Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

İnme klinik inme sunumlar% 25'e kadar beyaz madde hesaplarını etkileyen, 5-10 kat daha büyük olabilir fiyatla sessizce gerçekleşir ve vasküler demans gelişmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. fokal beyaz cevher inme birkaç model var ve uygun modellerin bu eksikliği inme bu tip sonra yaralanma tepki ve onarımında yer alan nörobiyolojik mekanizmaları anlaşılmasını engelliyordu. diğer subkortikal inme modellerinin ana sınırlama fokal beyaz cevher infarkt kısıtlamak değil ya da öncelikle olmayan fare türlerinde valide edilmiş olmasıdır. Bu beyaz cevher inme nörobiyolojisini incelemek için fare araştırma araçları çok çeşitli uygulama becerisi sınırlar. Burada geri dönüşü olmayan bir eNOS inhibitörü bir lokal enjeksiyonu kullanılarak fare beyaz cevherde fokal inme güvenilir üretimi için bir metodoloji sunuyoruz. Biz de iki benzersiz stereotaktik dahil olmak üzere genel protokol üzerinde çeşitli varyasyonlar mevcutvaryasyonlar, büyük ölçüde bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişletmek retrograd nöronal izleme yanı sıra taze doku etiketleme ve diseksiyonu. Birden fazla yaklaşımlar inme bu ortak ve ilgili yeterli formun nörobiyolojik etkilerini analiz etmek için bu varyasyonlar izin verir.

Protocol

Bu protokolde hayvanların kullanımı Kaliforniya Los Angeles Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır.

Not: Hedef fare nüfusu belirleyerek başlayın. Önceki çalışmalarda, sadece erkek doğal tipte C57 / BL6 fareleri, ancak çeşitli transgenik ya nakavt fareleri de kullanılabilir, kullanılmıştır. stereotaktik koordinatlar C57 / BL6 anatomi dayalı olduğunu unutmayın. Her kullanıcı başlangıçta beyaz cevher inme lokalizasyonu doğrulamak tavsiye edilir.

