والسكتة الدماغية تنوعا فأري موديل تحت القشرية الأبيض المسألة لدراسة محور عصبي تنكس والأبيض المواد بيولوجيا الأعصاب

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

السكتة الدماغية تؤثر على حسابات المادة البيضاء لمدة تصل إلى 25٪ من العروض السكتة الدماغية السريرية، ويحدث بصمت بمعدلات قد تكون أكبر 5-10 أضعاف، ويساهم بشكل كبير في تطوير الخرف الوعائي. نماذج قليلة من التنسيق السكتة الدماغية المادة البيضاء موجودة وهذا النقص في نماذج مناسبة أعاق فهم الآليات neurobiologic العاملة في مجال الاستجابة الإصابة وإصلاح بعد هذا النوع من السكتة الدماغية. القيد الرئيسي من نماذج السكتة الدماغية تحت القشرية الأخرى هو أنها لا تقيد الوزراء البريطانى واحتشاء إلى المادة البيضاء أو تم التحقق من صحتها في المقام الأول في الأنواع غير الفئران. وهذا يحد من القدرة على تطبيق مجموعة واسعة من الأدوات البحثية الفئران لدراسة بيولوجيا الأعصاب من السكتة الدماغية المادة البيضاء. هنا نقدم منهجية لإنتاج موثوق من السكتة الدماغية التنسيق في المادة البيضاء الفئران باستخدام حقن المحلي لالمانع أنوش لا رجعة فيه. نقدم أيضا العديد من الاختلافات على بروتوكول عام من بينهم اثنان من اللمسي فريدة من نوعهاالاختلافات، وتتبع الوراء العصبية، فضلا عن وضع العلامات الأنسجة الطازجة وتشريح تزيد كثيرا من التطبيقات المحتملة لهذه التقنية. هذه الاختلافات تسمح للمناهج متعددة لتحليل الآثار neurobiologic من هذا النوع الشائع ودراسة سلوكه من السكتة الدماغية.

Protocol

وقد تم تنفيذ استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

ملاحظة: تبدأ من خلال تحديد الهدف السكان الفئران. وفي دراسات سابقة، وقد استخدمت فقط الذكور من النوع البري C57 / BL6 الفئران، ولكن العديد من الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب يمكن أن تستخدم أيضا. لاحظ أن الإحداثيات المجسم تقوم على C57 / BL6 التشريح. فمن المستحسن أن كل مستخدم التحقق في البداية توطين السكتة الدماغية إلى المادة البيضاء.

