Author Produced

Isolasjon og kompositorisk analyse av plante Cuticle Lipid Polyester Monomers

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jenkin, S., Molina, I. Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers. J. Vis. Exp. (105), e53386, doi:10.3791/53386 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Karplanter stole på ekstracellulære lag som fungerer som vanntette barrierer mellom plantemateriale og det ytre miljø. Disse lipofile cellevegg-assosierte strukturer begrenser patogene infeksjoner og regulere den passive transport av gasser, vann og oppløste stoffer i og ut av plantevev 1. Slike barrierer er anlegget skjellaget, en synapomorphic struktur unik for planter 2, og ulike suberin holdige diffusjonsbarrierer. Hårstråene er et oleofilt sjikt syntetisert av epidermale celler og bundet til den via en pektinmaterialet lag på den ekstracellulære siden av celleveggen 3-5. Den omgir den primære luft organer av høyere planter, som fungerer som en viktig grensesnitt mellom plantevev og miljø.

Cutin, den strukturelle matrise av skjellaget, og suberin er to uløselige glycerolipid polyestere forbundet med løsemiddeluttrekk voks 2,4. Disse polymer lipids er sammensatt av mettede og umettede fettsyrederivater og er både strukturelt og funksjonelt lignende. Men de er gjenkjennelig med karakteristiske forskjeller i kjemisk sammensetning og deponeringssteder.

Suberin er en alifatisk polyester som ligger inne i celleveggene av enkelte ytre og indre vev som danner en sekundær vegg. Suberized vev inkluderer periderms av røtter, knoller og tree bark, rot endodermis, frø frakk lag og helbredet sår 2. I motsetning cutin inneholder suberin polyester typisk alkoholer, mettede og mono-umettede dikarboksylsyrer, og en stor andel av meget-langkjedede monomerer (C≥20).

Cutin er den mest tallrike lipid polyester i karplanter 6, og er sammensatt av glycerol og C16-C18 interforestrede fettsyrederivater, så som hydroksy og hydroksy-substituerte fettsyrer epoksy-4. Mens sammensetningen av polymerer cutinvarierer mellom tracheophyte arter er de mest dominerende primære monomerer er 10, 16-dihydroksy-16: 0, 18-hydroksy-9,10-epoksy-18: 0, og 9,10,18-trihydroksy 18: 0 fettsyrer. Interessant, Arabidopsis blad og stilk cutin består hovedsakelig av 18: 2 dicarboxylsyre 7,8.

Plante hårstråene presenterer også en betydelig variasjon i tykkelse, som strekker seg fra noen få nanometer til flere mikrometer 9. Siden hårstråene isolasjon er en arbeidskrevende og tidkrevende trinn, særlig for meget tynne blad hårstråene slik som de av Arabidopsis thaliana 8, har fremgangsmåter som omgår hårstråene isolasjon blitt utviklet og validert 7,8. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å studere monomersammensetningen av Arabidopsis thaliana cutin i bladene av natriummetoksid (NaOMe) -catalyzed depolymerisering og påfølgende gasskromatografi / massespektrometri (GC / MS) analyse. Denne protokollen gir en robust fremgangsmåte for analysering composition av plante lipid polyestere i hele delipiderte vev, og har blitt tilpasset fra tidligere rapporterte protokoller 7,10,11. Hele vevsprøver er første homogenisert og grundig delipidert, fjerne løsemiddel utvinnbar lipider inkludert cuticular og epicuticular voks, membranlipider, og triacylglyceroler. Cellevegg beriket rester blir så depolymerisert inn beskaffenhet methyl ester monomerer ved natriummetoksyd-katalysert metanolyse. Fettsyremetylestere er trukket ut ved surgjøring, og derivatisert for å oppnå de tilsvarende trimetylsilyl eller acetylderivater. Derivatiserte rester er svært flyktig, og kan bli eluert fra en gass-kromatografi-kolonne på en rimelig temperatur uten å endre deres strukturelle konformasjon under GC / MS-analyse.

Protocol

Merk: Denne protokollen ble tilpasset fra Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Trinn 1-5 er oppsummert i figur 1.

1. Tissue delipidering

Merk: Skyll alltid alle glass og caps med kloroform, la tørke i henhold avtrekkshette, før bruk.

FORSIKTIG: Utfør vev homogenisering og alle løsemiddel overføre trinnene under avtrekksskap; Bruk alltid frakk, hansker og splash vernebriller for å unngå direkte kontakt med kjemikalier og for å beskytte prøvene mot forurensning.

  1. Forvarm vannbad og varmeblokk til 85 ° C.
  2. Veie ca 0,5 g av hvert blad prøven i pre-veid 20 mm x 125 mm glass reagensrør med polytetrafluoretylen (PTFE) -faced skrulokk. Inkluderer fire replikater per prøve.
  3. Plasser 2-propanol i en Erlenmeyerkolbe (ca. 125 ml, 25 ml per g av sample). Legg 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (også kjent som butylhydroksytoluen, BHT) til en sluttkonsentrasjon på 0,01% (w / v).
    Merk: Legg BHT fra en 5% (w / v) stamløsning i metanol (BHT bidrar til å minimere oksydasjon av umettede fettsyrer).
  4. Forvarm 2-propanol-løsning til 85 ° C i vannbad.
  5. Tilsett 12 ml varm 2-propanol løsningsmiddel til hvert prøverør og varme i 15 minutter ved 85 ° C i varmeblokk. Dette trinnet inaktiverer lipaser som slippes ut fra ødelagte celler.
  6. La rørene avkjøles til romtemperatur og male vev grundig med homogenisator til en homogen suspensjon er oppnådd.
  7. Plassere prøvene på en orbital-rystemaskin, og rist i 1-2 timer ved 100 rpm og værelsetemperatur.
  8. Sentrifuger i 10 minutter ved 800 xg, og supernatanten kastes.
  9. Legge til et like stort volum 2-propanol, og rist i 12 timer ved romtemperatur.
  10. Sentrifuger i 10 minutter ved 800 xg, og supernatanten kastes.
  11. Legg 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) til aminosyrerest (25 ml per g av prøven) og ristes over natten ved 100 rpm og værelsetemperatur.
  12. Sentrifuger i 10 minutter ved 800 xg, og supernatanten kastes.
  13. Tilsett 12 ml CHCI3: CH3OH (1: 2, v / v) til aminosyrerest og rist over natten ved 100 rpm og værelsetemperatur.
  14. Sentrifuger i 10 minutter ved 800 xg og fjern løsningsmidlet.
  15. La prøvene tørrhet under avtrekkshette over natten ved romtemperatur.
  16. Luft-tørke resten og deretter i en vakuumeksikator over vannfri CaCI2 eller Caso 4 til konstant vekt er nådd (3-5 dager).

2. depolymerisasjon: Metanolyse med natriummetoksyd (figur 2)

FORSIKTIG: Utfør trinn 02.03 til 02.04, 02.07 til 02.08, 02.10 til 02.11, 02.13 til 02.15 og 02.17 til 02.18 i henhold avtrekkshette; Bruk alltid frakk, hansker og sprut vernebriller.

  1. Forvarm varme blokk til 60 ° C.
  2. Veie reagensglass som inneholdt den tørre rest (viktig for videre beregninger).
  3. Legg interne standarder i hvert rør: 25 ωL metyl heptadecanoate (1 mg / ml lager), og 25 ul ω-pentadecalactone (1 mg / ml lager).
  4. Legg 0,9 ml metylacetat, 1,5 ml natrium-metoksyd, og 3,6 ml metanol til hvert rør, og lokket dem. Alternativt fremstille en reaksjonsblanding med disse tre reagenser og tilsett 6 ml alikvoter til hver prøve.
  5. Varme prøvene i 2 timer ved 60 ° C og vortex periodevis i løpet av 15 min intervaller.
  6. La prøvene avkjøles til romtemperatur.
  7. Tilsett 10 ml metylendiklorid (CH 2Cl 2) og 1,5 ml iseddik for å trekke ut de fettsyremetylestere.
  8. Legg saltoppløsning (0,5 M NaCl) for å fylle hvert rør og hette.
  9. Vortex prøver for 1 min og sentrifuger i 10 minutter ved 800 x g.
  10. Overfører den organiske fasen (lavere) for å rense mellomstore rør (16 x 125 mm glass reagensglass med polytetrafluorethylen (PTFE) -faced skrukork).
  11. Legg saltoppløsning (0,5 M NaCl) for å fylle hvert rør og hette.
  12. Vortex prøver for 1 min og sentrifuger i 10 minutter ved 800 x g.
  13. Fjern vandig (øvre) fase og gjentar trinn 02.11 til 02.12.
  14. Fjern alle vandig (øvre) fase.
  15. Legg vannfritt natriumsulfat (Na 2 SO 4) til løsningsmidlet, Lukk rørene, og vortex i 1 min; Prøvene kan nå stå til neste dag. På dette punktet prøver kan stå over natten under avtrekkshette.
  16. Sentrifuger i 2 minutter ved 800 xg for å komprimere Na 2 SO 4 salt i bunnen.
  17. Overfør den organiske fase til et lite glass engangs rør (13 x 100 mm glass reagensglass med polytetrafluoretylen (PTFE) -faced med skrukork).
  18. Fordamp løsningsmidlet til tørrhet under nitrogen og videre til derivatisering trinn. Hvis ikke behandles umiddelbart, lagre fordampet prøver ved -20 ° C (prøver kan være enLSO er lagret før fordampning trinn).

3. Utarbeidelse av derivater for gasskromatografi

FORSIKTIG: Utfør trinn 3.1.2 og 3.1.5 - 3.1.8 under en avtrekkshette; Bruk alltid frakk, hansker og sprut vernebriller.

  1. Trimetylsilylderivater
    1. Forvarm varmeblokk til 100 ° C.
    2. Tilsett 100 ul pyridin og 100 ul av BSTFA (N, O-bis-trimetylsilyl-trifluoracetamid) til hvert rør, og lokket dem.
    3. Varmeprøver ved 100 ° C i 10 min.
    4. La prøvene avkjøles til romtemperatur.
    5. Fordamp prøvene under nitrogen ved romtemperatur. Unngå å bruke varme til prøvene, monomerer er svært volatile på dette stadiet.
    6. Legg 500 mL av 1: 1 (v / v) heptan: toluen.
    7. Vortex prøver for 1 min og sentrifuge i 2 minutter ved 800 x g.
    8. Legg prøvene til GC ampuller og fortsett til GC / MS-analyse.
  2. Acetylderivater
    Merk: For acetylering, endre skritt 3.1.1-3.1.3 ovenfor som følger (ikke vist i videoen); trinn 3.1.4-3.1.8 er de samme:
    1. Forvarm varme blokk til 60 ° C.
    2. Tilsett 100 ul pyridin og 100 ul eddiksyreanhydrid (Ac 2 O) til rørene.
    3. Varmeprøver 1 time ved 60 ° C.

4. GC / MS-analyse

  1. Bruk en HP-5 kapillær kolonne (30 x 0,25 mm x 0,25 mikrometer filmtykkelse) eller tilsvarende (f.eks., 5% difenyl, 95% dimetylpolysiloksan). Program GC med helium bæregass strømnings innstilt på 1,5 ml / min, og ovnstemperaturen programmert fra 150 til 300 ° C ved 3 ° C / min.
  2. Bruk split injeksjon (split ratio 1:10) og sette massespektrometer til å skanne modusen over 40-600 amu (elektron innvirkning ionisering).
  3. Lag en sekvens bord løsningsmidler (blank), WT og mutante gjentak, hver bruker indikert cutin analysemetode.
  4. Load løsemiddelog prøverør på karusellen, tilsett heksan til sprøyte-skylling ampuller i autosampler om nødvendig, og starte sekvensen. Etter at sekvensen er fullført, total ion kromatogram spor er tilgjengelige for alle prøver.

