शाही सेना के विश्लेषण के लिए मानव प्रोस्टेटिक उपकला के लेजर कब्जा Microdissection

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Lugli, G., Kataria, Y., Richards, Z., Gann, P., Zhou, X., Nonn, L. Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis. J. Vis. Exp. (105), e53405, doi:10.3791/53405 (2015).

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Abstract

Introduction

प्रोस्टेट ग्रंथि मुख्य रूप से चिकनी मांसपेशियों 1 से बना fibromuscular स्ट्रोमा से घिरा हुआ ग्रंथियों acini में व्यवस्थित स्रावी उपकला से बना एक विषम ऊतक है। बेसल सेल, स्रावी कोशिकाओं, neuroendocrine कोशिकाओं, पारगमन amplifying कोशिकाओं और स्टेम कोशिकाओं 2: उपकला डिब्बे पांच अलग-अलग लेकिन संगठित सेल प्रकार के शामिल है। ल्यूमिनल उपकला कोशिकाओं से पैदा होती है जो प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) में, ग्रंथिकर्कटता के विकास स्ट्रोमल डिब्बे 3 के एक स्पष्ट प्रगतिशील गिरावट का कारण बनता है। इन कारणों के लिए, ऊतक नमूनों पीसीए की हद पर आधारित स्ट्रोमल और उपकला कोशिका प्रकार के अनुपात में स्पष्ट मतभेद होगा। इन मतभेदों को वांछित सेल प्रकार की microdissection के संबंध के बिना पूरे ऊतकों से प्राप्त कर लिया डाटा जीन की अभिव्यक्ति का पक्षपाती मान्यताओं को जन्म दे सकता है। इसलिए, इस पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए यह पहले शाही सेना निकासी के लिए और सेल प्रकार अलग करने के लिए आवश्यक हैजीन अभिव्यक्ति विश्लेषण।

Macrodissection या microdissection शारीरिक रूप से आसपास के स्ट्रोमा 4 -6 से अच्छी तरह से विशेषता उपकला क्षेत्रों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Macrodissection आम तौर पर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक धार के साथ किया जाता है और बड़े पीसीए स्ट्रोमा से पिंड को अलग करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन स्ट्रोमा आसपास से सौम्य उपकला दूर करने में सक्षम नहीं है (चित्रा 1 में सौम्य प्रोस्टेट ऊतक विज्ञान का उदाहरण देखें)। एक लेजर (एलसीएम) के साथ Microdissection macrodissection की तुलना में काफी अधिक श्रम गहन है, लेकिन बहुत सही सौम्य उपकला 4 काटना कर सकते हैं।

हमारी प्रयोगशाला से हाल के प्रकाशनों आरएनए सफलतापूर्वक formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) बायोप्सी या फ्रोजन ऊतक 4,7-9 से या तो एलसीएम से निकाला जा सकता है कि पता चला है। एलसीएम शाही सेना निकासी में प्रमुख चुनौतियों आर 1) सही ऊतक के वांछित क्षेत्रों टुकड़े करना, और 2) को बनाए रखने के लिए कर रहे हैंएलसीएम और अलगाव की प्रक्रिया 4,10 दौरान एनए अखंडता। शुद्ध सेल आबादी से पृथक शाही सेना रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) 7,8, माइक्रोएरे 11, और गहरी -sequencing 12-14 सहित कई तरीकों से जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के बहाव के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए जमे हुए ऊतकों से एलसीएम प्रोस्टेटिक उपकला से कुल शाही सेना को अलग करने के लिए है।

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Protocol

इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल सभी मानव ऊतकों शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड को मंजूरी दी प्रोटोकॉल और / या छूट के माध्यम से हासिल किया गया।

1. धारा ताजा जमे हुए प्रोस्टेट कलम-स्लाइड पर और आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर

  1. एक दिन पहले या कुछ घंटों नमूना सेक्शनिंग पहले, स्वच्छ उपकरण (यानी, ब्रश, संदंश, coplins, ब्लेड, पेन फंसाया स्लाइड (नहीं तो पहले से ही RNase मुक्त), एक ETOH सुरक्षित मार्कर और एक पेंसिल) और एक के अंदर एक स्प्रे बोतल और प्रयोगशाला-पोंछे का उपयोग कर समाधान-decontaminating RNase साथ आर टी cryostat।
    1. RNase-decontaminating समाधान, दूर पोंछते से पहले 5 मिनट के लिए बैठते हैं और समाधान (depcH 2 0 के साथ तैयार) 70% EtOH के साथ अंतिम कुल्ला RNase-decontaminating पर छोड़ दिया हटाने के लिए depcH 2 0 से कुल्ला करने की अनुमति दें।
      नोट: यह एक RNase मुक्त कार्यक्षेत्र बनाए रखने के लिए आवश्यक है। सभी coplins, उपकरण, जमे हुए बढ़ते मध्यम, ब्लेड और इस्तेमाल स्लाइड RNase मुक्त काम के लिए ही इस्तेमाल किया जाना चाहिएऔर एक मानक गैर RNase मुक्त वातावरण में इस्तेमाल कभी नहीं किया। सभी उपकरणों प्रत्येक प्रयोग से पहले एक RNase परिशोधन समाधान के साथ इलाज किया जाना चाहिए।
  2. -24 डिग्री सेल्सियस के लिए कूल cryostat।
  3. प्रायर सेक्शनिंग करने के लिए कम से कम 30 मिनट शांत करने के लिए cryostat अंदर निम्न साफ ​​RNase मुक्त उपकरणों प्लेस: स्लाइड Coplin से भरे 100% इथेनॉल, उपकरण, छोटे जमे हुए ऊतक कैसेट और बढ़ते चक के साथ।
  4. परिवहन के लिए एक सूखी बर्फ से भरे फोम बाल्टी में cryostorage और जगह से जमे हुए प्रोस्टेट ऊतक निकालते हैं। कम से कम 30 मिनट के लिए तापमान Cryostat को संतुलित करने के लिए cryostat में ऊतक रखें।
    नोट: लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदन के लिए मानव प्रोस्टेट ऊतकों ताजा जमे हुए या तो किया जा सकता आयल एम्बेडेड (FFPE) formalin-तय की। समय की कमी और स्लाइड तैयारी ऊतक स्रोतों के बीच थोड़ा अलग हैं। यहाँ हम जमे हुए वर्गों के लिए कदम का वर्णन।
  5. एक समय में एक ऊतक के साथ काम करते हैं, और Botto में जमे हुए बढ़ते मध्यम धारकैसेट का मीटर और जल्दी ठंडा संदंश का उपयोग जमे हुए बढ़ते मध्यम में जमे हुए प्रोस्टेट ऊतक माउंट।
  6. जमे हुए बढ़ते मध्यम स्थापित करने के लिए 5 मिनट के लिए cryostat में चिलर पर ऊतक के साथ कैसेट रखें।
  7. चक पर जमे हुए बढ़ते मध्यम की एक छोटी राशि धार और ध्यान से जमे हुए बढ़ते मध्यम पर ऊपर घुड़सवार ऊतक नीचे की ओर दबाएं। 5 मिनट के जमे हुए बढ़ते मध्यम पूरी तरह से जमना करने के लिए अनुमति देने के लिए के लिए cryostat में स्थापित करते हैं।
  8. धारक में चक रखें और कस लें।
  9. बंद की स्थिति में संभाल ताला और cryostat पर एक नया ब्लेड जगह है। एक प्रवर्धन कदम भी शामिल है कि नीचे की ओर आणविक endpoints के लिए (यानी, qPCR) यह प्रदूषण को रोकने के (या अगले नमूना के लिए ब्लेड के क्षेत्र का उपयोग करने के लिए खत्म ब्लेड चाल) के लिए प्रत्येक रोगी के लिए एक नया ब्लेड का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।
  10. संभाल अनलॉक और ध्यान से भी करने के लिए हाथ से या एक पैर पेडल के साथ ऊतक अग्रिम और 50 μ साथ ऊतक का पर्दाफाशवांछित ऊतक जोखिम जब तक मीटर वर्गों तक पहुँच जाता है।
  11. , 5 माइक्रोन के cryostat समायोजित एक या दो वर्गों में कटौती और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला के लिए शुल्क लिया गिलास स्लाइड पर उन्हें जगह (चरण 2 देखें)।
  12. इसके तत्काल बाद 2 मिनट के लिए ठंडे 100% इथेनॉल में स्लाइड जगह।
  13. इथेनॉल से चार्ज गिलास स्लाइड निकालें और एच एंड ई धुंधला (चरण 2) के लिए आगे बढ़ने से पहले आरटी पर इसे सूखा।
  14. एक फ्रेम समर्थक पर आर टी कलम-फ्रेम स्लाइड रखें।
  15. आर टी कलम फ्रेम स्लाइड पर 10 माइक्रोन और जगह वर्गों के लिए cryostat समायोजित करें। एक से चार वर्गों ऊतक आकार के आधार पर प्रत्येक स्लाइड पर जगह हो सकती है।
  16. इसके तत्काल बाद 2 मिनट के लिए ठंडे 100% इथेनॉल में स्लाइड उतर रही है।
  17. इथेनॉल से कलम-फ्रेम स्लाइड्स निकालें और एलसीएम के लिए तैयार है जब तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक desiccator बॉक्स में एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड की दुकान। तीन दिन इष्टतम आरएनए वसूली के लिए अधिकतम भंडारण का समय है।
  18. आरोप लगाया गिलास गिरावट के लिए ही चरण 2 के साथ आगे बढ़ेंई। कलम-फ्रेम स्लाइड के लिए चरण 3 के साथ आगे बढ़ें।

2. Hematoxylin और Eosin-वाई (एच एंड ई) ऊतकीय मार्क-अप के लिए दाग

नोट: यह आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर ऊतक और नहीं एलसीएम के लिए कलम-फ्रेम स्लाइड के लिए है।

  1. इस प्रकार के रूप में वर्गीकृत इथेनॉल के माध्यम से स्लाइड सूई का आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर वर्गों हाइड्रेट: 3 मिनट और दो के लिए 70% इथेनॉल में एक बार, 3 मिनट के लिए, 3 मिनट के लिए स्लाइड 95% इथेनॉल में दो बार 100% इथेनॉल में दो बार डुबकी 3 मिनट के लिए आसुत एच 2 ओ में कई बार।
    1. 99 मिलीलीटर 70% इथेनॉल + 1 मिलीलीटर 1% एचसीएल और 0.1% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान: 100 मिलीलीटर में 0.1 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट आसुत एच 2 ओ एसिड शराब समाधान तैयार
  2. 5 मिनट के लिए Hematoxylin गिल द्वितीय (0.4%) में स्लाइड डुबकी।
  3. 3 मिनट के लिए स्थिर चल रहा है नल एच 2 ओ में अतिरिक्त दाग धो लें।
  4. स्लाइड एसिड शराब में 10 बार डुबकी
  5. 3 मिनट के लिए नल एच 2 ओ चलाने में स्लाइड धो लें।
  6. स्लाइड डुबकी0.1% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान में 30-60 सेकंड नीले रंग के लिए बैंगनी रंग बदलने के लिए।
  7. 3 मिनट के लिए नल एच 2 ओ चलाने में स्लाइड धो लें।
  8. 10 गिरावट के साथ 95% इथेनॉल में स्लाइड कुल्ला।
  9. 15 सेकंड के लिए कुल Eosin वाई 2-3 बार में स्लाइड डुबकी।
  10. इस प्रकार के रूप में वर्गीकृत इथेनॉल के माध्यम से स्लाइड निर्जलीकरण: xylene में स्लाइड 95% इथेनॉल में दो बार, 100% इथेनॉल में दो बार, और दो बार डुबकी (ऊतक पूरी तरह निर्जलीकरण इंगित करता है जो स्पष्ट दिखाई देता है सुनिश्चित करें)।
  11. गैर जलीय स्थायी कठिन बढ़ते मध्यम और कवर पर्ची के साथ स्लाइड।
  12. 30 मिनट के लिए स्लाइड शुष्क करते हैं।
  13. किसी भी पूरे स्लाइड स्कैनर के साथ स्कैन स्लाइड और 8 "x 11" कागज पर एक बड़े, उच्च संकल्प छवि को मुद्रित।
  14. ब्याज की रूपरेखा क्षेत्रों एक मार्कर के साथ (आमतौर पर एक बोर्ड प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा किया गया)। इस मार्कअप एलसीएम प्रक्रिया के लिए गाइड है।