1. Beyaz Matter İnme İndüksiyon - medial Açılı Yaklaşım

  1. Distal çapı 15-25 um, 11 arasında olacak şekilde 0.5 mm kapiler tüp kullanılarak çekilen cam pipet hazırlanmasıyla başlar.
  2. steril% 0.9 normal tuzlu su içinde 27.4 mg / ml (130 uM) de - L-NIO bir steril 10 ul alikosu ((1) -iminoethyl-L-ornitin HCI N- (5)) hazırlamak.
  3. çekti cam pipet Ön doldurmakcam pipet sabitlenmesiyle, L-NIO (2-5 | il), küçük bir hacme sahip bir vakum hattına bağlı boruya. tezgah üstünde pipet düz Lay ve L-Nio çözeltisi içine çekti ucunu.
    1. Pipet 0.5 mm'lik bölümünün en az 2 mm dolana kadar vakum uygulanır. Vakumu kapatın ve pipet çekin. Adım 1.12 kadar bir kenara koyun.
  4. Indüksiyon odasında fare yerleştirin ve standart% 32 izofluran kullanarak fare anestezi neden bir buharlaştırıcı akan (5 L / dk 5 L / dk oksijen ve 0,5 L / dk ile inhale N2) 1 dakika boyunca ya da derin anesteziye kadar. stereotaktik mikroskop ile donatılmış bir stereotaktik aparatı fareyi aktarın. Bir buharlaştırıcı akan% 32 izofluran kullanarak bakım anestezi sağlamak ve bir burun konisi (2 L / dk 5 L / dk oksijen ve 0.5 L / dak N 2 ile inhale). Bir ayak tutam anestezi derinliğini kontrol edin.
  5. 36 ° enjeksiyon kolunu ayarlayın.
  6. Affixa düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sistemi uzak ucuna cam pipet tutucu çekti ve stereotaktik kurulum enjeksiyon koluna takın.
  7. Coat iki gözün üstünde vazelin ve yer suni gözyaşı merhemi ile anestezi hayvanın bıyık. başının üzerinde bir 5-10 cm açıklığı olan hayvanın başının üzerinde steril örtüyü koyarak steril cerrahi alanında hazırlayın. kafatası örten kürk tıraş tarafından aspetic cerrahi yüzey hazırlayın. alternatif betadin ve% 70 alkol bezlerden ile kafa derisi temizleyin.
  8. kafatası yüzeyi ortaya çıkarmak için steril ince makas ile 1,5 cm orta hat kafa derisi kesi olun. Steril bir pamuklu çubukla kafatası kurutun ve 1-3X büyütme stereotaktik mikroskop kullanılarak, steril bir mikro nokta aracını kullanarak herhangi bir üstte periost doku kaldırmak.
  9. ince bir nokta kalem kullanarak bir referans noktası olarak Bregma işaretleyin.
  10. steril ince stip cerrahi matkap ucu kullanarak 2 mm ellipitical kraniotomi Matkap0; bregma posterior başlayan ve öne sadece orta hat sol uzanan. kemik parçaları çıkarın ve serebral korteks görüntülenmiştir böylece yumuşak doku örten.
  11. aralıklı steril serum fizyolojik damla uygulayarak cerrahi alan ve nemli kortikal yüzey tutun.
  12. Stereotaktik aparatın enjektör koluna çekti cam pipet yapıştırın. Bregma ile pipet distal ucunu hizalayın ve stereotaktik koordinatlar sıfır.
  13. İlk ön / arka (A / P) pipet ilerlemek ve / Tablo 1'de verilmiştir koordinatları (M / L) yanal medial.
  14. kortikal yüzeye pipet ilerlemek ve dorsal / ventral (D / V) ölçümü sıfır.
  15. Yavaş yavaş ilk D / V Tablo 1'de koordinat ulaşana kadar beyin içine pipet geçmektedir.
  16. beyne L-NIO 100 nl enjekte ve reflü önlemek için 5 dakika bekleyin, 20 msn bakliyat için 20 psi ayarlanmış bir düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sistemi kullanarakPipet parça yukarı.
    1. Stereotaktik mikroskop mercek ve 3X bir büyütme kalibre reticle kullanın.
    2. Buna uygun olarak, koordinat her biri için çekilen cam pipet (100 NL karşılık gelen 0.5 mm çapında bir pipet 0.5 mm uzunluğunda), 0.100 mm'lik toplam 3 yerinden. Bir el çantası kullanarak, ölçmek ve her kullanılan büyütme ve ölçekler bağlı olarak değişir kurmak beri standardize.
    3. hava-sıvı menisküs bir sagital görünümü vardır, böylece her enjeksiyon sırasında doğru hacim ölçümü için, yan mikroskopla açılı pipet yaklaşım. Menisküs pipet iç ve dış duvarın hem aynı odak düzlemi görünmelidir.
  17. Yavaşça pipet çekilme ve adımları tekrarlayın 1.13-1.16.3 Tablo 1'de verilen koordinatlar ikinci ve üçüncü sette de.
  18. Son enjeksiyondan sonra, pipet kaldırmak ve kraniyotomi sitesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. birKafa derisi yara kenarlarını pproximate dermal yapıştırıcı ile bağlanır.
  19. Kafa derisi kesi ile ilişkili yerel ağrıyı önlemek için önlemek için steril bir 30 G iğne kullanılarak yara marjları içine% 0.5 marcaine 0.1 ml enjekte edilir.
  20. 5 gün boyunca içme suyu konut ve arz post-operatif antibiyotik hayvan (0.48 mg / ml trimetoprim-sulfametoksazol veya 0.5 mg / ml Levofloksasin) döndürür.

2. Beyaz Matter İnme İndüksiyon - Posterior Açılı Yaklaşım

  1. posterior anterior odaklı 45 dereceye stereotaktik kurulum enjeksiyon kolunu ayarlamak dışında, medial açılı yaklaşım protokolünde olduğu gibi adımları 1.1-1.12 gerçekleştirin.
  2. İlk A / P pipet ilerlemek ve M / L Tablo 2'de verilmiştir koordinatları.
  3. Komple kalan adımları yanal açılı yaklaşım protokolde olduğu gibi 1,14-1,20.

