Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

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Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

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Abstract

Schlaganfall beeinflussen weißen Substanz macht bis zu 25% der klinischen Schlaganfall Präsentationen, tritt leise auf Raten, die 5-10-fach größer, und trägt wesentlich zur Entwicklung von vaskulärer Demenz sein kann. Nur wenige Modelle von fokalen weißen Substanz Schlaganfall existieren und dieser Mangel an geeigneten Modellen hat Verständnis der neurobiologischen Mechanismen zu Verletzungen Antwort und Reparatur nach dieser Art von Schlaganfall beteiligt behindert. Die Hauptbeschränkung von anderen subkortikalen Schlaganfallmodellen ist, dass sie nicht fokal Infarkt zu der weißen Substanz zu beschränken oder haben in nicht-murine Arten validiert primär sind. Dies begrenzt die Fähigkeit, die Vielzahl von murinen Forschungswerkzeuge anzuwenden, um die Neurobiologie der weißen Substanz Schlaganfall zu studieren. Hier präsentieren wir eine Methode für die zuverlässige Herstellung eines fokalen Schlaganfalls in murine weißen Substanz eine lokale Injektion eines irreversiblen eNOS-Inhibitor verwendet wird. Wir präsentieren auch mehrere Varianten auf dem allgemeinen Protokoll einschließlich zwei einzigartige StereotaxieVariationen, retrograden neuronale Tracing sowie frisches Gewebe Kennzeichnung und Dissektion, die stark die möglichen Anwendungen dieser Technik erweitern. Diese Variationen erlauben für mehrere Ansätze, um die neurobiologischen Auswirkungen dieser gemeinsamen und erforschten Form von Schlaganfall zu analysieren.

Protocol

Die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der University of California Los Angeles Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt wurde.

Hinweis: Beginnen Sie mit der Ziel murine Bevölkerung zu identifizieren. In früheren Studien, nur männliche Wildtyp-C57 / BL6-Mäusen verwendet wurden, jedoch verschiedene transgenen oder Knockout-Mäuse auch verwendet werden können. Beachten Sie, dass sind stereotaktischen Koordinaten basierend auf C57 / Bl6 Anatomie. Es wird empfohlen, dass jeder Benutzer zunächst die Lokalisierung des Hubs zu der weißen Substanz zu überprüfen.

1. Weiß Matter Stroke Induktion - Medial mit schräger Ansatz

  1. Beginnen Sie mit einer gezogenen Glaspipette unter Verwendung von 0,5 mm Kapillarrohr vorbereitet , so dass der distale Durchmesser zwischen 15 bis 25 & mgr; m 11 ist.
  2. Bereiten einer sterilen 10-ul-Aliquot von L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-Ornithin HCl) bei 27,4 mg / ml (130 uM) in steriler 0,9% normale Kochsalzlösung.
  3. Vorfüllen die gezogener Glaspipettemit einem kleinen Volumen von L-Nio (2-5 & mgr; l) durch die Glaspipette Befestigung mit einer Vakuumleitung an die Rohrleitung. Legen Sie die Pipette flach auf der Tischplatte und setzen Sie das zog Ende in die L-Nio Lösung.
    1. Übernehmen des Vakuums, bis mindestens 2 mm von der 0,5 mm Abschnitt der Pipetten gefüllt ist. Schalten Sie das Vakuum aus, und die Pipette zurückziehen. Legen Sie sie beiseite, bis Schritt 1.12.
  4. Platzieren Sie die Maus in einer Induktionskammer und induzieren Anästhesie der Maus unter Verwendung von Standard 32% Isofluran floss durch einen Verdampfer (5 l / min inhaliert mit 5 l / min Sauerstoff und 0,5 l / min N 2) für 1 min oder bis tief anästhesiert. Übertragen Sie die Maus an einen stereotaktischen Apparat mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet. Geben Sie Isofluran Aufrechterhaltung der Narkose mit 32% floss durch einen Verdampfer (2 l / min inhaliert mit 5 l / min Sauerstoff und 0,5 l / min N 2) und einem Nasenkegel. Prüfen Tiefe der Anästhesie mit einer Zehe Prise.
  5. Stellen Sie den Injektionsarm bis 36 °.
  6. Affixa gezogen Glaspipette Halter an das distale Ende eines geringen Volumendruck-Einspritzsystem und befestigen Sie es an der Injektions Arm des Stereotaxie-Setup.
  7. Mantel des narkotisierten Tieres Whiskers mit Vaseline und Ort künstliche Tränen Salbe über beide Augen. Bereiten Sie eine sterile OP-Feld durch einen sterilen Tuch über den Kopf des Tieres mit einer 5-10 cm Öffnung über den Kopf stellen. Bereiten Sie eine aseptischen OP-Oberfläche, die durch das Fell rasiert den Schädel überlagert. Reinigen Sie die Kopfhaut mit abwechselnden betadine und 70% Alkoholtupfer.
  8. Machen Sie eine 1,5 cm Mittellinie Kopfhauteinschnitt mit sterilen feinen Schere, um die Schädeloberfläche zu belichten. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen und unter Verwendung eines stereotaktischen Mikroskop bei 1-3x Vergrößerung, entfernen Sie alle darüber liegenden periostaler Gewebe eine sterile Mikropunkt-Werkzeug.
  9. Markieren Sie die Bregma als Referenzpunkt einen feinen Punkt Marker.
  10. Bohren Sie ein 2 mm ellipitical Craniotomie einer sterilen feinen stip chirurgische Bohrer mit0; posterior am Bregma beginnen und nach vorne gerade links von der Mittellinie erstrecken. Entfernen von Knochenfragmenten und Weichgewebe überlagert, so dass der Großhirnrinde sichtbar gemacht werden kann.
  11. Halten Sie das OP-Feld und kortikalen Oberfläche feucht durch intermittierend Tropfen steriler Kochsalzlösung anwenden.
  12. Affix eine gezogen Glaspipette mit dem Injektor Arm des stereotaktischen Apparat. Richten Sie das distale Ende der Pipette mit dem Bregma und Null, um die stereotaktischen Koordinaten.
  13. Vorzurücken die Pipette mit dem ersten anterioren / posterioren (A / P) und medial / lateral (M / L) -Koordinaten in Tabelle 1 bereitgestellt.
  14. Schieben Sie die Pipette auf die kortikalen Oberfläche und Null die dorsale / ventralen (D / V) Messung.
  15. Passieren langsam die Pipette in das Gehirn bis zum Erreichen der ersten D / V in Tabelle 1 zu koordinieren.
  16. Mit einem geringen Volumendruck-Einspritzsystem bei 20 psi für 20 ms Impulse gesetzt, injizieren 100 nl von L-Nio in das Gehirn ein und warten 5 Minuten Reflux zu verhindernup der Pipette Spur.
    1. Verwenden eines kalibrierten Retikel in das Okular des Stereotaxie-Mikroskop und einer Vergrößerung von 3X.
    2. Dementsprechend insgesamt 0,100 mm 3 (0,5 mm Länge in einer 0,5 mm Durchmesser Pipette bis 100 nl entspricht) verdrängen aus der ausgezogenen Glaspipette für jeden Satz von Koordinaten. Mit der Einrichtung eines reticule mit, zu messen und zu standardisieren, da jeder einrichten variiert in Abhängigkeit von der Vergrößerung und Skalen verwendet.
    3. Für eine genaue Volumenmessung während jedes Einspritz nähern sich die abgewinkelten Pipette mit dem Mikroskop von der Seite, so dass der Flüssigkeitsmeniskus eine Sagittalansicht aufweist. Der Meniskus sollte in der gleichen Brennebene erscheinen sowohl der Innen- und Außenwand der Pipette.
  17. Langsam die Pipette zurückziehen und die Schritte wiederholen 1.13-1.16.3 bei der zweiten und dritten Satz von Koordinaten in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt.
  18. Nach der letzten Injektion, entfernen Sie die Pipette und legen genug Knochenwachs die Kraniotomiestelle zu füllen. EINpproximate die Kanten der Kopfhaut Wunde und binden mit dermal Klebstoff.
  19. Injizieren von 0,1 ml 0,5% Marcain in die Wundränder eine sterile 30 G-Nadel zu verhindern, lokale Schmerzen zu verhindern, mit der Kopfhaut Einschnitt verbunden.
  20. Bringen Sie das Tier mit dem Gehäuse und Versorgung postoperativer Antibiotika (0,48 mg / ml Trimethoprim-Sulfamethoxazol oder 0,5 mg / ml Levofloxacin) im Trinkwasser für 5 Tage.

2. Weiß Matter Stroke Induktion - posterior gewinkelt Ansatz

  1. Führen Sie die Schritte 1,1-1,12 wie im medialen abgewinkelte Ansatz Protokoll, mit Ausnahme der Injektionsarm des stereotaktischen Setup anpassen, um 45 Grad ausgerichtet von vorne nach hinten.
  2. Vorzurücken die Pipette mit dem ersten A / P und M / L - Koordinaten in Tabelle 2 bereitgestellt.
  3. Vollständige verbleibenden Schritte 1,14-1,20 wie in der seitlichen abgewinkelten Ansatz Protokoll.

3. Rückläufige Neuronale Labeling

  1. Bereiten Sie eine sterile 10& mgr; l Aliquot von L-Nio bei 54,8 mg / ml in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung.
  2. Bereiten Sie eine sterile aliquote Menge von 20% Fluororuby (oder 20% biotinyliertes Dextran Amin oder 2% Fluorogold) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung.
  3. Verdünnte zusammen 1: 1 für Endkonzentrationen von 27,4 mg / ml L-NiO und 10% Fluororuby.
  4. Führen Sie den Hub-Protokoll, wie oben in den Schritten 1,3-1,23.
  5. Visualisieren Sie die nativ fluoreszierende Tracer in Gewebeschnitt durch Perfusionsfixierung, Kryoschneiden und Mikroskopie wie zuvor 8 beschrieben.

4. Gewebeverarbeitung für Immunofluoreszenz

  1. Zu einem geeigneten post-Takt-Intervall im Bereich von 3 Stunden bis 14 Tage nach Schlaganfall, einschläfern Mäuse über Isofluran Überdosierung oder lokalen IACUC Verfahren genehmigt.
  2. Öffnen Sie die Brusthöhle mit abgewinkelten Schere und legen Sie eine 23 G Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel.
  3. Setzen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof mit einer feinen Schere einen Abfluss Spur für die Perfusionsflüssigkeit zu ermöglichen.
  4. Transkardial mit 30-40 ml kaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung perfundiert von 30-40 ml kaltem 4% Paraformaldehyd bei einer Rate von 10 ml / min bei RT verfolgt.
  5. Enthaupten die Maus und entfernen Sie das Gehirn mit einer sterilen Schere den Schädel posterior zu öffnen und entfernen Sie dann vorsichtig den darüber liegenden Schädel mit einem Spatel, legen Sie das Gehirn in kalte 4% PFA für 24 h und dann übertragen auf 30% Saccharose in PBS für 48 Stunden .
  6. Bereiten Sie vierzig Mikron schwebenden Abschnitte unter Verwendung eines Kryostats und Antikörper - Verarbeitung durchführen , wie zuvor 6-8 beschrieben. In dieser Studie wurden die folgenden Antikörper: Kaninchen-Anti-Neurofilament 200 (1: 500 Verdünnung); Kaninchen-anti-Vimentin (1: 500); Ziege-Anti-GFAP (1: 500); Kaninchen-anti-Iba-1 (1: 1000).

5. Gewebeverarbeitung für Protein oder RNA-Analyse

  1. Zu einem geeigneten post-Takt-Intervall im Bereich von 3 Stunden bis 14 Tagen nach dem Schlaganfall, einschläfern über Isofluran Überdosierung oder lokalen IACUC Verfahren genehmigt.
  2. enthaupten dieMaus und das Gehirn mit einer sterilen Schere entfernen Sie den Schädel posterior zu öffnen und dann mit einem Spachtel die darüber liegende Schädel sanft entfernen.
  3. Legen Sie eine sterile 4 mm Spachtel an der Vorderseite des Gehirns Riechkolben und Sehnerven zu trennen. Heben Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädelkalotte aufnehmen und in eiskalten Dissektion Puffer (1x Hanks Balanced Salt Solution, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 35 mM Glucose, 4 mM Natriumbicarbonat und 0,01 mg / ml Cycloheximid).
  4. Mit einem Gehirn blockieren und sterile neue Rasierklingen, vorbereiten 2-3 mm Platten den Hub und Ort in kalte Dissektion Puffer enthält.
  5. Unter einem Binokular, identifizieren die weiße Substanz zugrunde liegenden motorischen Kortex in der injizierten Hemisphäre. Bei längeren post stroke Intervallen kann die Region visuell durch fokale Nekrosen und Myelin Blässe identifiziert werden.
    Hinweis: Bei früheren Post-Takt-Intervalle, die Injektion von L-Nio gemischt mit 1 ul 10% Fast Green kann eine visuelle Identifikation des Hubs ermöglichen (
  6. Unter Anleitung eines Binokular und ein frisches Skalpell vorsichtig die Region der weißen Substanz sezieren den Hub enthält, identifiziert durch entweder Fast Green Kennzeichnung oder Gewebeverlust. Entfernen Sie darüber liegenden Kortex und der zugrunde liegenden Striatum nach Wunsch.

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Representative Results

Mit dem Modell dargestellt wird, kann die weiße Substanz zugrunde liegenden forelimb sensomotorischen Kortex zuverlässig ausgerichtet sein. Diese chemisch induzierte Hubmodell produziert Brenn axonalen und Myelinverlust, Astrozytose und Mikrogliose (Abbildung 1), wie sie typischerweise in menschlichen lacunar Infarkte zu sehen ist. Durch die Verwendung von drei Injektionen, ein klinisch nützliches Modell mit frühen Beeinträchtigung auf forelimb motorischen Aufgaben eingerichtet ist 7 und einem kleinen , aber bedeutenden Teil des Hirngewebes Erfahrungen Ischämie , dass immunhistochemischen, Immunofluoreszenz und biochemischen Techniken sind möglich und zuverlässig auf der quantitativen Ebene. Zu frühen Zeitpunkten (h) nach dem Schlaganfall Induktionsänderungen axonalen molekulare Organisation kann (Abbildung 2) nachgewiesen werden. An 7 Tagen beendet der Hub seine Reifung zu einer umschriebenen Bereich der Verlust von Axonen (Abbildung 1a). In unseren Händen erzeugt dieses Verfahren einen Schwerpunkt der weißen Substanz Läsion Angleichungdig 800 um in horizontaler Durchmesser und etwa 1 mm entlang der anterior-posterioren Achse des corpus callosum erstreckt. Nach 7 Tagen ist die durchschnittliche Gesamtinfarktgröße etwa 0,200 mm 3 und eine elliptische Form aufweisen. Wir haben etwa 10% Variabilität in Strichgröße sowohl zwischen Tieren und zwischen den Abschnitten beobachtet, je nachdem, wo in der Ellipse der Abschnitt auftritt. Weiteres Wachstum in der Größe des Infarkts ist selten über 7 Tage gesehen.

Die Zugabe einer gleichzeitigen Injektion von Dextran Amin führt zu einer signifikanten neuronal Kennzeichnung in Schicht 5 und Schicht 6 neuronalen Zellkörpern , die Axone Projizieren durch den Bereich des Hubs (Figur 3) aufweisen. Darüber liegenden kortikalen Neuronen, die von den sham Aspekte des Verfahrens (Durchgang der feinen Nadel) nicht beschädigt werden, durchlaufen distale axonale Schäden und kann durch die Aufnahme eines Tracers mit der L-Nio Präparat identifiziert werden. Dieser Ansatz war die Verwendung d zu demonstrieren dynamischen Veränderungen im Axon Anfangssegment nach einem Schlaganfall 8.

Während die geringe Größe der Region vom Schlaganfall betroffenen Gewebe kann die Verwendung von anderen üblichen Techniken begrenzt wie 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung der weißen Substanz Hubbereich in frischem Gewebe identifiziert werden. Die Zugabe eines gemeinsamen Farbstoff wie Fast Green erzeugt einen identifizierbaren Bereich des Gewebes , das unter einem Binokular (Abbildung 4) zerlegt werden kann. Sobald seziert diese Gewebe kann für die Proteinanalyse mit Western - Blot oder Immunpräzipitation, oder für die RNA - Isolierung und Analyse (4C) verwendet werden. Durch die Verwendung von verschiedenen transgenen Mauslinien, kann eine Vielzahl von innovativen Ansätzen verwendet werden , um die Neurobiologie nach fokaler weißen Substanz Schlaganfall einschließlich Zellschicksal Kartierungsuntersuchungen und die Laser Mikrodissektion (4C) zu studieren.

Zelt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 1
Abb . 1: Focal Weiß Matter Stroke Mit beiden Medial und posterior gewinkelt Ansätze Immunofluoreszenz Kennzeichnung für neurofilaments (A, rot) zeigt den Grad der axonalen Verlust von sieben Tagen nach Schlaganfall den medialen Ansatz. Unter Verwendung des hinteren abgewinkelten Ansatz wird die weiße Substanz Schlaganfall Läsion gezielt direkt über dem lateralen Ventrikel (B, C) ​​und zeigt starke Mikroglia (B) und Astrozyten Reaktivität (C). Zwei Astrozyten Intermediärfilament Marker Vimentin (rot) und sauren Gliafaserproteins (GFAP, grün), offenbaren beide Veränderungen in der Morphologie der weißen Substanz (faserig) Astrozyten nach einem Schlaganfall (C). Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier ein , um zu vergrößern version von dieser Figur.

Figur 2
Abbildung 2:. Weiß Matter Stroke Alters Axonal Mikrodomäne Organisation innerhalb von 3 Stunden von der weißen Substanz Schlaganfall Induktion, axonalen Mikrodomäne Organisation am Knoten, gekennzeichnet durch Beta-IV Spektrin (rot) und an der paranode, gekennzeichnet durch Contactin-assoziierten Protein (caspr, grün), ist gestört (Pfeile, B). Kontralaterale weißen Substanz Axonen zeigen regelmäßige Knoten, paranodalen und juxtaparanodal Organisation (A und C) , während der ipsilateralen weißen Substanz zeigt Knoten und paranodalen Dehnung , die typisch für Axone mit verlorenen axoglial Kontakt (B und D). Maßstabsbalken = 5 & mgr; m.

Figur 3
Abbildung 3: Rückläufige Neuronale Labeling mit weißen Substanz Stroke Identifiziert Einzelne Neurone mit Axonal Schaden. Co-Injektion von fluoreszierenden Dextran Amin (rot) zum Zeitpunkt des Schlaganfalls Induktion ermöglicht die Identifizierung von einzelnen Neuronen mit durch Schlaganfall verletzten Axone. Der größte Teil der Markierung erfolgt in Axone innerhalb der Schicht 5 und 6 Neuronen im primären sensomotorischen Kortex den Hub liegt. Bild repräsentiert 7 Tage nach Schlaganfall. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Mikrodissektion von White Matter Stroke Läsionen für die Verwendung in biochemische und Transkriptions - Assays Co-Injektion von Fast Green zum Zeitpunkt des Schlaganfalls Induktion ermöglicht eine frühzeitige Identifizierung des verletzten Region bei 24 Stunden (A, oben). Immunoblotting für spezifische axonalen Proteine ​​kann durchgeführt werden Reduzierungen im Bereich der Schlaganfall alleine (A, unteres Feld) zu demonstrieren. Bei längeren Zeitpunkten, die Region der weißen Substanz Hub (links) kann fokal ohne spezifische Markierung (B) zerlegt werden. Im rechten oberen Feld zeigt Bereich der weißen Substanz nach dem Entfernen der zerlegten Region , während die untere rechte Tafel die sezierten Bereich der weißen Substanz zeigt den Hub (B) enthält. PCR für Oligodendrozyten-spezifischen Genen RNA , isoliert aus sezierten Bereiche von der weißen Substanz unter Verwendung (C). IL = ipsilateral; CL = kontralateralen; c = Kontrolle; s = Hub.

Injektion Anterior / Posterior Medial / Lateral Dorsal / ventrale
0,22 0,22 -2,10
2 0,70 0,15 -2,16
3 1.21 0,15 -2,18

Tabelle 1: stereotaktischen Koordinaten für Lateral mit schräger Ansatz (in mm).

Injektion Anterior / Posterior Medial / Lateral Dorsal / ventrale
-0.75 -0,96 -2,10
2 -100 -0,96 -2,05
3 -1.25 -0,96 -2.00

Tabelle 2: stereotaktischen Koordinaten für posteriore mit schräger Ansatz (in mm).

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Discussion

Eine Anzahl von früheren Modellen von subkortikalen Schlaganfall einschließlich Brenn Injektionen von Endothelin-1 in die Capsula interna, subkortikalen weißen Substanz und Striatum in der Ratte und Maus - 12-14 6,15 beschrieben. Neuere Modelle von kleinen Brenn Hübe haben Cholesterin Mikroemboli Injektion in die Arterie carotis 16 verwendet und photothrombotic Okklusion eines einzelnen eindringenden arteriole 17. Jedes dieser Modelle hat sowohl Vorteile als auch Nachteile 5. Das hier beschriebene Modell erzeugt eine Läsion , die eine Reihe von Eigenschaften, die menschliche lacunar Infarkt einschließlich axonalen Anomalien und Verlust, Myelin - Abbau, einer fokalen nekrotischen Kern und einer klinischen Defizit , das minimal ist und zeigt , ziemlich schnelle Erholung abhängig von Alter 7 imitieren. Maus-weißen Substanz Targeting ermöglicht eine Vielzahl von genetischen Manipulationen, die mechanistische Studien unterstützen kann.

Die kritischeSchritte des Protokolls umfassen genaue stereotaktischen Koordinaten verwendet. Weil murine weißen Substanz in der Größe klein und variiert von Stamm zu Stamm, Revision der stereotaktischen Koordinaten können in Abhängigkeit von dem Alter und dem Mäusestamm verwendet, benötigt werden. Steuerung des Injektionsvolumen ist auch wichtig, da dies direkt mit der Größe des Infarkts korreliert. Größere Injektionen werden größere Hübe erzeugen, die auf darüber liegenden Kortex und der zugrunde liegenden Striatum eingreifen.

Focal Injektion von ET-1 Das hier beschriebene Ansatz verwendet wurde berichtet, aber Endothelin-1 wurde direkt zu haben parakrine Wirkungen auf Oligodendrozyten Differenzierung und Reifung 10,18 Verwechselung das Studium der weißen Substanz biology nach Schlaganfall gezeigt. Im Gegensatz dazu ist allein die L-Nio Ansatz Ziele Endothelzellen während der Herstellung eine identische Läsion und eliminiert alle verwirrende parakrine Effekte auf die Verletzung Reaktion beteiligten Zellen. L-Nio ist nicht direkt zytotoxische und die Selected Dosis von vorläufigen Dosiseskalations Experimenten bestimmt wurde (Daten nicht gezeigt). Der hintere abgewinkelte Ansatz wurde genau unterschnittenen Axone aus primären motorischen Kortex Herstellung des maximalen Verhaltensdefizit zu mehr entwickelt, die auf der weißen Substanz Verletzungen zurückgeführt werden kann. Der mediale abgewinkelte Ansatz Schäden auch Cortex Axone Motor, sondern erstreckt sich auf mehr seitlich und beinhaltet Axone primären sensorischen Kortex zugrunde liegen.

Der Hub Läsion dehnt sich ziemlich schnell über die ersten 24 Stunden. Von sieben Tagen ist die Größe des Infarkts maximal, und wir haben keinen signifikanten Läsion Wachstum über der Zeit beobachtet. Zusätzliche zelluläre Ereignisse und axonale Degeneration wird jenseits dieser Anfangsphase auftreten, aber die Infarktgröße, wie durch die nekrotischen Kern gemessen nicht wesentlich in der Abwesenheit von jeglichen Eingriff ändern.

Co-Injektion von neuroanatomischen Tracer bei der Schlaganfall identifiziert Neuronen ischämischen axonalen Schädigung erfährt. Entweder mit der medial oder hinteren abgewinkelten Ansatz bleiben die neuronalen Zellkörpern mit beschädigten axonalen Projektionen unversehrt. Dadurch entsteht ein nützliches Modell die Wirkung von ischämischen Axotomie auf das zentrale Nervensystem Neuronen zu untersuchen. Wir haben in erster Linie Rück Tracer einschließlich Dextran Amin und Fluorogold eingesetzt, die sowohl eine ausgezeichnete Aufnahme zeigen durch Schlaganfall geschädigte Axone. Durch die große Vielfalt an transgenen Einsatz und Knock-out Mauslinien, Benutzer dieses Protokolls kann die spezifische Rolle der neuronalen Gene untersuchen in der weißen Substanz Schlaganfall Verletzung Reaktion und Reparatur beteiligt.

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Disclosures

Keiner

Acknowledgements

SN und MDD erhielt Unterstützung von NIH K08 NS083740 und der UCLA Klinik für Neurologie. AJG dankt für die Unterstützung durch die Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation und der Larry L. Hillblom Foundation. KLN dankt Unterstützung von der American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher Stroke Center. ILL, EGS und STC wurden von NIH R01 NS071481 unterstützt. JDH dankt für die Unterstützung von NIH K08 NS083740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

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References

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