कलम-फ्रेम स्लाइड 3. Toluidine नीले धुंधला

नोट: गुएलसीएम रूप में एक ही दिन किया जाता है। सभी समाधान के लिए depcH 2 हे पानी का प्रयोग करें। RNase मुक्त क्षेत्र में सभी चरणों को पूरा करें। सभी coplins RNase-decontaminating समाधान के साथ साफ किया जाना चाहिए।

  1. एलसीएम के दिन 2 मिनट के लिए फिर 2 मिनट के लिए 90% EtOH में धीरे सूई स्लाइड से 75% EtOH -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और हाइड्रेट से कलम-फ्रेम स्लाइड को हटा दें।
    1. तब आरटी पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से बाँझ को फिल्टर आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी में भंग करके 0.5% toluidine नीले तैयार करें। यह समाधान अप करने के लिए 6 महीने के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है। नोट: यह अत्यधिक से पहले छानने में कुछ घंटे लग सकते हैं के रूप में करने के लिए समाधान तैयार करने की सलाह दी है।
  2. धीरे 5-30 सेकंड के लिए 0.5% toluidine नीले रंग में स्लाइड सूई से प्रोस्टेट ऊतक दाग। धोने से ऊतक 3 मिनट 30 सेकंड के लिए 75% EtOH के द्वारा पीछा किया 15 सेकंड के लिए depcH 2 ओ में 2 बार स्लाइड Destain। नोट: दाग और destain बार अच्छे धुंधला सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। प्रोस्टेट दाग खत्म हो जाता है।

4. लेजर कब्जा माइक्रो-विच्छेदन (एलसीएम)

  1. एलसीएम, 15 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म एक स्लाइड पर सूखी स्लाइड के तुरंत पहले। संसाधित और उनके लिए तैयार है जब तक बर्फ पर आराम से स्टोर किया जाएगा कि सूखी केवल स्लाइड।
  2. एलसीएम और कंप्यूटर, इस क्रम में माइक्रोस्कोप शक्ति, लेजर कुंजी, लेजर स्विच और उसके बाद कंप्यूटर को चालू करें। लेजर Microdissection सॉफ्टवेयर लॉन्च।
  3. स्लाइड और संग्रह ट्यूब लोड करने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। फिर "जारी रखें" पर क्लिक करें, "अनलोड नमूना धारक" पर क्लिक करें नीचे का सामना करना पड़ ऊतक के साथ खुर्दबीन स्लाइड धारक पर वर्गों के साथ स्लाइड लोड और माइक्रोस्कोप में उचित स्लॉट में स्लाइड धारक डालें।
    1. "अनलोड संग्रह ट्यूब", लेबल पर क्लिक करें और ट्यूब धारक पर 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों लोड और साधन में उचित स्लॉट में डालें। एक बारटोपियां संग्रह टोपियां lysis बफर के 35 μl जोड़ने और बुलबुले से बचने की कोशिश, सुरक्षित हैं। फिर "ठीक" पर क्लिक करें।
      नोट: 25 μl lysis बफर 10 μl depcH2O साथ: वाष्पीकरण एक मुद्दा है, तो आप निम्नानुसार बफर पतला।
  4. सॉफ्टवेयर में, स्लाइड स्लाइड धारक में रखा गया है, जहां स्थिति का चयन करें। एलसीएम नमूना एकत्र करने के लिए संग्रह टोपी का चयन करें।
  5. कल्पना और 10X में कंप्यूटर के माध्यम से स्लाइड ध्यान केंद्रित। फिर "जांचना" "लेजर" का चयन करके लेजर जांच करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। लेजर बीम पूरी तरह से और कुशलता से चयनित क्षेत्र में कटौती करने की अनुमति देने के लिए लेजर की शक्ति, एपर्चर और गति का चयन, "लेजर" फिर "नियंत्रण" समायोजित करें। पूरी तरह से ऊतकों के माध्यम से लेजर कटौती जब तक समायोजन दोहराएँ।
  6. एक गाइड के रूप में 8 "x 11" रोगविज्ञानी मार्क-अप का उपयोग करना, epithe के वांछित क्षेत्रों प्रतिबंध लगाना करने के लिए "आकार आकर्षित" उपकरण का उपयोगदृश्य में lium और किसी भी स्ट्रोमा संग्रह से बचने के।
    कई क्षेत्रों में एक दृश्य के भीतर चयनित किया जा सकता है, लेकिन "आकार में कटौती" उपकरण पर क्लिक करके पहली काटने के बिना दूसरे को देखने के लिए कदम नहीं है: ध्यान दें।
    1. एक क्षेत्र पूरी तरह से लेजर द्वारा काट नहीं मिलता है तो स्वयं इसे ऊपर जाने के लिए "के लिए कदम और कटौती" उपकरण का उपयोग करें। नए विचारों के उद्देश्य चलती जारी रखें और स्लाइड पूरी तरह से विच्छेदित है या ऊतक के वांछित राशि एकत्र की गई है जब तक लेजर काटने दोहराने (आमतौर पर 100 सौम्य ग्रंथियों शाही सेना के 150-500 एनजी उपज)। (चित्रा 1 ए में उदाहरण देखें)।
  7. ध्यान से टोपी में lysis बफर और ऊतकों के प्रति जागरूक किया जा रहा है, संग्रह धारक से ट्यूबों निकालें और टोपी को बंद करें। संक्षेप में ट्यूब के नीचे में तरल और ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र। शाही सेना के अलगाव के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए और दुकान के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।

फील साथ 5. कुल शाही सेना अलगावआतंकवाद आधारित किट और गुणवत्ता विश्लेषण

  1. बर्फ पर ट्यूबों का पहले गला लें और 100 μl करने के लिए समाधान की मात्रा लाने के लिए।
  2. फिल्टर के केंद्र के लिए 30 μl ofLysis समाधान को लागू करने से एक शाही सेना अलगाव किट का सूक्ष्म फिल्टर पूर्व गीला है और इसे अगले दो चरणों (कम से कम 5 मिनट) whileperforming सोख करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. Lysate (किट में प्रदान की) एलसीएम Additive समाधान के 3 μl जोड़ें और 5 सेकंड के लिए vortexing द्वारा मिश्रण। ट्यूब के नीचे तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. तरल निकालने के लिए ऊपर की गति पर 30 सेकंड के ~ लिए पूर्व गीला फिल्टर अपकेंद्रित्र।
  5. ऊपर और नीचे धीरे, lysate मिश्रण करने के भंवर या पिपेट 100% इथेनॉल (इस मामले में 129 μl में) 1.25 मात्रा में जोड़ें। ** इस विधि से बड़े और छोटे आरएनए प्रजातियों दोनों ठीक हो जाएगी।
  6. 1 मिनट फिल्टर करने के लिए शाही सेना को बाध्य करने के लिए 10,000 XG पर पूर्व गीला सूक्ष्म फिल्टर पर नमूना, और सेंट्रीफ्यूज लोड करें। फिर धो समाधान 1, आर 'के 180 μl के साथ सूक्ष्म फिल्टर धोने21; 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: सभी centrifugations पर इस बिंदु 13,000 XG, या अधिकतम गति से किया जाना चाहिए से।
  7. किट प्रोटोकॉल द्वारा निर्देशित के रूप में धो क्रमशः "धो समाधान 2 और 3" के 180 μl के साथ दो बार फिल्टर। अपकेंद्रित्र अवशिष्ट तरल पदार्थ को हटाने के लिए और फिल्टर सुखाने के लिए 30 सेकंड के लिए है, तो के माध्यम से प्रवाह त्यागें, और 1 मिनट के लिए फिल्टर स्पिन।
  8. एक नया संग्रह ट्यूब के लिए फिल्टर स्थानांतरण।
  9. (किट के साथ प्रदान की) -95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म क्षालन समाधान।
  10. फिल्टर के केंद्र के लिए preheated क्षालन समाधान के 10 μl लागू करें, टोपी बंद करने और आरटी पर 5 मिनट के लिए दुकान। तो शाही सेना elute करने के लिए 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और ~ शाही सेना के 20 μl उपज के लिए यह कदम एक बार दोहराएँ।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए DNase मैं उपचार प्रदर्शन।
  12. 260 एनएम पर absorbance के साथ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा शाही सेना यों। 260 एनएम और 280 एनएम के तरंग दैर्ध्य में ऑप्टिकल घनत्व के अनुपात की शुद्धता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैआरएनए 15 (1 टेबल देखें)।

6. जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण

नोट: (mRNAs और lncRNAs) की तरह लंबे आरएनए प्रजातियों के जीन की अभिव्यक्ति चरण 6.1 और कम आरएनए प्रजातियों (microRNAs की तरह) में दिखाया गया है 6.2 कदम में दिखाया गया है। अलग किट RT-qPCR के लिए उपलब्ध हैं और आवश्यक शाही सेना की राशि (10 एनजी के रूप में छोटे रूप में) किट से भिन्न होता है। आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण 6.3 में वर्णित है।

  1. रिवर्स टाइप (आरटी) 5 आरटी मास्टर मिश्रण के μl (आरटी बफर, dNTP के, बिना सोचे समझे प्राइमरों, आरटी एंजाइम, RNase अवरोध करनेवाला) के साथ 20 एनजी के 5 μl / आरएनए नमूना μl मिश्रण सीडीएनए शाही सेना। 37 डिग्री सेल्सियस पर तब 120 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं और 85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट।
  2. RNase मुक्त पानी के साथ आरटी प्रतिक्रिया 01:10 पतला और ब्याज की जीन के लिए प्राइमरों या प्राइमर / जांच सेट के साथ 10 μl qPCR प्रतिक्रिया प्रति 2.5 μl का उपयोग करें।
    नोट: आंशिक रूप से अपमानित शाही सेना के विश्लेषण की सुविधा के लिए इसके लिए प्राइमरों का उपयोग करने की सलाह दी जाती हैआर छोटे amplicons (कम से कम 100 बीपी) 16। (तालिका 2 बी)
    1. MicroRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आर टी मास्टर मिश्रण के 5 μl के साथ 2-10 एनजी के 5 μl / आरएनए नमूना μl मिश्रण से आरटी प्रतिक्रिया चलाते हैं।
      नोट: प्रत्येक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पीसीआर आधारित microRNA का पता लगाने प्रौद्योगिकी मालिकाना और विशिष्ट आरटी प्राइमरों के उपयोग की आवश्यकता है।
  3. वैकल्पिक रूप से या आरटी पीसीआर के अलावा, आरएनए की विभिन्न प्रजातियों यों की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (आरएनए-सेक या छोटे-आरएनए-सेक) का उपयोग करें। आमतौर पर, इस प्रक्रिया (3 टेबल) के लिए शाही सेना के 500 एनजी का उपयोग करें और निर्माता और पता लगाने के साधन के संकेत के रूप विधि बाहर ले।

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Representative Results

पिछले एक अध्ययन में हम एक ही मरीज ​​को 4 से जमे हुए हैं और FFPE प्रोस्टेट ऊतकों से mRNA और microRNAs की RT-qPCR द्वारा अभिव्यक्ति की रूपरेखा तुलना करने के लिए उपकला और स्ट्रोमल ऊतकों को इकट्ठा करने के एलसीएम के उपयोग का प्रदर्शन किया। एलसीएम शाही सेना की बड़ी राशि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा रहा है, खासकर अगर समय लगता है। इसलिए, यह काम अंतरिक्ष रखने के लिए महत्वपूर्ण है और उपकरण मुक्त RNase। यह (अगले पैराग्राफ में अधिक विस्तार से चर्चा) एकत्र शाही सेना में गुणवत्ता और सेल विशिष्टता नियंत्रण की जांच करने के लिए सिफारिश की है। चित्रा 1 से पहले और लेजर कब्जा सौम्य उपकला के बाद खुर्दबीन के नीचे एक कलम-फ्रेम स्लाइड पर एक दाग प्रोस्टेट खंड से पता चलता है ।

नमूना एकत्र किया जाता है और आरएनए ध्यान से निकाले जाने के बाद, यह तालिका 1 में दिखाया गया है आरएनए गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह कम 260/280 एनएम अनुपात निरीक्षण करने के लिए असामान्य नहीं है। आरएनए होगा ध्यान दे260/280 एनएम अनुपात में सुधार है, लेकिन यह भी छोटे आरएनए प्रजातियों की हानि हो सकती है। गुणवत्ता नियंत्रण करने के लिए इसके अलावा, यह ऊतक (- सी चित्रा 1 बी) के लेजर कब्जा कर क्षेत्र की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए सेल प्रकार विशिष्ट नियंत्रण की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, चित्रा 1 बी में AMACR जीन की अभिव्यक्ति सामान्य उपकला ऊतक की तुलना में प्रोस्टेट कैंसर उपकला ऊतक पुष्टि करने के लिए मापा गया था ,. चित्रा 1C में NKX3.1 की अभिव्यक्ति एलसीएम-एकत्र नमूने में स्ट्रोमा के अभाव की पुष्टि की। नमूना में शाही सेना की गुणवत्ता में भी जाना जाता है, अच्छी गुणवत्ता की शाही सेना के शाही सेना के compareed जा सकता है। आरएनए निकाले लंबे और छोटे आरएनए (तालिका 2) की गुणवत्ता की पुष्टि, सुसंस्कृत प्राथमिक उपकला कोशिकाओं से एकत्र रूप में एलसीएम-collected- ऊतक से अलग आरएनए के लिए RT-qPCR सीटी मूल्यों एक ही रेंज में हैं। अन्त में, 3 टेबल इस आरएनए अगली पीढ़ी के आरएनए sequenci के लिए पर्याप्त गुणवत्ता का पता चलता है किएनजी।

चित्र 1
चित्रा 1: लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदन के द्वारा मानव प्रोस्टेट से सौम्य उपकला, प्रोस्टेट कैंसर उपकला और स्ट्रोमा के संग्रह से पहले और सौम्य उपकला के एलसीएम-संग्रह के बाद toluidine नीले रंग के साथ दाग (ए) प्रोस्टेट बायोप्सी।। (बी - सी) 45 रोगियों से एलसीएम द्वारा एकत्र ऊतकों सेलुलर पहचान 7 की उचित जीन मार्कर व्यक्त करते हैं। (बी) AMACR प्रोस्टेट कैंसर का एक मार्कर है और कैंसर के ऊतकों में ही पता लगता है। (सी) NKX3.1 उपकला के एक मार्कर है और स्ट्रोमल ऊतकों में पता लगाने योग्य नहीं है। यह आंकड़ा Giangreco एट अल।, JSBMB 2015 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: एलसीएम-एकत्र प्रोस्टेट ऊतक से शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा।

सारणी 2
तालिका 2: RT-qPCR एलसीएम एकत्र प्रोस्टेट सौम्य उपकला से।

टेबल तीन
तालिका 3: एलसीएम-एकत्र प्रोस्टेट ऊतक से RNAseq।

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Discussion

मानव नमूनों से की रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति गुणवत्ता या उपलब्ध ऊतक की मात्रा के लिए, लेकिन यह भी एक दिया ऊतक के नमूने में उपस्थित विभिन्न ऊतकीय संस्थाओं के लिए ही नहीं, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह सौम्य ऊतकों को काफी हद तक स्ट्रोमल ऊतकों और कैंसर के क्षेत्र हैं स्ट्रोमा से रहित हैं जिसमें प्रोस्टेट में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। एलसीएम दो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) के एक अधिक सटीक हस्ताक्षर के लिए प्रोस्टेट स्ट्रोमा और उपकला शाही सेना के भौतिक जुदाई की सुविधा। Macrodissection या पूरे ऊतक प्रसंस्करण की तुलना में, एलसीएम सौम्य ऊतकों में सेल के डिब्बों को अलग हैं, लेकिन काफी अधिक महंगा है और श्रम गहन है सकते हैं।

किसी भी तकनीक के रूप में संभव नुकसान कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, शाही सेना गुणवत्ता प्रारंभिक नमूना खरीद के दौरान या एलसीएम और निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान आंशिक रूप से अपमानित किया जा सकता है। पहले मामले में, जीन अभिव्यक्ति विभिन्न लघु ampl मापने प्राप्त किया जा सकताqPCR द्वारा प्रतीक। दूसरे मामले में, सभी उपकरण और सामग्री की ईमानदार RNase मुक्त उपचार आरएनए गिरावट, साथ ही ऊतक वर्गों के एक सावधान हैंडलिंग और प्रसंस्करण को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, कम से कम 90 मिनट के लिए एक स्लाइड पर बिताए समय को सीमित कर संग्रह की प्रक्रिया के दौरान शाही सेना गुणवत्ता को बनाए रखता है। एलसीएम तकनीक की सबसे बड़ी सीमा एक एलसीएम साधन के लिए उपयोग होता है और एलसीएम करने के लिए आवश्यक श्रम है।

लेजर कब्जा microdissection माइक्रोस्कोप के कई प्रकार के उपलब्ध हैं। इस प्रोटोकॉल तो नीचे एक संग्रह टोपी करने में गिर जाता है जो क्षेत्रों प्रतिबंध लगाना करने के लिए लेजर का उपयोग करता है कि एक एलसीएम के उपयोग का वर्णन। एलसीएम के इस प्रकार के इकट्ठा करने के लिए असतत बहुकोशिकीय क्षेत्रों में शामिल है जो प्रोस्टेट ऊतक में उपकला और स्ट्रोमा के विभाजन के लिए आदर्श है, लेकिन एलसीएम के इस प्रकार के एक ऊतक से अलगाव एक व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल निवासी मैक्रोफेज इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिएएस, neuroendocrine कोशिकाओं या अक्सर एकल कक्षों के रूप में मौजूद हैं, जो घुसपैठ लिम्फोसाइटों। इन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव सुविधा है, जो एक झिल्ली टोपी, पर ऊतक से एकल कक्षों "शूट" करने के लिए एक लेजर का उपयोग कि अन्य एलसीएम के साधन और तरीके हैं।

पूरी तरह से गुणवत्ता नियंत्रण और आरएनए के लक्षण वर्णन अनदेखा नहीं किया जा सकता है। 260 एनएम पर absorbance RT-qPCR अध्ययन (1 टेबल) के लिए आरएनए यों के लिए उपयुक्त है, लेकिन शाही सेना अनुक्रमण अधिक सही एक डाई आधारित पद्धति के लिए आरएनए quantifies। आर टी-qPCR विश्लेषण में एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा अवशिष्ट डीएनए संदूषण से संभावित पूर्वाग्रह से बचना है। इस इंट्रोन्स कि अवधि प्राइमरों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। वहाँ नौकरानी जीन अभिव्यक्ति में उच्च रोगी विविधता इसलिए कई नौकरानी जीन का उपयोग करते हैं, यह भी सुझाव दिया है और हम आम तौर पर तीन 4,7-9 से पांच का उपयोग (चित्रा 1 बी - सी और तालिका 2)।

4 कम हो रही शाही सेना के एक अपेक्षाकृत छोटी राशि की आवश्यकता है। अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण दोनों छोटी और लंबी आरएनए प्रजातियों के लिए अभिव्यक्ति यों के लिए एक प्रभावी तकनीक है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण भी उपन्यास आरएनए प्रजातियों 13 की खोज की अनुमति देता है। सौभाग्य से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की लागत घट रही है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल जमे हुए प्रोस्टेट ऊतक से उपकला या stromal कोशिकाओं के सजातीय आबादी की शाही सेना अलगाव में सक्षम बनाता है। आरएनए सौम्य और रोगग्रस्त प्रोस्टेट में सटीक सेल प्रकार विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के लिए एक उपकरण प्रदान करने के लिए कई बहाव के विश्लेषण तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आंकड़ों के इस प्रकार के ज्ञान को एक करने के लिए योगदानशाही सेना अभिव्यक्ति रोग विकृति में कैसे अलग है की घ समझ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNase-AWAY  MBP 7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides  Leica 11600289
Glass slides, Superfrost Plus FisherBrand 12-550-15
Ethanol 200 proof Decon labs. 2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate) Sigma D-5758
Cryostat Leica CM3050
Coplins (Staining jar) IHCWORLD M900-12
Coplins (Staining rack) IHCWORLD M905-12
Aperio ScanScope Aperio(Leica) ScanScope® CS
Toluidine Blue Fluka 89640-5G
Laser Microdissection System Leica LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM Thermo Scientific AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit Ambion AM1931 Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop Thermo Scientific ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32866 Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814 Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns Exiqon 203301
TaqMan microRNA RT kit Applied Biosystems 4366597 Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain  Ricca Chemical Company 3536-16
Eosin-Y Richard Allan Scientific  7111

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References

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