3. Retrograd Sinir Etiketleme

  1. 10 steril hazırlanması% 0.9 normal serum fizyolojik içinde 54.8 mg / ml L-NIO ul alikosu.
  2. % 0.9 normal serum fizyolojik içinde% 20 Fluororuby (veya% 20, biyotinlenmiş dekstran amin ya da% 2 Fluorogold) steril bir kısım hazırlayın.
  3. 27.4 mg / ml L-Nio ve% 10 Fluororuby nihai konsantrasyonları için 1: Birlikte: 1 seyreltin.
  4. adımlarda 1,3-1,23 olarak yukarıdaki vuruş protokolü gerçekleştirin.
  5. Daha önce 8 açıklandığı gibi perfüzyon fiksasyon, cryosectioning ve mikroskopi ile doku bölümünde doğal floresan tracer gözünüzde canlandırın.

İmmünofloresan 4. Doku İşleme

  1. 3 saat dan inme sonrası 14 gün arasında değişen uygun bir inme sonrası aralıklarla, izofluran doz aşımı ya da yerel IACUC üzerinden fareler prosedür onaylı euthanize.
  2. açılı makas kullanarak göğüs boşluğu açın ve sol ventrikül içine bir 23 G kelebek iğne takın.
  3. perfüzyon sıvısı için bir çıkış izini izin ince makas kullanarak sağ atrium küçük bir kesim yerleştirin.
  4. Transkardiyal oda sıcaklığında, 10 ml / dk'lık bir oranda soğuk% 4 paraformaldehit 30-40 ml ve ardından soğutulmuş fosfat tamponlu tuz 30-40 ml serpmek.
  5. fare başını kesmek ve posterior kafatası açmak için steril makas kullanarak beyin kaldırmak ve sonra yavaşça 24 saat süreyle soğuk% 4 PFA halinde beyin, bir spatula ile örten kafatası kaldırmak yerleştirin ve daha sonra 48 saat süreyle PBS içinde% 30 sakaroz transfer .
  6. Bir kriyostat kullanarak devre mikron kayan kesitler hazırlamak ve daha önce 6-8 tarif edildiği gibi, antikor işlemi gerçekleştirir. Bu çalışmada aşağıdaki antikorların kullanımı: tavşan anti-sinir lifi 200 (1: 500 seyreltme); tavşan anti-vimentin (1: 500); keçi anti-GFAP (1: 500); tavşan anti-IBA-1 (1: 1000).

Protein veya RNA Analizi 5. Doku İşleme

  1. 3 saat dan inme sonrası 14 gün arasında değişen uygun bir inme sonrası aralıklarla, izofluran doz aşımı yoluyla euthanize ya da yerel IACUC prosedürü onayladı.
  2. başını kesmekFare posteriora kafatası açmak için steril makas kullanarak beyin kaldırmak ve daha sonra bir spatula ile hafifçe örten kafatası kaldırmak ve.
  3. Koku ampul ve optik sinirleri koparmaya beynin ön kısmında steril 4 mm spatula yerleştirin. Yavaşça calvarium üzerinden beyin kaldırın ve (1x Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 35 mM glukoz, 4 mM sodyum bikarbonat, ve 0.01 mg / ml cyclohexamide) buz soğukluğunda tahlil tamponuna içine koyun.
  4. Bir beyin blok ve steril yeni Jilet kullanarak, soğuk diseksiyon tampon içine inme ve yeri içeren 2-3 mm döşeme hazırlamak.
  5. bir mikroskop altında enjekte yarımkürede beyaz cevher altta yatan motor korteksin tespit. uzun inme sonrası aralıklarla, bölge görsel fokal nekroz ve miyelin solukluk tarafından tespit edilebilir.
    (Daha önce inme sonrası aralıklarla,% 10 1 ul ile karıştırılmış L-NIO enjeksiyonu ise Hızlı Yeşil inme görsel kimlik izin verebilir: Not
  6. Bir mikroskop rehberliğinde ve taze bir neşter kullanılarak altında, dikkatle Hızlı Yeşil etiketleme ya da doku kaybı ya tarafından belirlenen inme içeren beyaz cevher bölgeyi incelemek. istediğiniz gibi örten korteks ve altta yatan striatum çıkarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

sunulan modeli kullanarak, beyaz cevher altta yatan ön ayakları sensorimotor korteks güvenilir hedeflenebilir. Tipik olarak insan laküner infarkt görüldüğü gibi kimyasal olarak bağlı kontur modeli, fokal aksonal ve miyelin kaybı, astrositoz ve microgliosis (Şekil 1) üretir. Üç iğne kullanarak, klinik olarak faydalı model ön ayakları, motor görevleri 7 erken yetmezliği ve beyin dokusu deneyimleri küçük ama önemli bir kısmı ile kurulan immünohistokimyasal, immunofluorescent ve biyokimyasal teknikler nicel düzeyde uygulanabilir ve güvenilir olduğunu iskemi. Inme indüksiyon sonrası erken zaman noktalarında (saat), aksonal moleküler organizasyonu değişiklikler (Şekil 2) tespit edilebilir. Yüklemeden 7 gün sonra, inme aksonal kayıp (Şekil 1a) bir sınırlanmış alan, olgunlaşma tamamlar. Bizim ellerde, bu yöntem fokal beyaz cevher lezyonu approxima üretirtely 800 mikron yatay çapı ve korpus kallosum ön-arka eksen boyunca yaklaşık 1 mm uzayan. 7 günde, ortalama toplam enfarktüs boyutu kabaca 0.200 mm 3 ve eliptik bir şekle sahip olacaktır. Biz hayvanlar arasında ve bölümler, elips bölüm oluştuğu yere bağlı arasında hem inme boyutu yaklaşık% 10 değişkenlik gözlemledik. infarkt büyüklüğü daha fazla büyüme nadiren 7 gün ötesinde görülmektedir.

Aksonlar inme bölgesi boyunca uzanan (Şekil 3) sahip tabaka 5 ve tabakası 6 nöronal hücre gövdeleri önemli nöronal etiketleme dekstran amin sonuçların aynı anda enjeksiyonu eklenmesi. Prosedür (ince iğne geçişi), düzmece açıdan zarar görmezler örten kortikal nöronlar, uzak aksonal hasar geçmesi ve L-Nio hazırlanması ile ilgili bir izleyici dahil edilmesi ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, kullanımı oldu d inme 8 sonra akson ilk segmentinde dinamik değişiklikleri göstermek için.

inme etkilenen doku bölgesi küçük boyutu, 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyanarak gibi diğer yaygın teknikler kullanımını sınırlandırırken, beyaz madde kontur bölgesi Taze dokuda tespit edilebilir. Örneğin hızlı yeşil ortak bir boya ilavesi bir mikroskop altında kesilir edilebilir bir doku tanımlanabilir bölge (Şekil 4) sağlar. Parçalara Bu doku Western blot veya immüno veya RNA izolasyonu ve analiz (Şekil 4C) için olan protein analizi için kullanılabilir kez. Çeşitli transgenik fare hatları kullanımı sayesinde, yenilikçi yaklaşımlarla çeşitli hücre kaderi haritalama çalışmaları ve lazer yakalama mikrodiseksiyon (Şekil 4C) da dahil olmak üzere fokal beyaz cevher inme sonrası nörobiyolojisini incelemek için kullanılabilir.

1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "çadır Şekil 1
Şekil 1:. Iç tarafta ve arka Açılı Yaklaşımlar kullanma Hem Odak Beyaz Cevher İnme nörofilament için immünofloresan etiketleme (A, kırmızı) medial yaklaşım kullanarak yedi gün inme sonrası akson kaybının derecesini gösterir. Posterior açılı yaklaşımı kullanarak, beyaz cevher inme lezyon sadece lateral ventrikül (B, C) ​​yukarıda hedeflenen ve yoğun mikroglial (B) ve astrositik reaktivite (C) gösterir. İki astrosit ara filaman belirteçleri, vimentin (kırmızı) ve glial fibriler asidik protein (GFAP, yeşil), kontur (C), sonra, beyaz bir madde (elyaflı) astrositlerin morfolojisi değişiklikleri göstermektedir. Ölçek çubukları = 500 mikron. Ver bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sion.

şekil 2
Şekil 2:. Beyaz Cevher İnme Alters Aksonal microdomain Organizasyon kontaktin ilişkili protein ile işaretlenmiş beta-IV spektrin (kırmızı) ve paranode de damgasını düğümünde beyaz cevher inme indüksiyon, aksonal mikro bölge örgütü, 3 saat (caspr içinde, yeşil), bozulur (oklar, B). Ipsilateral beyaz cevher kaybetti axoglial temas (B ve D) ile akson tipik nodal ve paranodal uzama gösterirken kontralateral beyaz cevher aksonlar düzenli Noktasal, paranodal ve juxtaparanodal organizasyonu (A ve C) gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mikron.

Şekil 3,
Şekil 3: Retrograd Nöronal LabelinBeyaz madde İnme ile g aksonal hasar ile Bireysel Nöronlar tanımlar. inme indüksiyon sırasında floresan dekstran amin (kırmızı) Eş-enjeksiyon inme yaralı akson ile bireysel nöronların belirlenmesini sağlar. etiketleme çoğu Katman 5 içinde akson ve inme örten birincil sensörimotor korteks 6 nöronlar oluşur. Görüntü inme sonrası 7 gün temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Inme indüksiyon sırasında Hızlı Yeşil Biyokimyasal ve transkripsiyonel Tahliller Co-enjeksiyon Kullanılmak Üzere Beyaz Cevher İnme Lezyonlarının Mikrodisseksiyon 24 saat (A, üst panel) yaralı bölgenin erken belirlenmesini sağlar. ImmunoblottiBelirli bir aksonal proteinler için ng tek çizgi (A, alt panel) bölgesinde azalmalar göstermek için gerçekleştirilebilir. Uzun zaman noktalarında, beyaz cevher inme (sol panel) bölgesi fokal özel etiketleme (B) olmadan disseke edilebilir. Sağ alt paneli inme (B) içeren beyaz maddenin disseke bölgesini gösterirken sağ üst panel disseke bölgenin çıkarıldıktan sonra beyaz cevher bölgesini göstermektedir. Beyaz madde (C) kesilerek bölgelerinden izole edilen RNA kullanılarak oligodendrosit-özgü genler için PCR. IL ipsilateral =; CL = taraf; c = kontrolü; s = strok.

Enjeksiyon Anterior / Posterior Medial / Lateral Dorsal / Ventral
0.22 0.22 -2,10
2 0.70 0.15 -2,16
3 1.21 0.15 -2,18

Tablo 1: (mm) Yanal Açılı Yaklaşım Stereotaktik Koordinatlar.

Enjeksiyon Anterior / Posterior Medial / Lateral Dorsal / Ventral
-0.75 -0,96 -2,10
2 -1.00 -0,96 -2,05
3 -1.25 -0,96 -2,00

Tablo 2: (mm) Posterior Açılı Yaklaşım Stereotaktik Koordinatlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subkortikal inme örneksiz bir dizi sıçan 12-14 ve fare 6,15 iç kapsüle endotelin-1 fokal enjeksiyonlar subkortikal beyaz madde ve striatum içeren tarif edilmiştir. Küçük odak vuruşları daha yeni modeller kolesterol mikroemboli karotis arter 16 enjeksiyon ve tek delici arteriole 17 Fototrombotik tıkanıklığı kullanmışlardır. Bu modellerin her biri avantaj ve dezavantajları 5 hem de sahiptir. Şu anda açıklanan model aksonal anormallikler ve zarar, miyelin bozulması, fokal nekrotik çekirdek ve minimal ve 7 yaşında bağımlı oldukça hızlı bir toparlanma gösteren bir klinik açığı da dahil olmak üzere insan laküner infarktı taklit özellikleri bir numarası vardır bir lezyon oluşturur. fare beyaz maddeyi Hedefleme mekanik çalışmalara destek genetik manipülasyonlar geniş bir yelpazede sağlar.

kritikprotokol adımları doğru stereotaktik koordinatları kullanılarak bulunmaktadır. fare beyaz cevher boyutu küçük ve gerginlik zorlanma değişir, çünkü stereotaktik koordinatlar revizyonu kullanılan fare yaş ve gerginlik bağlı olarak gerekebilir. Bu doğrudan enfarktüs boyutu ile korele olduğu gibi enjeksiyon hacminin kontrolü de önemlidir. Büyük enjeksiyonlar örten korteks ve altta yatan striatum tecavüz büyük vuruşları üretecek.

Burada anlatılan yaklaşım kullanılarak, ET-1 odak enjeksiyonu bildirilmiştir endotelin-1 inme sonrası beyaz madde biyoloji çalışma karıştırıcı oligodendrosit farklılaşması ve olgunlaşmasının 10,18 doğrudan parakrin etkisi olduğu gösterilmiştir. Bunun aksine, L-Nio yaklaşımı hedef endotel hücreleri, tek başına aynı lezyon üretim ve yaralanma yanıt olarak görev yapan hücrelerin herhangi bir karıştırıcı parakrin etkileri ortadan kaldırır ise. L-Nio doğrudan sitotoksik ve Sendai değildirted doz, ön doz artırımına deney ile tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Posterior açılı bir yaklaşım daha doğrusu primer motor korteks alttan aksonlar beyaz cevher hasarı isnat edilebilir maksimum davranışsal açığı üreten geliştirilmiştir. Ayrıca medial açılı yaklaşım zarar motor korteks aksonları ama daha yanal uzanır ve primer duyusal korteks altında yatan aksonlar içerir.

inme lezyon ilk 24 saat boyunca oldukça hızlı genişler. yedi gün, enfarktüs boyutu maksimum ve biz o zaman ötesinde önemli lezyon büyüme gözlenmiştir değil. Ek hücresel olaylar ve aksonal dejenerasyon bu başlangıç ​​aşamasında ötesinde meydana gelecek ama nekrotik çekirdek tarafından ölçülen enfarkt boyutu herhangi bir müdahale olmaması durumunda önemli bir değişiklik olmayacak.

inme zaman Nöroanatomik izleyiciler ortak enjeksiyonu iskemik aksonal yaralanma deneyimi nöronlar tanımlar. Kullanımı ya medial veya posterior açılı yaklaşım, hasarlı akson projeksiyonlar nöronal hücre gövdeleri sağ salim kalır. Bu santral sinir sistemi nöronları üzerinde iskemik Axotomy etkisini araştırmak için yararlı bir model oluşturur. İkimiz de inme hasarlı akson tarafından mükemmel alımını göstermektedir dekstran amin ve Fluorogold dahil öncelikle retrograd izleyiciler, kullanmışlardır. transgenik ve knock-out fare hatları çeşitli istihdam olarak, bu protokolün kullanıcıları beyaz cevher inme yaralanma tepki ve onarım nöral genlerin belirli bir rol araştırabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri

Acknowledgements

SN ve MDD NIH K08 NS083740 ve Nöroloji UCLA Bölümü'nden destek aldı. AJG Dr. Miriam ve Sheldon G. Adelson Tıbbi Araştırma Vakfı ve Larry L. Hillblom Vakfı tarafından destek onaylar. KLN minnetle Amerikan Kalp Derneği 14BFSC17760005 ASA-Bugher İnme Merkezi'nden destek kabul eder. ILL, EGS ve STC NIH R01 NS071481 tarafından desteklendi. JDH NIH K08 NS083740 destek kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, 28-292 (2014).
  2. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43, 3102-3104 (2012).
  3. Koton, S., et al. Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry. Stroke. 44, 3293-3297 (2013).
  4. Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review. J Neurochem. 115, 814-828 (2010).
  5. Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. Models that matter: white matter stroke models. Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).
  6. Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates. J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).
  7. Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators. Stroke. 44, 2579-2586 (2013).
  8. Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke. Stroke. 44, 182-189 (2013).
  9. McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells. Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).
  10. Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development. J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).
  11. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. CSH prot. (2006).
  12. Hughes, P. M., et al. Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).
  13. Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses. Stroke. 36, 107-112 (2005).
  14. Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).
  15. Horie, N., et al. Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1. J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).
  16. Wang, M., et al. Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts. Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).
  17. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).
  18. Jung, K. J., et al. The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes. J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics