nuclear se muestran a la izquierda. Barra de escala 50 micras. para CD144. Haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For blood collection
60 ml syringe with luer-lok tip BD 309653
19G Surflo Winged Infusion Set Terumo SV-19BL
50 ml conical centrifuge tube StarLab E1450 2 per donor
Sodium Citrate Martindale Pharmaceuticals 270541
Name Company Catalog Number Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) Sigma-Aldrich D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes Appleton Woods KC231
Turk’s Solution Millipore 1.093E+09
Name Company Catalog Number Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail) BD Biosciences 35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) Sigma-Aldrich D8537
0.02M Acetic Acid  Sigma-Aldrich A6283 prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV
(containing Bullet Kit, but not serum)
Lonza CC-3202 Note: It is essential that the medium does not contain heparin.  
Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined Hyclone SH30070
10x Trypsin EDTA Gibco T4174 Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS Gibco 10500-064
DMEM Gibco 41965-039
DMSO Sigma-Aldrich 276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container Sigma-Aldrich C1562
Name Company Catalog Number Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14 BD Biosciences 555397 Mouse IgG1k, Clone: WM59
Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31 BD Biosciences 555445 Mouse IgG1k, Clone: WM59
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34 BD Biosciences 555824 Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34
Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45 BD Biosciences 560976 Mouse IgG1k, Clone: HI30
Dilution: 1:20
 APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 R&D Systems FAB357A Mouse IgG1, Clone: 89106
Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control BD Biosciences 555748 Clone: MOPC-21
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control BD Biosciences 555751 Clone: MOPC-21
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control R&D Systems IC002A
Dilution: 1:10
Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution Sigma-Aldrich E7889
Name Company Catalog Number Comments
For immunofluorescent microscopy 
Corning Costar 24-well tissue culture plate Sigma-Aldrich CLS3527
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
BSA Sigma-Aldrich A7906
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody R&D Systems MAB72271 Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) R&D Systems AF938 Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) Abcam ab154193 Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-21202 Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11055 Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Life Technologies A-10042 Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542 use at 1 μg/ml

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References

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334 (2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31 (2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. (2009).

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