5. Data Analysis

  1. Identifisere lipid polyester monomerer ved å sammenligne hver topp masse spektrum for å offentligmassespektra eller ved å søke en kommersiell bibliotek hvis tilgjengelig.
  2. For hver identifisert topp i den totale ionestrøm kromatogrammet, bruke sine respektive retensjonstidene å finne de områdene på integreringsresultater tabellen fra GC / MS-programvare (Opplysning figur 1).
  3. For hver monomer (kolonner AB), tilsett arealverdier som finnes i integreringen tabellen (Opplysning Figur 1, kolonne D) til tilsvarende kolonnen for hver replikere prøve i Excel-tabellen av monomerer (Opplysning Fil 2, søyler CF), som er et regneark for å kvantifisere Arabidopsiscutin TMSI derivater. Bruk Opplysning Fil 3 hvis acetylerte derivater er forberedt i stedet.
  4. Tilsett områdene av de interne standarder (IS) til IS-kolonner (HK). For de monomerer som ikke er derivatisert, nemlig fettsyremetylestere (fames), og dikarboksylsyre dimetylestere (DCA DMEs) ved å bruke 17: 0 FAME (IS1) som IS for kvantifisering (purpur-fargede celler i monomeren tabellen; Opplysning filer 2/3). For hydroksylerte monomerer, inkludert primære alkoholer, ferulsyre og ω-hydroxy syrer, bruker 15: 0 15-hydroxy FAME (IS2) som er av valget for sammensatte kvantifisering (grønn-shadded celler i monomer bordet; Opplysning filer 2/3) .
  5. Legg tørre blad vekten for hver replikere til kolonner AX-BA (Opplysning Fil 2) eller AQ-AT (Opplysning Fil 3); alternativt, skann bladene til å beregne areal og legge arealverdier til monomer bordet for å uttrykke monomerenhetene belastninger per enhetflateareal.

Representative Results

Protokollen er beskrevet i dette manuskriptet er satt opp til å bestemme lipid polyester monomerer, minimere bidrag fra ikke-cutin lipider 10 Figur 1 viser en oversikt av analysen, som til sammen tar mellom 8 (dvs. cutin eller suberin.) -. 10 dager (fra innledende vev fangst til innhenting GC data), avhengig av hvor lenge prøvene er lov til å tørke.

Den valgte basekatalysert metanolyse (figur 2) metoden for å depolymerisere polyestere ble tidligere validert for Arabidopsis frø, som inneholder både cutin og suberin. Vev er første homogenisert og grundig delipidert å fjerne løsemiddel utvinnbare lipider. Residuet utbytte etter ekstraksjon, som prosent av opprinnelig ferskvekt, er vanligvis 6% for A. thaliana Col-0 blader. Cellevegg-anrikede rester er tørket i en vakuum-desikator og deretter depolymerisert inn beskaffenhet metyl ester-monomerer avbasekatalysert transmethyleringsreaksjoner. To timers inkubasjon ble valgt som den kritiske tid som er nødvendig for riktig depolymerisering og gjenvinning av lipid polyesterkomponenter. Lengre inkuberingstider resulterte i økning av 2-hydroxy-syrer; disse potensielt komme fra membran sphingolipids 10.

Et typisk kromatogram hvis Arabidopsis vill type blad cutin er vist i figur 3, for O -TMSi eterderivater (figur 3A) og O-acetyl derivater (figur 3B). Hver topp ble identifisert ved sammenligning med massespektra fra litteraturen 7,8 og en offentlig database 12 .Our video-protokollen viser hvordan man skal fremstille TMSI derivater, men prøver kan alternativt være acetyleres for å derivatisere hydroksylgrupper. Silylerte derivater er bra for identifikasjonsformål fordi de gir diagnostisk massespektra. Imidlertid acetylerte derivater er mer stabile og et godt alternativ til silyleringgang monomerer er identifisert 10. For å gjennomføre denne protokollen i laboratorier som bare har GC koplet til flammeioniseringsdetektor (FID), GC / FID traser tilsvarende acetylerte derivater av WT blad cutin monomerer, og til en homolog serie av fettsyremetylester standarder er også vist (Opplysning figur 4).

Denne metoden er kvalitativ og oppdager kvantitative forskjeller mellom prøver, derav sin valuta for mutant analyse. Mengdene av de enkelte monomerer bestemmes ved anvendelse av den interne standard metode for kvantifisering, slik at sammenligninger av monomer overflod mellom prøver. Det bør gjøres klart, imidlertid, at toppstørrelse (totalt ion tellinger) ikke kan gjenspeile de molare forhold av monomerene i polyesteren. Vi er blant annet redigerbare tabeller av monomerer å beregne monomerenhetene beløp i Arabidopsis blad cutin som Fettsyremetylesterne og TMSI derivater (Opplysning File 1), eller ess Tyl derivater (Opplysning Fil 2) av alkoholer. Disse tabeller kan måtte tilpasses hvis prøven er hentet fra forskjellige organer eller plantearter.

Som et eksempel har vi analysert Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0) villtype blader og to tidligere karakteriserte null-mutant alleler av CYP86A2 / ATT1 genet, att1-1 (m-1) og att1-2 (m-2 ) 13,14. P450 monooxygenases av CYP86A familien kode antatte co-oxydases og delta i suberin og cutin monomer biosyntese. Våre resultater (figur 4) viser betydelige reduksjoner i de massevis av tre store lipid monomerer i mutant bladene i forhold til WT blader. I samsvar med den forutsagte enzymets funksjon, 16: 0, 18: 2 og 18: 1 dikarboksylater ble spesifikt påvirket i att1 mutanter.

"Src =" / filer / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg "/>
Figur 1. Oversikt over lipid polyester analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Mekanisme i NaOMe-katalyserte reaksjon transmethyleringsreaksjoner. De nukleofile anioner methoxide angripe cabonyl karbon av lipid polyestere for å danne en ustabil tetraedriske mellomprodukt (A), som lett dissosierer til fettsyremetylestere og alkoksyd-anioner (B). Disse konjugerte baser er alkoksyder, og reagerer med metanol, regenerering av de katalytisk aktive methoxide anioner, for derved å opprettholde ytterligere depolymeriseringsprosesser reaksjoner (C). Dersom vann er til stede isystemet, vil det reagere med natriummethoxyd under dannelse av natriumhydroksyd, en sterk base som irreversibelt hydrolyserer estere for fremstilling av uønskede frie fettsyrer. Metylacetatet legges til som en koløsningsmiddel 15 for å fjerne små mengder av natriumhydroksid i systemet (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representant total ion kromatogram av villtype Arabidopsis thaliana blad cutin monomerer. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) eter og (B) acetat hydroksyl derivater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. cutin monomerblanding av Arabidopsis thaliana WT og to null mutante alleler av genet CYP86A2. (Mutant-1 = att1-1; mutant-2 = att1-2) Feilstolper representerer standardavviket for middelverdien (n = 4) . Tilpasset fra 13, med tillatelse fra © Blackwell Publishing (2007). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Opplysning Figur 1. Peak integreringsresultater bord fra GC / MS-programvare. Peaks tilsvarer identifiserte monomerer og interne standarder er identifisert av sin retenti på tid (kolonne C) og arealverdier er oppført i kolonne D. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 2
Opplysning File 2. Fortegn Arabidopsis cutin monomerer (trimetylsilyleter derivater av hydroxy fettsyremetylestre). Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 3
Opplysning File 3. Tabell over Arabidopsis cutin monomerer (O-acetyl derivater av hydroxy fettsyremetylestre).com / filer / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 4
Opplysning Figur 4. GC / FID spor (AB) fettsyremetylester (FAME) etensjonsindeksen standarder (toppene er merket med hvert mettet FAME kjedelengde); og (C) acetylert A. thaliana WT blad cutin monomerer. Tallene på topp tilsvare: 16: 0 FAME (1), ferulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 Slike fettsyremetylestere (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dikarboksylsyre dimetylester; FAME: fettsyremetylester; IS1: intern standard 1, 17: 0 FAME; IS2: intern stAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I motsetning til andre biopolymerer, slik som DNA og proteiner, er anlegget lipid polyestere som ikke er laget av en mal. I stedet, deres sammensetninger avhenger av spesifisiteten av de enzymer som er tilstede i vev som gjør disse ekstracellulære polymerer. Som sådan, kjemiske analyser av de bærende komponenter er viktig å forstå polyester lipid sammensetning.

Kjemiske metoder for å spalte esterbindinger omfatter forsåpning, hydrogenolyse, syrekatalysert transmethyleringsreaksjoner, og basekatalysert transmethyleringsreaksjoner 2. Hvert av dem har fordeler og ulemper. Forsåpning produserer frie fettsyrer hydroxy syrer som kan gjennomgå sekundære reaksjoner. Hydrogenolyse med litiumaluminiumhydrid (LiAlH4) 16 har blitt brukt for analyse cutin 7. Hydrogenolysen reduserer funksjon karboner til alkoholer og de ​​opprinnelige strukturene må utledes av deuteriolysis med litium aluminium deuteride (LiAlD 4). DeUlempen ved denne tilnærmingen er kravet om høy oppløsning GC / MS for å sammenligne graden av deuteriation av fett polyoler som oppnås for å gi oppdrag av deres strukturer. Syre-katalysert transforestring med metanolisk bortrifluorid (BF 3) er blitt hyppig brukt i cutin og suberin depolymerizations 8,17,18, men reagenset har en begrenset holdbarhet og kan innføre artefakter som skyldes sidereaksjoner 15. Metanolisk svovelsyre gir også metylesterne av monomerene, men med større andeler av 2-hydroksy-fettsyrer, som antagelig ikke er sanne lipid polyesterkomponenter, sammenlignet med andre metoder 10.

Den NaOMe-katalyserte transforestringsmetoden som er beskrevet i denne protokollen produserer fettsyremetylestere som er derivatisert ved silylering av hydroksylgrupper, som gir karakteristiske massespektra for identifikasjon, eller ved acetylering for å gi mer stabile derivater av hydroksylgrupper for kvantifisering. En ulempe med denne teknikken er at hydrolyse konkurrerer med transforestring når vann er til stede i reaksjonen. Vann reagerer med NaOMe (katalysatoren) og produserer NaOH, noe som i sin tur hydrolyserer fettsyremetylestere under dannelse av frie syrer (figur 2D). Dette er en uønsket sidereaksjon fordi to topper vil være til stede for hver fettsyre: en metylester og en TMSI esterderivat, og dermed kompliserer analyse. Ved hjelp av vannfrie reagenser og tilsetning av metylacetat som et ko-oppløsningsmiddel for å konkurrere med forsåpning er således avgjørende skritt for å hindre hydrolyse (figur 2D).

Cutin og suberin inneholde mellom 1 og 26% glyserol fire. Men dette vil monomer ikke bli oppdaget av de eksperimentelle betingelsene beskrevet i denne protokollen. Glycerol er meget hydrofilt, og, i motsetning til de fettsyremetylester monomerer, vil bli eliminert i løpet av de vandige løsningsmiddel-vasketrinn. Denne begrensningen også engjelder særlig rn fr til andre cutin depolymeriseringsprosesser metoder, men glycerol kan bli bestemt i den vandige fase som oppnås etter transforestring ved anvendelse av en enzymatisk metode. Alternativt kan den kvantifiseres ved hjelp av mildere betingelser (f.eks., 0,05 M NaOMe) uten ytterligere vannekstraksjon for å detektere alle monomerer, inkludert glycerol 19,20 .Selv anvendelige for formålet med glycerol kvantifisering, milde betingelser vanligvis gi ufullstendig depolymerisering av cutin og suberin.

Hvis en GC koplet til en flammeioniseringsdetektor (FID) er tilgjengelig, kan alle replikater bli analysert i dette instrument for kvantitative formål, etter at toppene av en representativ prøve er blitt identifisert ved hjelp av GC / MS. Alternativt kan monomerer i GC / FID spor bli identifisert hvis deres oppbevaring indeksene er kjent. Den flammeioniseringsdetektor har spesielt høy følsomhet og et bredt spekter av forholdsmessighet, som er avgjørende for kvantifisering av større og mindre prøvekomponenteri enkle løyper. I tillegg er det robust og lett å vedlikeholde og drive 15.

Den beskrevne protokoll tillater pålitelig og reproduserbar isolering, identifisering og kvantifisering av plante lipid polyester monomerer, slik at den kjemiske karakterisering av mutanter som avviker i blandingen ifølge ett eller flere lipid-polyester monomerer. Prosedyren er skalerbar, det kan enkelt tilpasses til å behandle både små og bulk mengder av ulike plantematerialer, inkludert røtter, frø, blader, stengler og blomster. Massespektraldata av lipid polyester monomerer fra mange arter har blitt publisert f.eks., 21-26 og utgjør verdifulle ressurser for å identifisere ukjente monomerer når tilpasse denne protokollen til andre vev og / eller arter. Denne metoden gjelder for undersøkelser av biosyntese, regulering og distribusjon av lipid polyestere i høyere planter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2-propanol Fisher Scientific BPA451-4 Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate Fisher Scientific S421500
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102 Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) Sigma-Aldrich 15222 Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT) Sigma-Aldrich 101162 Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous Fisher Scientific C614-3 Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) Acros Organics 219090020 Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane) Fisher Scientific C6074 Organic solvent
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401212 Acidification agent
Helium carrier gas, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1046 Carrier gas, GC/MS
Heptane Fisher Scientific H3501 Organic solvent
Hexanes Fisher Scientific H3024 Organic solvent
Methanol Fisher Scientific A4124 Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate Sigma-Aldrich 296996 Organic solvent
Methyl heptadecanoate Sigma-Aldrich H4515 Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane) Fisher Scientific D374 Organic solvent
Nitrogen, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1044 Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone Fluka 76530 Internal standard (1 mg/ml stock)
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 Co-solvent for derivatization
Sodium chloride Fisher Scientific BP358212 Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%) Sigma-Aldrich 156256 Nucleophile
Toluene FIsher Scientific T2904 Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX Premier Tech Horticulture Ltd Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Purdue Methods for Arabidopsis Growth. 
PermaNest Humidity Dome  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-20125
GC vial caps National Scientific C400051A
GC vial microinserts National Scientific C4011631
GC vials National Scientific C40001
Disposable pasteur pipets Fisher Scientific 1367820B
Flasks Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge Beckman Coulter
Analytic balance Fisher Scientific
Belly dancer A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column J&W Scientific, CA, USA;  30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer Thermo Scientific
Heat block Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph Thermo Scientific
Two-stage regulator Air Liquide Q1-318B-580
Vacuum desiccator Fisher Scientific
Vortex mixer Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolattukudy, P. Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science. 208, (4447), 990-1000 (1980).
  2. Kolattukudy, P. E. Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).
  3. Yeats, T. H., Rose, J. K. C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol. 163, (1), 5-20 (2013).
  4. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends Plant Sci. 13, (5), 236-246 (2008).
  5. Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 15, (3), 329-337 (2012).
  6. Heredia, A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. Biophys. Acta. 1620, (1-3), 1-7 (2003).
  7. Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component. Plant J. 40, (6), 920-930 (2004).
  8. Franke, R., et al. Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin. Phytochemistry. 66, (22), 2643-2658 (2005).
  9. Vogg, G., et al. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55, (401), 1401-1410 (2004).
  10. Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds. Phytochemistry. 67, (23), 2597-2610 (2006).
  11. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
  12. Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. LipidHome. Available from: http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html (2015).
  13. Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant J. 53, (3), 437-449 (2008).
  14. Xiao, F., et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23, (14), 2903-2913 (2004).
  15. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446 (2010).
  16. Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry. Biochemistry. 11, (10), 1885-1896 (1972).
  17. Matzke, K., Riederer, M. A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L. Planta. 185, (2), 233-245 (1991).
  18. Riederer, M., Schönherr, J. Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin. J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).
  19. Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis. Plant Physiol. 119, (3), 1137-1146 (1999).
  20. Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry. 61, (2), 205-215 (2002).
  21. Eglinton, G., Hunneman, D. H. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle. Phytochemistry. 7, (2), 313-322 (1968).
  22. Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. 9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin. Chem. Phys. Lipids. 32, (1), 13-26 (1983).
  23. Holloway, P. J. Intracuticular lipids of spinach leaves. Phytochemistry. 13, (10), 2201-2207 (1974).
  24. Holloway, P. J., Deas, A. H. B. Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins. Phytochemistry. 12, (7), 1721-1735 (1973).
  25. Holloway, P. J. The chemical constitution of plant cutins. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. Academic Press. London. 45-85 (1982).
  26. Croteau, R., Fagerson, I. S. The constituent cutin acids of cranberry cuticle. Phytochemistry. 11, (1), 353-363 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics