A Corsa Versatile Modello murino di Subcortical bianco Materia per lo Studio della assonale degenerazione e bianco Materia Neurobiologia

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Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

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Abstract

Ictus colpisce conti sostanza bianca fino al 25% delle presentazioni ictus cliniche, avviene automaticamente a velocità che possono essere 5-10 volte maggiore, e contribuiscono alla sviluppo di demenza vascolare. Pochi modelli di focale ictus sostanza bianca esistono e questa mancanza di modelli appropriati ha ostacolato la comprensione dei meccanismi coinvolti nella risposta neurobiologiche danno e la riparazione dopo questo tipo di ictus. La principale limitazione di altri modelli di ictus subcorticali è che essi non focally limitano l'infarto alla materia bianca o sono stati in primo luogo convalidato in specie non murini. Questo limita la capacità di applicare l'ampia varietà di strumenti di ricerca murini per studiare la neurobiologia di bianco ictus materia. Qui presentiamo una metodologia per la produzione affidabile di un ictus focale nella materia bianca murino utilizzando una iniezione locale di un inibitore irreversibile eNOS. Presentiamo anche diverse variazioni sul protocollo generale di cui due stereotassica unicovariazioni, retrograda tracing neuronale, nonché di etichettatura tessuto fresco e sezionamento che ampliare notevolmente le potenziali applicazioni di questa tecnica. Queste variazioni permettono di molteplici approcci per analizzare gli effetti neurobiologiche di questa forma comune e poco studiato di ictus.

Protocol

L'uso di animali in questo protocollo è stata eseguita in conformità con le procedure approvate dalla University of California Los Angeles cura degli animali e del Comitato Usa.

Nota: Iniziare identificando la popolazione murina bersaglio. In studi precedenti, wild-type topi C57 / BL6 solo di sesso maschile sono stati utilizzati, tuttavia diversi topi transgenici o knockout possono anche essere utilizzati. Si noti che le coordinate stereotassica sono basati su C57 / BL6 anatomia. Si raccomanda che ogni utente inizialmente verificare la localizzazione del tratto di materia bianca.

1. Bianco Materia fase di aspirazione - mediale Avvicinamento angolare

  1. Iniziare preparando una pipetta di vetro tirato utilizzando 0,5 millimetri capillare tale che il diametro distale è compreso tra 15-25 micron 11.
  2. Preparare una sterile 10 microlitri aliquota della L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27.4 mg / ml (130 micron) a 0,9% sterile fisiologica.
  3. Pre-riempire la pipetta di vetro tiratocon un piccolo volume di L-Nio (2-5 ml) apponendo la pipetta di vetro per tubo collegato ad una linea di vuoto. Posare il piatto pipetta sul banco e inserire l'estremità tirato nella soluzione L-Nio.
    1. Applicare il vuoto fino ad almeno 2 mm della porzione 0,5 millimetri della pipetta si riempie. Spegnere il vuoto e ritirare la pipetta. Mettere da parte fino al punto 1.12.
  4. Posizionare il mouse in una camera di induzione e indurre l'anestesia del mouse utilizzando standard di 32% isoflurano scorreva attraverso un vaporizzatore (5 L / min inalato con 5 L / min di ossigeno e 0,5 L / min N 2) per 1 min o fino a quando profondamente anesthesized. Trasferire il mouse per un apparato stereotassico dotato di un microscopio stereotassico. Fornire anestesia manutenzione utilizzando 32% isoflurano scorreva un vaporizzatore (2 L / min inalato con 5 L / min di ossigeno e 0,5 L / min N 2) ed un cono. Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico punta.
  5. Regolare il braccio di iniezione a 36 °.
  6. Affixa tirato titolare pipetta di vetro all'estremità distale di un sistema di iniezione a pressione basso volume e collegarlo al braccio iniezione della configurazione stereotassica.
  7. Coat baffi degli animali anestetizzati con vaselina e il luogo artificiale pomata di rottura sopra entrambi gli occhi. Preparare un campo chirurgico sterile, mettendo un telino sterile sopra la testa dell'animale con un 5-10 cm di apertura sopra la testa. Preparare una superficie chirurgica asettico dalla rasatura sovrastante il cranio. Pulire il cuoio capelluto con alternanza di betadine e il 70% tamponi con alcol.
  8. Fare un 1,5 centimetri incisione mediana del cuoio capelluto con le forbici sottili sterili per esporre la superficie del cranio. Asciugare il cranio con un tampone di cotone sterile e utilizzando un microscopio a stereotassica 1-3X ingrandimento, rimuovere qualsiasi tessuto periostale sovrastante utilizzando uno strumento sterile punto micro.
  9. Segnare il Bregma come punto di riferimento con un pennarello a punta fine.
  10. Praticare un 2 millimetri craniotomia ellipitical utilizzando una sterile multa stip punta da trapano chirurgico0; a partire posteriormente al Bregma e che estende anteriormente appena lasciato della linea mediana. Rimuovere frammenti ossei e sovrastante tessuto molle in modo che la corteccia cerebrale può essere visualizzato.
  11. Mantenere il campo chirurgico e la superficie corticale umida applicando intermittente gocce di soluzione salina sterile.
  12. Applicare una pipetta di vetro tirato al braccio dell'iniettore dell'apparato stereotassico. Allineare l'estremità distale della pipetta con il Bregma e zero le coordinate stereotassica.
  13. Avanzare la pipetta per la prima anteriore / posteriore (A / P) e mediale / laterale (M / L) coordinate fornite in Tabella 1.
  14. Avanzare la pipetta alla superficie corticale e zero dorsale / ventrale (/ V D) di misura.
  15. Lentamente passare la pipetta nel cervello fino a raggiungere la prima D / V di coordinate nella tabella 1.
  16. Utilizzando un sistema di iniezione a bassa pressione volume impostato a 20 psi per 20 impulsi msec, iniettare 100 nl di L-Nio nel cervello e attendere 5 minuti per evitare il reflussola pista pipetta.
    1. Utilizzare un reticolo calibrato in dell'oculare del microscopio stereotassica ed un ingrandimento di 3X.
    2. Pertanto, spostare un totale di 0.100 mm 3 (lunghezza 0,5 mM una pipetta 0,5 mm di diametro, corrispondente a 100 nl) dalla pipetta di vetro tirato per ogni insieme di coordinate. Utilizzando un reticolo, misurare e standardizzare poiché ogni set up varia a seconda dell'ingrandimento e scale utilizzato.
    3. Per la misurazione del volume precisa durante ogni iniezione, avvicinare la pipetta angolato con il microscopio dal lato in modo che il menisco aria fluido ha una vista sagittale. Il menisco dovrebbe apparire sullo stesso piano focale sia della parete interna ed esterna della pipetta.
  17. Lentamente ritirare la pipetta e ripetere i passaggi 1.13-1.16.3 al secondo e terzo set di coordinate forniti in Tabella 1.
  18. Dopo l'ultima iniezione, rimuovere la pipetta e posizionare cera ossea sufficiente per riempire il sito craniotomia. UNpproximate i bordi della ferita cuoio capelluto e legarsi con adesivo dermico.
  19. Iniettare 0,1 ml di 0,5% Marcaine nei margini della ferita utilizzando una sterile 30 ago G per evitare per evitare dolore locale associato con l'incisione del cuoio capelluto.
  20. Rispedire l'animale verso abitazioni e fornitura di antibiotici post-operatorio (0,48 mg / ml trimetoprim-sulfametossazolo, o 0,5 mg / ml levofloxacina) nell'acqua da bere per 5 giorni.

2. Bianco Materia fase di aspirazione - posteriore Avvicinamento angolare

  1. Eseguire i passaggi 1,1-1,12 come nel mediale protocollo approccio angolato, tranne regolare il braccio di iniezione del setup stereotassica a 45 gradi orientati anteriore a posteriore.
  2. Avanzare la pipetta per la prima A / P e M / L coordinate fornite nella tabella 2.
  3. Completa passaggi rimanenti 1.14-1.20 come nel laterale protocollo approccio angolato.

3. retrograda neuronale etichettatura

  1. Preparare una sterile 10Un'aliquota ml di L-Nio a 54,8 mg / ml in 0,9% soluzione salina normale.
  2. Preparare una un'aliquota sterile del 20% Fluororuby (o il 20% biotinilato ammina destrano o 2% Fluorogold) nel 0,9% soluzione fisiologica.
  3. Diluire insieme 1: 1 per concentrazioni finali di 27,4 mg / ml di L-Nio e il 10% Fluororuby.
  4. Eseguire il protocollo di ictus come sopra nei passaggi 1.3-1.23.
  5. Visualizza il tracciante fluorescente nativamente nella sezione di tessuto per la fissazione perfusione, criosezionamento e microscopia come descritto in precedenza 8.

4. Il trattamento dei tessuti per immunofluorescenza

  1. In un intervallo post-ictus appropriato che vanno da 3 ore a 14 giorni dopo l'ictus, euthanize topi tramite overdose isoflurano o IACUC locali approvati procedura.
  2. Aprire la cavità toracica con le forbici angolate e inserire un ago G 23 farfalla nel ventricolo sinistro.
  3. Inserire un piccolo taglio nell'atrio destro usando forbici sottili per permettere una traccia di deflusso per il liquido di perfusione.
  4. Transcardially profumato con 30-40 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo seguita da 30-40 ml di freddo 4% paraformaldeide ad una velocità di 10 ml / min a RT.
  5. Decapitare il mouse e rimuovere il cervello con le forbici sterili per aprire il cranio posteriormente e quindi rimuovere delicatamente il cranio sovrastante con una spatola, mettere il cervello a freddo 4% PFA per 24 ore, e poi il trasferimento al 30% di saccarosio in PBS per 48 ore .
  6. Preparare quaranta sezioni micron mobile usando un criostato e eseguire l'elaborazione di anticorpi come descritto in precedenza 6-8. In questo studio, utilizzare i seguenti anticorpi: coniglio anti-neurofilamenti 200 (diluizione 1: 500); coniglio anti-vimentina (1: 500); capra anti-GFAP (1: 500); coniglio anti-Iba-1 (1: 1.000).

5. Trattamento del tessuto per proteine ​​o RNA analisi

  1. In un intervallo post-ictus appropriato che vanno da 3 ore a 14 giorni dopo l'ictus, eutanasia tramite overdose isoflurano o IACUC locale procedura approvata.
  2. decapitare ilmouse e rimuovere il cervello con le forbici sterili per aprire il cranio posteriormente e quindi rimuovere delicatamente il cranio sovrastante con una spatola.
  3. Inserire una sterile 4 millimetri spatola nella parte anteriore del cervello per tagliare il bulbo olfattivo e nervi ottici. Sollevare delicatamente il cervello fuori della calotta cranica e posto in buffer di dissezione ghiacciata (soluzione salina bilanciata di 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 35 mm di glucosio, 4 mM di bicarbonato di sodio, e 0,01 mg / ml Cicloesimide).
  4. Utilizzando un blocco cervello e nuove lame di rasoio sterile, preparare lastre di 2-3 mm contenenti la corsa e il luogo nel buffer dissezione a freddo.
  5. Sotto un microscopio da dissezione, identificare la sostanza bianca sottostante corteccia motoria dell'emisfero iniettato. A intervalli post-corsa più lunga, la regione può essere visivamente identificato da necrosi focale e mielina pallore.
    Nota: A intervalli post-ictus precedenti, l'iniezione di L-Nio mescolato con 1 ml di 10% Veloce verde può permettere l'identificazione visiva della corsa (
  6. Sotto la guida di un microscopio da dissezione e utilizzando un bisturi fresco, sezionare con cura la regione di sostanza bianca contenente la corsa, identificata da una veloce etichettatura Verde o perdita di tessuto. Rimuovere la corteccia sovrastante e sottostante striato, se lo desideri.

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Representative Results

Utilizzando il modello presentato, la sostanza bianca zampa anteriore sottostante sensomotorio corteccia può essere mirata in modo affidabile. Questo modello di ictus indotto chimicamente produce assonale focale e la perdita di mielina, astrocitosi, e microgliosis (figura 1), come è tipicamente visto in infarti lacunari umani. Utilizzando tre iniezioni, un modello clinicamente utile è stabilito con insufficienza presto compiti motori zampa anteriore 7 e una piccola ma significativa porzione di esperienze tessuto cerebrale ischemia che immunoistochimica, immunofluorescenza, e biochimici tecniche sono fattibile e affidabile a livello quantitativo. In momenti iniziali (HR) dopo l'induzione ictus, cambiamenti nell'organizzazione molecolare assonale possono essere rilevati (Figura 2). A 7 giorni, la corsa completa la sua maturazione ad una zona circoscritta di perdita assonale (Figura 1a). Nelle nostre mani, questo metodo produce una focale bianco approssi questione lesionetamente 800 micron di diametro orizzontale e l'estensione di circa 1 mm lungo l'asse antero-posteriore del corpo calloso. In 7 giorni, la dimensione media totale dell'infarto è circa 0,200 millimetri 3 ed avrà una forma ellittica. Abbiamo osservato circa il 10% variabilità dimensioni del tratto sia tra animali e tra le sezioni, dipendenti dove dell'ellisse avviene sezione. Ulteriore crescita delle dimensioni dell'infarto è raramente visto oltre 7 giorni.

L'aggiunta di una iniezione contemporanea di risultati amminici destrano in significativa etichettatura neuronale nello strato 5 e lo strato 6 corpi cellulari neuronali che hanno assoni sporgenti attraverso la regione di ictus (Figura 3). neuroni corticali sovrastante che non siano danneggiati dagli aspetti sham della procedura (passaggio di ago sottile), subiscono un danno assonale distale e possono essere identificati con l'inclusione di un tracciante con la preparazione L-Nio. Questo approccio è stato l'uso d dimostrare cambiamenti dinamici del segmento iniziale dell'assone dopo l'ictus 8.

Mentre la piccola dimensione della regione del tessuto affetto da corsa limita l'uso di altre tecniche comuni come 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione, la regione ictus sostanza bianca può essere identificato in tessuto fresco. L'aggiunta di un colorante comune come veloce verde produce una regione identificabile di tessuto che può essere sezionato sotto un microscopio da dissezione (Figura 4). Una volta sezionato questo tessuto può essere utilizzato per l'analisi proteica con western blot o immunoprecipitazione, o per l'isolamento di RNA e di analisi (Figura 4C). Attraverso l'uso di varie linee topo transgenico, una varietà di approcci innovativi possono essere utilizzati per studiare la neurobiologia dopo focale ictus sostanza bianca compresi gli studi di mappatura destino delle cellule e microdissezione laser (Figura 4C).

tenda "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
Figura 1:. Focale Corsa bianca Materia Utilizzando Sia mediale e posteriore Approcci angolati etichettatura immunofluorescenza per neurofilamenti (A, rosso) dimostra il grado di perdita assonale sette giorni dopo l'ictus utilizzando l'approccio mediale. Utilizzando l'approccio angolato posteriore, il bianco della lesione ictus questione si rivolge appena sopra il ventricolo laterale (B, C) ​​e mostra microglia intenso (B) e reattività astrociti (C). Due astrociti marcatori intermedi ad incandescenza, vimentina (rosso) e acida fibrillare gliale proteina (GFAP, verde), entrambi mostrano cambiamenti nella morfologia della sostanza bianca astrociti (fibrosi) dopo ictus (C). Scala bar = 500 micron. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Bianco Materia Stroke Altera assonale microdomini Organizzazione Entro 3 ore di bianco induzione materia ictus, organizzazione microdomini assonale nel nodo, segnata da beta-IV spettrina (rosso) e al paranode, segnata da proteine ​​contattonel-associata (caspr, verde), è interrotta (frecce, B). Controlaterale assoni della materia bianca mostrano nodale regolare, paranodal, e l'organizzazione juxtaparanodal (A e C), mentre la sostanza bianca ipsilaterale mostra allungamento nodale e paranodal che è tipica degli assoni con contatto axoglial perso (B e D). Barra di scala = 5 micron.

Figura 3
Figura 3: retrograda neuronale Labeling con Bianco Materia Stroke Identifica singoli neuroni con danno assonale. Co-iniezione di ammina destrano fluorescente (rosso) al momento dell'induzione ictus consente l'identificazione dei singoli neuroni con assoni danneggiati da ictus. La maggior parte delle etichette avviene in assoni all'interno Layer 5 e 6 neuroni in corteccia sensorimotorie primarie sovrastanti la corsa. Immagine rappresenta 7 giorni successivi a ictus. Scala bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Microdissezione di sostanza bianca lesioni del tratto per l'utilizzo in biochimica e trascrizionali saggi co-iniezione di verde veloce al momento dell'induzione ictus permette l'identificazione precoce della regione feriti in 24 ore (A, pannello superiore). Immunoblotting per specifiche proteine ​​assonale può essere eseguita per dimostrare riduzioni nella regione di sola corsa (A, pannello inferiore). Nei punti di tempo più lungo, la regione di sostanza bianca ictus (pannello di sinistra) può essere focally sezionato senza un'etichettatura specifica (B). Pannello superiore destro mostra regione della sostanza bianca dopo la rimozione della regione sezionato mentre il pannello inferiore destro mostra la regione sezionato della sostanza bianca contenente la corsa (B). PCR per i geni specifici oligodendrociti utilizzando RNA isolato da regioni sezionati dalla materia bianca (C). IL = omolaterale; CL = controlaterale; c = controllo; s = corsa.

Iniezione Anteriore / posteriore Mediale / laterale Dorsale / ventrale
0.22 0.22 -2.10
2 0,70 0.15 -2.16
3 1.21 0.15 -2.18

Tabella 1: coordinate stereotassica per il metodo angolare laterale (in mm).

Iniezione Anteriore / posteriore Mediale / laterale Dorsale / ventrale
-0.75 -0.96 -2.10
2 -1.00 -0.96 -2.05
3 -1.25 -0.96 -2.00

Tabella 2: Coordinate stereotassica per posteriore Avvicinamento angolare (in mm).

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Discussion

Un certo numero di modelli precedenti di ictus sottocorticale sono stati descritti tra cui iniezioni focali di endotelina-1 nella capsula interna, sostanza bianca sottocorticale e striato nel ratto 6,15 12-14 e mouse. Modelli più recenti di piccoli colpi focali hanno utilizzato il colesterolo microemboli iniezione nella carotide 16 e l'occlusione photothrombotic di un singolo arteriole penetrante 17. Ognuno di questi modelli presenta vantaggi e svantaggi 5. Il modello attualmente descritto produce una lesione che ha una serie di caratteristiche che imitano infarto lacunare umana, compresa l'anormalità assonale e la perdita, il degrado mielina, un core necrotico focale e un deficit clinica che è minimo e dimostra abbastanza rapido recupero dipende da 7 anni. Targeting sostanza bianca murino permette una grande varietà di manipolazioni genetiche in grado di supportare gli studi meccanicistici.

la criticafasi del protocollo includono utilizzando le coordinate stereotassica accurate. Perché sostanza bianca murino è di piccole dimensioni e varia da ceppo a ceppo, può essere necessaria la revisione delle coordinate stereotassica a seconda dell'età e la tensione di mouse utilizzato. Il controllo del volume di iniezione è importante anche perché questo è direttamente correlata alle dimensioni dell'infarto. iniezioni più grandi produrranno colpi più grandi che invadono in corteccia sovrastante e striato sottostante.

Iniezione focale di ET-1 ricorrendo alla procedura descritta qui stato segnalato ma endotelina-1 è stato dimostrato di avere effetti paracrini diretti sulla differenziazione degli oligodendrociti e la maturazione 10,18 confondere lo studio di post-ictus sostanza bianca biologia. Al contrario, gli Obiettivi di avvicinamento L-Nio cellule endoteliali da solo mentre produce una lesione identico ed elimina eventuali effetti paracrini confondenti sulle cellule coinvolte nella risposta lesioni. L-Nio non è direttamente citotossico ed il Selecdose di Ted è stato determinato da esperimenti preliminari aumento della dose (dati non riportati). L'approccio angolato posteriore è stato sviluppato per più precisamente assoni sottosquadri dalla corteccia motoria primaria che produce il deficit comportamentali massima che può essere attribuito a lesioni della sostanza bianca. L'approccio angolato mediale anche danni assoni corteccia motoria, ma si estende più lateralmente e coinvolge gli assoni sottostanti corteccia sensoriale primaria.

La lesione ictus si espande abbastanza rapidamente rispetto al primo 24 ore. Per sette giorni, le dimensioni dell'infarto è massima e non abbiamo osservato una crescita significativa lesione là di quel tempo. Ulteriori eventi cellulari e degenerazione assonale si verificherà oltre questa fase iniziale, ma le dimensioni dell'infarto, misurata dal nucleo necrotico non cambieranno significativamente in assenza di qualsiasi intervento.

Co-iniezione di traccianti neuroanatomiche al momento della corsa identifica neuroni vivendo danno assonale ischemico. Utilizzando il medial o posteriore approccio angolato, i corpi cellulari neuronali con proiezioni assonale danneggiati rimangono illesi. Questo crea un modello utile per studiare l'effetto di assotomia ischemico sui neuroni del sistema nervoso centrale. Abbiamo utilizzato traccianti retrogradi principalmente tra destrano ammina e fluorogold, che sia mostrano eccellente assorbimento da assoni ictus-danneggiati. Impiegando l'ampia varietà di transgenici e knock-out linee del mouse, gli utenti di questo protocollo può indagare il ruolo specifico dei geni neuronali coinvolti in bianco ictus materia di risposta e la riparazione lesioni.

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Disclosures

Nessuna

Acknowledgements

SN e MDD hanno ricevuto sostegno dal NIH K08 NS083740 e il Dipartimento di Neurologia della UCLA. AJG riconosce sostegno da parte del Dr. Miriam e Adelson Research Foundation Sheldon G. medica e la L. Hillblom Fondazione Larry. KLN ringrazia il sostegno della Stroke Centro American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS e STC sono stati sostenuti da NIH R01 NS071481. JDH riconosce il sostegno NIH K08 NS083740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

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References

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