1. الأبيض المواد السكتة الدماغية التعريفي - الإنسي نهج بزاوية

  1. البدء بإعداد ماصة الزجاج سحبت باستخدام 0.5 ملم الأنابيب الشعرية بحيث قطر البعيدة ما بين 15-25 ميكرون 11.
  2. إعداد العقيمة قسامة 10 ميكرولتر من L-بظاهرة (N (5) - (1) -iminoethyl-L-الأورنيثين حمض الهيدروكلوريك) في 27.4 ملغ / مل (130 ميكرومتر) في العقيمة ملحي 0.9٪.
  3. قبل ملء ماصة الزجاج انسحبتمع كمية صغيرة من L-بظاهرة (2-5 ميكرولتر) عن طريق لصق ماصة الزجاج لأنابيب متصلة خط فراغ. وضع شقة ماصة على أعلى مقاعد البدلاء، وإدراج نهاية سحبت في حل L NIO.
    1. تطبيق فراغ حتى يمتلئ لا يقل عن 2 ملم من الجزء 0.5 ملم من ماصة. إيقاف الفراغ وسحب ماصة. وضعه جانبا حتى الخطوة 1.12.
  4. ضع الماوس في غرفة تحريض وتحفيز التخدير من الفأرة باستخدام معيار 32٪ الأيزوفلورين تدفقت من خلال المرذاذ (5 L / استنشاق دقيقة مع 5 لتر أكسجين / دقيقة و 0.5 لتر / دقيقة N 2) لمدة 1 دقيقة أو حتى anesthesized بعمق. نقل الماوس لجهاز المجسم مجهزة المجهر المجسم. توفير التخدير الصيانة باستخدام 32٪ الأيزوفلورين تدفقت من خلال المرذاذ (2 L / استنشاق دقيقة مع 5 لتر أكسجين / دقيقة و 0.5 لتر / دقيقة N 2) ومخروط الأنف. تحقق عمق التخدير مع قرصة أخمص قدميه.
  5. ضبط الذراع حقن إلى 36 درجة.
  6. افىسحبت XA الزجاج حامل ماصة للنهاية البعيدة للنظام حقن الضغط المنخفض حجم وإرفاقه الذراع حقن الإعداد المجسم.
  7. معطف شعيرات تخدير الحيوان مع الفازلين ومكان الاصطناعي مرهم المسيل للدموع على كلتا العينين. إعداد الجراحي الميداني معقمة عن طريق وضع ثنى العقيمة على رأس الحيوان مع افتتاح 5-10 سم على رأسه. إعداد سطح الجراحية aspetic عن طريق حلق الفراء المغطي الجمجمة. تنظيف فروة الرأس بالتناوب مع betadine و 70٪ مسحات الكحول.
  8. جعل 1.5 سم خط الوسط فروة الرأس شق مع مقص غرامة معقمة لفضح سطح الجمجمة. تجفيف الجمجمة مع مسحة القطن المعقم واستخدام المجهر المجسم في 1-3X التكبير، وإزالة أي نوع من الأنسجة السمحاق المغطي باستخدام أداة نقطة متناهية الصغر معقمة.
  9. بمناسبة Bregma كنقطة مرجعية باستخدام علامة غرامة نقطة.
  10. حفر حج القحف ellipitical 2 مم باستخدام معقم جيد ستيب الجراحية مثقاب0؛ ابتداء من الخلف في Bregma وتوسيع الأمامية غادر لتوه من خط الوسط. إزالة شظايا العظام والأنسجة اللينة التي تغمر بحيث يمكن تصور القشرة المخية.
  11. الحفاظ على الجراحي الميداني والسطح القشري رطبة عن طريق تطبيق بشكل متقطع قطرات من محلول ملحي معقم.
  12. يلصق ماصة الزجاج انسحبت إلى الذراع حاقن لجهاز المجسم. محاذاة نهاية البعيدة للماصة مع Bregma والصفر الإحداثيات المجسم.
  13. دفع ماصة للالأمامية الأولى / الخلفي (A / P) وسطي / الوحشي (M / L) الإحداثيات الواردة في الجدول 1.
  14. دفع ماصة إلى السطح القشري والصفر ظهري / بطني (D / V) القياس.
  15. ببطء تمرير ماصة في الدماغ حتى تصل إلى D الأول / V التنسيق في الجدول 1.
  16. باستخدام انخفاض حجم نظام حقن ضغط وضعت في 20 رطل لمدة 20 نبضة ميللي ثانية، وضخ 100 نيكولا لانغ من L-النينيو في الدماغ والانتظار 5 دقائق لمنع ارتداديصل المسار ماصة.
    1. استخدام الشبيكة معايرة في العدسة من المجهر المجسم والتكبير من 3X.
    2. وفقا لذلك، تهجير ما مجموعه 0.100 مم 3 (طول 0.5 مم في القطر ماصة 0.5 ملم، أي ما يعادل 100 نيكولا لانغ) من ماصة الزجاج انسحبت لكل مجموعة من الإحداثيات. باستخدام شبيكة الشعر، وقياس ومعايرة منذ تعيين كل ما يصل يختلف اعتمادا على التكبير والمقاييس المستخدمة.
    3. لقياس حجم دقيقة خلال كل حقنة، الاقتراب من ماصة الزاوية مع المجهر من الجانب بحيث الغضروف المفصلي-السوائل الهواء وجهة نظر سهمي. يجب أن تظهر في الغضروف المفصلي في الطائرة الاتصال نفسه كل من الجدار الداخلي والخارجي للماصة.
  17. سحب ببطء ماصة وكرر الخطوات من 1.13-1.16.3 في المجموعة الثانية والثالثة من الإحداثيات الواردة في الجدول 1.
  18. بعد الحقن النهائي، وإزالة ماصة ووضع ما يكفي من الشمع العظام لملء موقع حج القحف. اpproximate حواف الجرح فروة الرأس وربط بمادة لاصقة الجلد.
  19. ضخ 0.1 مل من 0.5٪ Marcaine في الهوامش الجرح باستخدام معقم 30 G إبرة لمنع لمنع الألم المحلية المرتبطة شق فروة الرأس.
  20. عودة الحيوان في السكن والعرض المضادات الحيوية بعد العملية (0.48 ملغ / مل ميثوبريم-سلفاميثوكسازول، أو 0.5 ملغ / مل الليفوفلوكساسين) في مياه الشرب لمدة 5 أيام.

2. أبيض المواد السكتة الدماغية التعريفي - الخلفي نهج بزاوية

  1. تنفيذ الخطوات 1،1-1،12 كما هو الحال في وسطي بروتوكول نهج الزاوية، باستثناء ضبط الذراع حقن الإعداد المجسم الى 45 درجة الموجه الأمامي إلى الخلفي.
  2. دفع ماصة لأول A / P و M / L الإحداثيات الواردة في الجدول 2.
  3. الخطوات المتبقية كاملة 1،14-1،20 كما هو الحال في جانبي بروتوكول نهج الزاوية.

3. الوراء العصبية وصفها

  1. إعداد عقيمة 10قسامة ميكرولتر من L-النينيو في 54.8 ملغ / مل في محلول ملحي 0.9٪.
  2. إعداد قسامة معقمة من 20٪ Fluororuby (أو 20٪ أمين ديكستران المعقدة البيروكسيديز أو 2٪ Fluorogold) في محلول ملحي 0.9٪.
  3. تمييع معا 1: 1 لتركيزات النهائي من 27.4 ملغ / مل L-بظاهرة و 10٪ Fluororuby.
  4. أداء بروتوكول السكتة الدماغية على النحو الوارد أعلاه في خطوات 1،3-1،23.
  5. تصور التتبع الفلورسنت أصلا في قسم الأنسجة عن طريق تثبيت نضح، cryosectioning والفحص المجهري كما هو موضح سابقا 8.

4. معالجة الأنسجة لالمناعي

  1. في الفترة الفاصلة ما بعد السكتة الدماغية المناسب تتراوح بين 3 ساعة إلى 14 يوما بعد السكتة الدماغية، والموت ببطء وافقت الفئران عن طريق جرعة زائدة الأيزوفلورين أو IACUC المحلي الداخلي.
  2. فتح التجويف الصدري باستخدام مقص الزاوية وإدراج 23 G فراشة الإبرة في البطين الأيسر.
  3. وضع قطع صغيرة في الأذين الأيمن باستخدام مقص غرامة للسماح مسار تدفق للسائل الإرواء.
  4. يروي Transcardially مع 30-40 مل من الباردة المالحة الفوسفات مخزنة تليها 30-40 مل من البرد 4٪ امتصاص العرق بمعدل 10 مل / دقيقة في RT.
  5. قطع رأس الماوس وإزالة المخ باستخدام مقص العقيمة لفتح الجمجمة من الخلف ثم إزالة بلطف الجمجمة المغطي مع ملعقة، وضع الدماغ في الباردة PFA 4٪ لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لمدة 48 ساعة .
  6. إعداد أربعين أقسام ميكرون العائمة باستخدام ناظم البرد وتنفيذ معالجة الأجسام المضادة كما هو موضح سابقا 6-8. في هذه الدراسة، استخدم الأجسام المضادة التالية: أرنب المضادة للخيط عصبي 200 (1: 500 تمييع). أرنب مكافحة فيمنتين (1: 500)؛ الماعز مكافحة GFAP (1: 500)؛ أرنب مكافحة إيبا-1 (1: 1000).

5. معالجة الأنسجة للبروتين أو تحليل الحمض النووي الريبي

  1. في الفترة الفاصلة ما بعد السكتة الدماغية المناسب تتراوح بين 3 ساعة إلى 14 يوما بعد السكتة الدماغية، والموت ببطء عبر جرعة زائدة الأيزوفلورين أو وافق IACUC المحلي الداخلي.
  2. قطع رأسالماوس وإزالة المخ باستخدام مقص العقيمة لفتح الجمجمة من الخلف ثم إزالة بلطف الجمجمة المغطي مع ملعقة.
  3. إدراج معقمة 4 مم ملعقة في الجزء الأمامي من الدماغ لقطع البصلة الشمية والأعصاب البصرية. رفع بلطف الدماغ من القبة ومكان في المخزن تشريح المثلج (1X هانك المتوازن محلول الملح، 25 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.4، 35 ملي الجلوكوز، 4 ملي بيكربونات الصوديوم، و 0.01 ملغ / مل cyclohexamide).
  4. باستخدام كتلة الدماغ ومعقمة شفرات الحلاقة الجديدة، وإعداد 2-3 ألواح ملم تحتوي على السكتة الدماغية والمكان إلى عازلة تشريح الباردة.
  5. تحت المجهر تشريح، وتحديد مسألة القشرة الحركية الأساسية البيضاء في نصف الكرة حقن. على فترات أطول بعد السكتة الدماغية، والمنطقة قد تكون بصريا التي حددها تنخر وشحوب المايلين.
    ملاحظة: في فترات سابقة بعد السكتة الدماغية، حقن L-بظاهرة مختلطة مع 1 ميكرولتر من 10٪ يمكن سريع الأخضر يمكن التعرف البصري من السكتة الدماغية (
  6. تحت إشراف المجهر تشريح وباستخدام مشرط جديد، تشريح بعناية المنطقة من المادة البيضاء التي تحتوي على السكتة الدماغية، حدد إما عن طريق وضع العلامات الأخضر السريع أو فقدان الأنسجة. إزالة القشرة الفوقية والمخطط الأساسي كما تريد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام النموذج المقدم، والمادة البيضاء forelimb الأساسي الحسية القشرة يمكن ان يعول عليه تكون مستهدفة. هذا النموذج السكتة الدماغية التي يسببها كيميائيا ينتج محور عصبي بؤري وفقدان المايلين، كثرة الخلايا النجمية، وكثرة الدبيقيات (الشكل 1)، وعادة ما ينظر إليها في عوائق الجوبي الإنسان. باستخدام ثلاث حقن، يتم تأسيس نموذجا مفيدا سريريا مع انخفاض في وقت مبكر على مهام forelimb السيارات 7 و جزء صغير لكنه مهم من التجارب أنسجة المخ نقص التروية التي المناعى، مناعي، والكيمياء الحيوية التقنيات الممكنة والموثوق بها على مستوى الكمي. في نقطة زمنية في وقت مبكر (ساعة) بعد تحريض السكتة الدماغية، والتغيرات في المؤسسة الجزيئية محور عصبي يمكن الكشف عن (الشكل 2). في 7 أيام، والسكتة الدماغية اكتمال النضج لمنطقة محددة من فقدان محور عصبي (الشكل 1A). في أيدينا، وتنتج هذه الطريقة في التنسيق الأبيض مسألة الآفة approximately 800 ميكرون في القطر الأفقي وتمتد حوالي 1 ملم على طول المحور الأمامي الخلفي من الجسم الثفني. قبل 7 أيام، وإجمالي متوسط ​​حجم احتشاء هو ما يقرب من 0.200 ملم 3 وسوف يكون لها شكل بيضاوي الشكل. وقد لاحظنا التباين ما يقرب من 10٪ في حجم السكتة الدماغية على حد سواء بين الحيوانات وبين القطاعات، التي تعتمد على مكان في القطع الناقص يحدث هذا الباب. ونادرا ما ينظر إلى مزيد من النمو في حجم احتشاء بعد 7 أيام.

إضافة لحقن وقت واحد من النتائج أمين ديكستران في وضع العلامات العصبية كبير في طبقة 5 و 6 طبقة أجسام الخلايا العصبية التي لديها المحاور إسقاط من خلال المنطقة من السكتة الدماغية (الشكل 3). العصبونات القشرية الفوقية التي لم يتم تضررت من الجوانب زيف الداخلي (مرور إبرة دقيقة)، يخضع الضرر المحاور البعيدة ويمكن التعرف من خلال إدراج التتبع بإعداد-L NIO. وكان هذا النهج استخدام د لإظهار التغيرات الديناميكية في القطاع الأولي محور عصبي بعد السكتة الدماغية 8.

في حين أن صغر حجم المنطقة من الأنسجة المتضررة من السكتة الدماغية يحد من استخدام التقنيات الشائعة الأخرى مثل 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تلطيخ، ويمكن تحديد المنطقة السكتة الدماغية المادة البيضاء في أنسجة جديدة. إضافة صبغة المشترك مثل الأخضر السريع وتنتج منطقة تحديدها من الأنسجة التي يمكن تشريح تشريح تحت المجهر (الشكل 4). مرة واحدة تشريح هذه الأنسجة يمكن أن تستخدم لتحليل البروتين مع وصمة عار الغربية أو مناعي، أو لعزل الحمض النووي الريبي والتحليل (الشكل 4C). من خلال استخدام مختلف خطوط الماوس المعدلة وراثيا، ومجموعة متنوعة من الأساليب المبتكرة يمكن استخدامها لدراسة بيولوجيا الأعصاب بعد التنسيق السكتة الدماغية المادة البيضاء بما في ذلك دراسات الخرائط مصير الخلايا وتسليخ مجهري القبض على الليزر (الشكل 4C).

خيمة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 1
يوضح التنسيق الأبيض المواد السكتة الدماغية عن طريق كل من الإنسي والخلفي النهج بزاوية وضع العلامات مناعي لneurofilaments (A، أحمر) درجة فقدان محور عصبي بعد سبعة أيام السكتة الدماغية باستخدام نهج وسطي: الشكل 1. باستخدام نهج الزاوية الخلفية، والتي تستهدف البيضاء آفة السكتة الدماغية الأمر فقط فوق البطين الجانبي (B، C) ويظهر دبيقي الشديد (ب) للتفاعل نجمي الخلايا (C). اثنين نجمية علامات المتوسطة خيوط، فيمنتين (الحمراء)، وييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP والأخضر)، وكلاهما تكشف عن تغييرات في التشكل من المادة البيضاء النجمية (ليفي) بعد السكتة الدماغية (C). على نطاق والحانات = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدارسيون من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الأبيض المواد السكتة الدماغية يعدل محور عصبي منظمة Microdomain في غضون 3 ساعة الأبيض مسألة الاستقراء السكتة الدماغية، وتنظيم microdomain محور عصبي في عقدة، تميزت إسبكترن بيتا-IV (الحمراء)، وفي paranode، تميزت البروتين المرتبط contactin (caspr، الخضراء)، وتعطلت (الأسهم، B). تظهر المقابل محاور المادة البيضاء العقدي منتظم، paranodal، وتنظيم juxtaparanodal (A و C)، في حين تظهر المادة البيضاء المماثل استطالة العقدي وparanodal التي هي نموذجية من المحاور مع اتصال axoglial خسر (B و D). شريط مقياس = 5 ميكرون.

الشكل (3)
الشكل (3): إلى الوراء العصبية Labelinز مع الأبيض المواد السكتة الدماغية يحدد الفرد الخلايا العصبية مع الأضرار المحاور. المشارك حقن أمين ديكستران الفلورسنت (الحمراء) في وقت تحريض السكتة الدماغية يسمح تحديد الخلايا العصبية الفردية مع محاور أصيب بجلطة. يحدث معظم العلامات في محاور داخل طبقة 5 و 6 الخلايا العصبية في القشور الحسية الأولية التي تغمر السكتة الدماغية. تمثل صورة 7 أيام بعد السكتة الدماغية. مقياس شريط = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: تسليخ مجهري من الآفات السكتة الدماغية الأبيض المواد للاستخدام في الكيمياء الحيوية والترانسكربتي فحوصات المشارك حقن الأخضر السريع في وقت تحريض السكتة الدماغية يسمح الكشف المبكر عن المنطقة الجرحى في 24 ساعة (A، لوحة العليا). Immunoblottiنانوغرام للبروتينات محور عصبي محددة يمكن القيام بها لإثبات تخفيضات في المنطقة من السكتة الدماغية وحدها (A، اللوحة السفلى). في نقطة زمنية أطول، ومنطقة السكتة الدماغية المادة البيضاء (اللوحة اليسرى) ويمكن تشريح الوزراء البريطانى دون وضع العلامات المحددة (B). وتظهر اللوحة العليا اليمنى المنطقة من المادة البيضاء بعد إزالة منطقة تشريح بينما تظهر لوحة اليمنى السفلى المنطقة تشريح من المادة البيضاء التي تحتوي على السكتة الدماغية (B). PCR لجينات دبقية قليلة التغصن محدد باستخدام الحمض النووي الريبي معزولة عن المناطق تشريح من المادة البيضاء (C). IL = المماثل. CL = الجانب المقابل. ج = السيطرة؛ الصورة = السكتة الدماغية.

حقنة الأمامي / الخلفي وسطي / الوحشي الظهرية / بطني
0.22 0.22 -2.10
2 0.70 0.15 -2.16
3 1.21 0.15 -2.18

الجدول 1: الاحداثيات المجسم لنهج بزاوية الجانبي (مم).

حقنة الأمامي / الخلفي وسطي / الوحشي الظهرية / بطني
-0.75 -0.96 -2.10
2 -1.00 -0.96 -2.05
3 -1.25 -0.96 -2.00

الجدول 2: الاحداثيات المجسم لالخلفي نهج بزاوية (مم).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وصف عدد من النماذج السابقة من السكتة الدماغية تحت القشرية بما في ذلك حقن محورية في endothelin-1 في الكبسولة الداخلية، المادة البيضاء تحت القشرية والمخطط في الفئران 12-14 والفأر 6،15. وقد استخدمت المزيد من النماذج الأخيرة من السكتات الدماغية التنسيق صغيرة الكولسترول حقن microemboli في الشريان السباتي 16 وانسداد photothrombotic من واحد اختراق شرين 17. كل من هذه النماذج على حد سواء مزايا وعيوب 5. النموذج الذي وصفها في الوقت الحاضر تنتج الآفة التي لديها عدد من الخصائص التي تحاكي احتشاء الجوبي البشري بما في ذلك شذوذ محور عصبي وفقدان وتدهور المايلين، نواة نخرية التنسيق وعجز السريرية التي هو الحد الأدنى ويدل على انتعاش سريع إلى حد ما يعتمد على عمر 7. تستهدف المادة البيضاء الفئران تسمح مجموعة متنوعة واسعة من التلاعب الجيني التي يمكن أن تدعم الدراسات الميكانيكية.

الحرجةوتشمل الخطوات للبروتوكول باستخدام إحداثيات المجسم دقيقة. لأن المادة البيضاء الفئران صغيرة الحجم وتختلف من سلالة إلى سلالة، قد تكون هناك حاجة إلى إعادة النظر في الإحداثيات المجسم حسب العمر والسلالة من الماوس المستخدمة. السيطرة على حجم حقن مهم أيضا لأن هذا يرتبط مباشرة إلى حجم احتشاء. سوف الحقن أكبر إنتاج السكتات الدماغية الكبيرة التي تتعدى على القشرة الفوقية والمخطط الأساسي.

تم الإبلاغ عن حقن البؤري للET-1 باستخدام النهج الموصوفة هنا ولكن تبين endothelin-1 أن يكون لها آثار نظير الصماوي مباشرة على التمايز دبقية قليلة التغصن ونضوج 10،18 يتيه دراسة ما بعد السكتة الدماغية البيولوجيا المادة البيضاء. في المقابل، فإن أهداف النهج-L بظاهرة الخلايا البطانية وحدها في حين تنتج آفة متطابقة ويزيل أي آثار نظير الصماوي التباس على الخلايا المشاركة في الاستجابة الاصابة. L-بظاهرة ليس السامة للخلايا مباشرة وSELECتم تحديد جرعة تيد من خلال التجارب جرعة التصعيد الأولية (لا تظهر البيانات). وقد تم تطوير هذا النهج الزاوية الخلفية إلى أكثر دقة محاور تنتقص من القشرة الحركية الأولية المنتجة العجز السلوكي القصوى التي يمكن أن تعزى إلى إصابات المادة البيضاء. النهج الزاوية وسطي أيضا الأضرار محاور القشرة الحركية ولكن يمتد أكثر إبداعا ويشمل المحاور الأساسية القشرة الحسية الأولية.

الآفة السكتة الدماغية تتوسع بسرعة كبيرة خلال أول 24 ساعة. قبل سبعة أيام، حجم احتشاء هو الحد الأقصى ونحن لم يلاحظ نمو آفة كبير وراء ذلك الوقت. سيحدث الأحداث الخلوية إضافية وانحطاط محور عصبي بعد هذه المرحلة الأولية إلا أن حجم احتشاء مقاسا الأساسية نخرية لم تتغير بشكل ملحوظ في غياب أي تدخل.

شارك في حقن استشفاف تشريحي عصبي في ذلك الوقت من السكتة الدماغية ويحدد الخلايا العصبية التي تعاني من إصابة محور عصبي الدماغية. باستخدام ميدالاتحاد العالمي للتعليم أو الخلفي نهج الزاوية، تبقى أجسام الخلايا العصبية مع التوقعات محور عصبي التالفة دون أن يصاب بأذى. وهذا يخلق نموذجا مفيدا لدراسة تأثير axotomy الدماغية على الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي. لقد استخدمت استشفاف الوراء في المقام الأول بما في ذلك أمين ديكستران وfluorogold، والتي على حد سواء تظهر امتصاص ممتازة من المحاور التي تضررت السكتة الدماغية. من خلال توظيف مجموعة واسعة من المعدلة وراثيا وخطوط الماوس خروج المغلوب، يمكن للمستخدمين من هذا البروتوكول التحقيق في دور معين من الجينات العصبية العاملة في مجال الاستجابة إصابة السكتة الدماغية المادة البيضاء والإصلاح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgements

تلقى SN وMDD بدعم من المعاهد الوطنية للصحة K08 NS083740 ووزارة جامعة كاليفورنيا لعلم الأعصاب. يعترف AJG الدعم من قبل الدكتورة مريم ومؤسسة شيلدون أديلسون زاي للبحوث الطبية ومؤسسة لاري ل Hillblom. KLN بامتنان بدعم من مركز السكتة الدماغية القلب الأمريكية رابطة 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ودعمت سوء، السلع والخدمات البيئية وشركة الاتصالات السعودية من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 NS071481. يعترف JDH بدعم من المعاهد الوطنية للصحة K08 NS083740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, 28-292 (2014).
  2. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43, 3102-3104 (2012).
  3. Koton, S., et al. Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry. Stroke. 44, 3293-3297 (2013).
  4. Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review. J Neurochem. 115, 814-828 (2010).
  5. Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. Models that matter: white matter stroke models. Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).
  6. Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates. J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).
  7. Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators. Stroke. 44, 2579-2586 (2013).
  8. Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke. Stroke. 44, 182-189 (2013).
  9. McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells. Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).
  10. Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development. J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).
  11. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. CSH prot. (2006).
  12. Hughes, P. M., et al. Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).
  13. Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses. Stroke. 36, 107-112 (2005).
  14. Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).
  15. Horie, N., et al. Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1. J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).
  16. Wang, M., et al. Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts. Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).
  17. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).
  18. Jung, K. J., et al. The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes. J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics