Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Immunology and Infection

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Wunsch, C. M., Lewis, J. P. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (106), e53408, doi:10.3791/53408 (2015).

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Abstract

As bactérias anaeróbicas longe superam os aeróbios em muitos nichos humanos, tais como o intestino, boca e vagina. Além disso, infecções anaeróbias são comuns e frequentemente de origem indígena. A capacidade de alguns agentes patogénicos anaeróbios de invadir células humanas lhes dá as medidas de adaptação para escapar imunidade inata, bem como para modular o comportamento da célula hospedeira. No entanto, assegurar que as bactérias anaeróbias são vivo durante a investigação experimental dos eventos pode representar desafios. Porphyromonas gingivalis, um anaeróbio Gram-negativos, é capaz de invadir uma variedade de células não fagocíticas eucarióticas. Este artigo descreve como para com êxito a cultura e avaliar a capacidade do P. gingivalis de invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Dois protocolos foram desenvolvidos: um para medir as bactérias que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro, e a outra para visualizar as bactérias que interagem com as células hospedeiras. Estas técnicas requerem a utilização de um anaecâmara para fornecer P. Robic gingivalis com um ambiente anaeróbico para o crescimento ideal.

O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico, que é largamente utilizada para estudar a invasão das células hospedeiras por bactérias. No entanto, o ensaio de protecção de antibiótico é limitada; apenas bactérias intracelulares que são cultiváveis ​​após o tratamento antibiótico e a lise da célula hospedeira são medidos. Para avaliar todas as bactérias interagem com células hospedeiras, tanto vivos e mortos, desenvolvemos um protocolo que utiliza a microscopia fluorescente para examinar interação patógeno-hospedeiro. As bactérias são marcado por fluorescência com 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetoximetil éster (BCECF-AM) e utilizados para infectar células eucarióticas em condições anaeróbias. Após fixação com paraformaldeído e permeabilização com 0,2% de Triton X-100, as células hospedeiras são marcados com TRITC-faloidina e DAPI para marcar o citoesqueleto da célula e do núcleo, respectivamente. Multiple images tomadas em diferentes pontos focais (Z-stack) são obtidos para visualização temporal e espacial das bactérias. Os métodos usados ​​neste estudo pode ser aplicada a qualquer bactéria anaeróbia cultiváveis ​​e qualquer tipo de célula eucariótica.

Introduction

As bactérias anaeróbicas colonizar quase todas as superfícies do corpo humano. Embora predominante na flora do trato intestinal e genito-urinário, onde as concentrações de oxigênio são baixos, eles também existem em níveis elevados na pele, boca, nariz e garganta 1. As bactérias anaeróbicas são uma causa comum de infecções endógenas e frequentemente são isoladas de sítios doentes. No entanto, devido à sua natureza fastidiosa, anaeróbios podem ser difíceis de isolar e cultivar. Estudos envolvendo bactérias anaeróbias deve ser feito sob condições restritas. Técnicas anaeróbio-cultura moderna permitem aos pesquisadores para imitar as configurações anaeróbias necessárias para estudar muitas cepas laboratoriais anaeróbia ou mesmo isolados clínicos 2,3.

Bactérias anaeróbicas patogénicas têm desenvolvido uma relação dinâmica e co-evolução com as células hospedeiras em que residem. A maioria dos anaeróbios são susceptíveis à morte pela resposta imunitária do hospedeiro antes de atingir infectiníveis OUs. No entanto, algumas bactérias patogénicas desenvolveram mecanismos para escapar ou subverter a resposta imune do hospedeiro. Eles alcançar este objetivo através de mecanismos como a evasão de reconhecimento imunológico, neutralização de mediadores do sistema imunológico, alteração de imunidade mediada por células, invasão de células hospedeiras, e alteração da imunológico sinalizando 4. Porphyromonas gingivalis, uma bactéria anaeróbia Gram-negativo implicado em ambos oral e doenças extra-orais, é um exemplo de um agente patogénico bacteriano altamente adaptado capaz de causar alterações patogénicas no hospedeiro 5-7.

Bolsões de biofilme placa acumulado em fendas profundas formadas entre os dentes e tecido da mucosa gengival pode abrigar bactérias anaeróbias que são protegidos de oxigênio atmosférico 8. Estas bolsas periodontais servir como um nicho para vários patógenos anaeróbicos, como P. gingivalis 9. P. gingivalis é um agente patogénico da distorção que é capaz de remodelaçãoing a comunidade microbiana oral, de forma a promover o desenvolvimento e progressão de doenças periodontais 10. Ela produz um grande número de fatores de virulência que são ativos contra um amplo espectro de proteínas do hospedeiro e fornece mecanismos para a evasão de defesas do hospedeiro 11. É também capaz de invadir epiteliais, endoteliais, fibroblastos e células do ligamento periodontal in vitro e in vivo 12-14 15. Por eficazmente invadir as células hospedeiras, P. gingivalis pode escapar imunidade do hospedeiro. Invasão efectiva de células hospedeiras não só permite que a bactéria de escapar defesas do hospedeiro, mas também serve como um reservatório para o futuro re-infecção, bem como a célula hospedeira altera. São necessários estudos dos mecanismos moleculares envolvidos na adesão e internalização da bactéria por células hospedeiras. Pesquisa em vários laboratórios está focada na compreensão dos eventos moleculares associados com a internalização de P. gingivalis pelas células hospedeirasbem como os mecanismos utilizados para suprimir e sequestrar a resposta imune e sobreviver a mecanismos de defesa do hospedeiro hostis.

Existem muitos ensaios capazes de identificar e caracterizar agentes patogénicos que são capazes de invadir as células hospedeiras. No entanto, estudos in vitro com agentes patogénicos anaeróbios apresentam muitos problemas experimentais para o investigador, principalmente porque é difícil realizar estudos que dependem de instrumentos volumosos, na ausência de oxigénio. Esta situação é agravada pelo fato de que as células eucarióticas necessitam de oxigênio para crescer e, portanto, deve ser preparado separadamente em incubadoras de cultura de tecidos. Uma maneira de evitar tais obstáculos seria realizar os estudos sob o oxigénio atmosférico, mas que iria tornar o crescimento de bactérias anaeróbicas impossível. Outro método seria a utilização de bactérias mortas por calor para infectar e estudar interacções célula-hospedeiro. No entanto, existem diferenças entre as bactérias mortas pelo calor e viáveis ​​que diminuem a relevância do interacti patógeno-hospedeirono dia 16. Ele é central para estudar bactérias viáveis ​​com expressão inalterada interagindo com células hospedeiras; Assim, os métodos para a cultura de P. gingivalis em um ambiente anaeróbico são dadas. Além disso, dois protocolos de baixo custo simples são demonstrados para avaliar a capacidade do P. gingivalis para ser internalizada pelas células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC). O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico populares. Embora o ensaio é simples, as considerações ao usar microrganismos anaeróbios são dadas. O segundo protocolo requer a utilização de um microscópio de varrimento de fluorescência para visualizar a interagir e internalizado P. gingivalis. Cada ensaio tem as suas limitações e vantagens que serão discutidos para fornecer o pesquisador um esboço para estudar a invasão de bactérias anaeróbicas. Embora o manuscrito atual estuda P. gingivalis e HUVEC, estes protocolos podem ser utilizados para muitos outros tipos de bactérias anaeróbicas, bemcomo para outros tipos de células hospedeiras.

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Protocol

Os seguintes protocolos vai descrever métodos para a cultura e estudar a invasão pelas espécies anaeróbicas, P. gingivalis; No entanto, estes protocolos podem ser utilizados para uma série de agentes patogénicos anaeróbios. Embora HUVECs são usados, este protocolo pode ser usado para outras células eucarióticas tanto imunes e não-imunes.

1. Anaerobic Chamber Uso e Manutenção

Nota: P. gingivalis é um anaeróbio sensível aos níveis normais de oxigénio encontradas no ar ambiente. Um ambiente anaeróbio controlado é vital para o cultivo de P. gingivalis.

  1. Aqui, manter uma atmosfera artificial designado como gás anaeróbico misto (80% de N2, 10% de H 2, 10% de CO 2) numa câmara anaeróbia de vinilo (Figura 1A). Usar uma câmara de vácuo (Figura 1B) para a transferência de itens a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. A câmara de compressão opera manualmente, twpurga de gelo com gás N2 antes de introduzir o gás anaeróbico misto.
  2. Utilizar uma coluna de remoção de sulfureto de hidrogénio (Figura 1C) para a remoção livre de manutenção do sulfureto de hidrogénio indesejável. Coloque um desumidificador dentro da câmara para remover H2O criada pelo catalisador e aerossóis para evitar que facilitam a propagação da contaminação.
    Nota: Sulfeto de hidrogênio é um subproduto metabólico natural de muitas bactérias anaeróbias e sua acumulação é tóxica para bactérias e pode resultar em danos à eletrônica e diminuir o tempo de vida de um catalisador.
  3. Utilize uma caixa de ventilador fazer circular a atmosfera da câmara, através de um catalisador de paládio, que remove o oxigénio na presença de hidrogénio (Figura 1D).
    Nota: Uma recirculação atmosférica (HEPA) remove os contaminantes transportados pelo ar com um tamanho de 0,22 mm ou maior.
  4. Cultura de bactérias anaeróbicas num banho a 37 ° C incubadora que está localizado dentro do anaeróbiocâmara. Use técnicas assépticas padrão quando se trabalha dentro da câmara anaeróbia.

figura 1
Figura 1. câmara anaeróbia de vinilo e os seus componentes. (A) uma câmara anaeróbica vinilo selado completamente a partir de oxigénio atmosférico proporciona espaço de trabalho para dois indivíduos de cada vez (32 em x 78 em). Ele contém uma incubadora ajustada a 37 ° C (de volta do meio). (B) Uma câmara de compressão é utilizado para a transferência de objectos a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. Na foto é uma câmara automática operada através de um controlador que pode ser programado para executar automaticamente os procedimentos de vácuo e purga necessários para criar um ambiente anaeróbico. (C) A sulfeto de hidrogênio Coluna Remoção fornece remoção de alta capacidade livre de manutenção de sulfeto de hidrogênio indesejável. (D) Duas caixas de ventilador catalisador sãocolocado ao longo da câmara anaeróbica para ajudar a circular a atmosfera da câmara, através do catalisador paládio, o qual, na presença de hidrogénio, remove o oxigénio. A câmara anaeróbia é configurado de acordo com as instruções do fabricante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação de bactérias anaeróbicas

Nota: P. gingivalis é aerotolerant e pode ser armazenado em condições aeróbias mas não crescerão na presença de oxigénio em níveis mais elevados do que 6% 17,18. Uma câmara de anaerobiose é necessária para o cultivo adequado de P. gingivalis e outras espécies anaeróbicas (Figura 1). Formação adequada e educação sobre o uso anaeróbio câmara é necessária antes de trabalhar com microanaerobes 19.

  1. Equilibrar todos os meios líquidos e placas para condit anaeróbioiões durante pelo menos 12 horas antes da experimentação para remover o oxigénio residual.
  2. Transferir P. gingivalis de -80 ° C freezer para câmara anaeróbia, deixe descongelar.
  3. Streak P. gingivalis em placas de ágar sangue de tripticase de soja (TSA II com 5% de sangue de carneiro). Enrole placas em parafilme e armazenar a 37 ° C numa incubadora anaeróbica durante 4-7 dias.
  4. Inocular P. gingivalis em 3 ml de infusão cérebro coração (BHI) suplementado com hemina e menadiona, um meio líquido enriquecido não selectivos para o isolamento e cultivo de anaeróbios e microorganismos exigentes, usando loops estéreis.
    Nota: Para armazenamento a longo prazo, misturar culturas bacterianas preparados em BHI com glicerol ou DMSO (concentração final de 10-20%) e colocar num congelador de -80 ° C.
  5. Prepare uma cultura inicial de P. gingivalis, fazendo uma diluição de 1:10 e permitindo que as bactérias a crescer até fase mid-log.

Nota: A densidade óptica da BACterial de suspensão é determinada e a concentração de bactérias para cada estirpe a ser examinada é ajustado. Para P. gingivalis uma suspensão a DO660 de 0,7 corresponde à fase mid-log e 7 x 10 ~ 8 células / ml. As condições de crescimento descritas no protocolo acima são específicos para P. gingivalis e pode precisar ser adaptado para outras estirpes bacterianas.

3. endotelial Cultura de Células

Nota: Compra HUVEC reunidas primárias e cultura em meio basal contendo factores de crescimento endotelial vascular (VEGF), a 37 ° C em 5% de CO 2 de acordo com as instruções do fabricante.

  1. HUVECs de sementes em frascos T-75 em 2.5 x 10 5 células / balão em 15 ml de mídia VEGF.
    Nota: Verificar a viabilidade através de uma diluição de 1: 1 com 4,0% de azul de tripano. As células com uma membrana comprometida manterá azul de tripano, as células saudáveis ​​com membranas íntegras aparece branco quando visto sob uma luz microscópio binocular. Councélulas T 100, garantir que mais de 80% das células são viáveis ​​20.
  2. Substituir mídia a cada 2 dias com a mídia VEGF fresco pré-aquecido até que as células chegar a ~ 80% de confluência.
  3. Lave as células uma vez com PBS, pré-aquecido. Libertar células do frasco T75 por incubação com 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de solução de 2 ml de tripsina de neutralização.
  4. Recolhe HUVEC suspensas num tubo cónico de 50 ml. Lavar as células extras a partir de frascos T-75 com PBS e transferir para tubos de 50 ml cônico.
  5. Centrifugar células a 200 xg durante 10 min.
  6. Remover o sobrenadante, suspende sedimento celular em 10 ml de meio de VEGF pré-aquecido.
  7. Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro ou dispositivo de contagem de células semelhantes.
  8. Calcular quantidade de suspensão de células para adicionar a qualquer placa de 6 poços (400.000 / poço) ou placa de 12 poços com lamelas (50.000 / poço). HUVECs estará pronto para a experimentação no dia seguinte.

4. Survival ensaio de invasão / Interação(Chapeamento)

Nota: Quando a realização deste ensaio, preparar duas placas de 6 poços de células endoteliais semeadas a 400.000 células / poço. Uma placa será usado para avaliar bactérias aderidas para e internalizadas pelas células hospedeiras. A outra placa serão responsáveis ​​por bactérias intracelulares. A placa de 6 poços permite triplicados de duas amostras para ser executado em um experimento. Para um esboço deste protocolo por favor consulte o fluxograma ensaio de sobrevivência (Figura 2).

  1. Prepare bactérias anaeróbicas, como descrito acima (ver secção 1) até atingirem crescimento mid-log (DO660 0,5-0,7).
  2. Bactérias centrifugar a 5000 xg durante 10 min.
    Nota: Se centrífuga é câmara anaeróbia fora, transportar amostras bacterianas em um tubo de 15 ml hermeticamente fechado, enrole a tampa com parafilme para evitar o vazamento de oxigênio.
  3. Coloque peletizada P. gingivalis de volta na câmara, elimine o sobrenadante. Lavar com PBS, as bactérias da pelota de novo antes de ressuspensão em VEGF-media. Preparar suspensões para todas as estirpes bacterianas a ser testado em OD 660 de 0,7 o que corresponde a fase mid-log (~ 7 x 10 8 culas / ml). As bactérias estão agora prontos para a infecção.
  4. Transferência de placas de 6 poços contendo células HUVEC incubadora de cultura de tecidos a partir de dentro da câmara anaeróbia. Remova a mídia e lavar três vezes com PBS anaeróbio. Adicionar 2 ml de meio anaeróbio VEGF a cada poço e colocar as placas a 37 ° C na incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar a temperatura durante a infecção.
    Nota: as bactérias da placa em placas de agar de sangue para garantir que as utilizadas para a infecção são homogêneas e não contaminada por infecção.
  5. Infectar as células hospedeiras com as bactérias a uma multiplicidade de infecção (MOI: bactérias hospedeiras) de 100: 1.
    Nota: o número de células HUVEC é determinada através da realização de um teste de exclusão de tripano num único poço antes da infecção. O número de células bacterianas é determinada por meio da densidade óptica (por exemplo, OD de 0,5 x 10 5 = 8 células / mL). Bacterial concentração é ajustada para MOI adequado com base na concentração HUVECs 21.
  6. Coloque placas de 6 poços com células HUVEC infectados na incubadora anaeróbica e permitir que as bactérias para interagir com as células hospedeiras durante 30 min.
  7. Prepare saponina em BHI (1,0% w / v) dentro da câmara de anaerobiose e filtrar através de um filtro de 0,2 um.
  8. A sobrevivência de ambas as bactérias aderidas e internalizadas.
    1. Retirar as placas do incubador, meios aspirado, lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de filtrado de 1,0% de saponina (preparada tal como descrito no passo 4.8). Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira.
    2. Raspe fundo de cada poço com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer uma diluição a 1: 1 em BHI.
    3. Proceder para fazer diluições em série das amostras. Dependendo da espécie e da concentração bacteriana, ajustar as diluições em série. Comece com 1: 100 ou 1: 1.000 diluições.
    4. Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Envoltório tele placas em parafilme e lugar na incubadora anaeróbica a 37 ° C.
    5. Na sequência de sete dias de incubação a 37 ° C, retire as placas e contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) usando uma caixa de luz para contar manualmente colônias.
      Nota: as UFC são enumerados. Para maiores quantidades de CFUs, as imagens podem ser tomadas e software de computador pode ser utilizado para facilitar a contagem de CFU.
  9. A sobrevivência das bactérias internalizadas.
    1. Retirar as placas do incubador. Lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de VEGF meios suplementados com antibióticos (300 ug / ml de gentamicina e 400 ug / ml) de metronidazol.
    2. Incubar durante 1 h. Certifique-se de testar os antibióticos assim que eles são 100% eficaz em matar a estirpe bacteriana desejada e certifique-se de que eles não penetram células do hospedeiro 22,23.
    3. Aspirar a mídia, adicione 2 ml de filtrado 1,0% de saponina. Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira.
    4. Raspe fundo de cada poçol com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer diluição 1: 1 em BHI.
    5. Preparar diluições em série da amostra (1: 100, 1: 1000).
    6. Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Embrulhe em filme plástico e placas lugar na incubadora anaeróbica.
    7. Depois de sete dias de incubação a 37 ° C, remover as placas e contagem de UFC.

Figura 2
Figura 2. Representação esquemática de um protocolo usado para a sobrevivência de bactérias anaeróbias com células eucarióticas. Ambos os ensaios para a sobrevivência bacteriana total e sobrevivência de bactérias internalizadas pode ser realizada ao mesmo tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Interiorização de bactérias em Ce Anfitriãolls (Microscopia fluorescente)

Nota: P. gingivalis é rotulado com 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, éster acetoximetílico (BCECF-AM). BCECF-AM é um corante não fluorescente membrana permeável; a sua conversão em BCECF fluoresceína através da acção de esterases intracelulares pode indicar a viabilidade celular. P. gingivalis é marcado com o corante BCECF-AM e então utilizado para infectar as células eucarióticas. Após a infecção, as células são fixadas e marcadas com DAPI e TRITC-faloidina. A mancha DAPI utilizado para corar o núcleo da célula eucariótica também irá rotular núcleo da célula bacteriana, que fornece uma contra-medida para identificar as bactérias não-viáveis ​​que podem não se apegam metabolicamente BCECF-AM. As células hospedeiras são realçadas com TRITC-phalloidin, um corante vermelho actina.

  1. Lamelas autoclave. Adicionar assepticamente lamelas para placas de 12 poços antes de semear as células endoteliais a 5 x 10 4 células / poço. (Preparado dia antes da experiência)
  2. Prepare bactérias anaeróbias cultivadas até à fase semi-log (OD 660 = 0,5-0,7), conforme descrito na seção 1.
  3. Lavar 2x com bactérias anaeróbias PBS por centrifugação a 5.000 xg e suspensão da pelota em PBS a 5-7 x 10 8 células / ml.
  4. Adicionar 20 uL de 0,2 mM de BCECF-AM a 2 ml de suspensão bacteriana (5-7 x 10 8 culas / ml) para uma concentração final de BCECF-AM 2 uM de.
  5. Incubar a 37 ° C durante 30 min no escuro.
  6. Placas de transferência com células endoteliais semeadas em 18 mm (# 1.5 espessura) lamelas circulares de cultura de tecidos incubadora na câmara anaeróbia. Lavar com PBS e intercâmbio com a mídia VEGF anaeróbia.
    Nota: Verifique se HUVECs são saudáveis ​​sob um microscópio de luz. HUVECS deve ser ~ 80% confluentes, morfologia devem ser comparáveis ​​aos fabricantes.
  7. Centrífuga marcado bactérias na5.000 xg durante 10 min para remover o corante BCECF-AM residual. Suspender em 2 ml de mídia VEGF anaeróbia.
  8. Infectar células hospedeiras com bactérias marcadas na MOI de 100: 1 (bactérias: host).
  9. Incubar em câmara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min.
  10. Após infecção de células de lavagem três vezes com PBS e fixar em recém-preparado 4,0% de paraformaldeído durante 10 min.
    Nota: Depois de consertar as células, experimento pode ser realizado fora da câmara de anaerobiose.
  11. Lavar lamelas com PBS três vezes.
  12. Adicionar 1 ml de 0,2% de Triton X-100 durante 10 min.
  13. Lavar lamelas com PBS três vezes.
  14. Adicionar 50 ul de TRITC-faloidina (50 ug / ml) para lamelas durante 45 min.
  15. Wash lamelas três vezes, remover da placa de 12 poços e coloque em um slide com soft-set meio de montagem contendo DAPI. Selar os lados com unha polonês.
    Nota: As lâminas podem ser armazenadas por um par de meses no escuro. Evite a exposição à luz para evitar a foto-branqueamento.
  16. Visualização de diapositivosutilizando um microscópio confocal.
    1. Aqui, use um sistema de 34 canais espectrais (detector de conjunto de 32 canais e dois detectores PMT lado, além de um detector de luz transmitida) configurado em torno de um AxioObserver (invertido) estar com um palco motorizado XY. O sistema tem cinco lasers de diodo: azul (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe vermelho (633 nm) e um laser pulsado nm 440. Equipar um sistema de imagem Lifetime fluorescência com 2 detectores GaAsP híbridos (para FRET-FLIM).
    2. Detectar a fluorescência a partir de DAPI e TRITC em um canal utilizando um filtro de banda dupla, com comprimentos de onda de excitação de 340-380 nm e 540-560 nm, e um filtro de emissão de 435-485 nm e 570-590 nm, respectivamente. Detectar a fluorescência de BCECF-AM, utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 440-500 nm e um filtro de emissão de 510-590 nm.
      Nota: Os controles para BCECF-AM deve ser feito em cada estirpe bacteriana sendo estudadas para garantir uma rotulagem adequada de bactérias viáveis. Em primeiro lugar validar que nonviable bactérias são DAPI-positivas e BCECF-negativo. Em segundo lugar, garantir que as bactérias vivas pode metabolizar BCECF-AM em fluoresceína BCECF. Concentrações variáveis ​​de as bactérias ou corante BCECF-AM podem precisar de ser testado para rotulagem óptima.

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Representative Results

Protocolos descritas acima foram usadas no estudo de interação patógeno-hospedeiro entre P. gingivalis e células endoteliais. P. gingivalis W83 e um P. gingivalis V3150 transportando uma deleção de PG0228 foram utilizados no estudo. O PG0228 está previsto para codificar uma proteína que podem alterar os níveis de RNA e proteínas, o que pode em última análise afectar a interacção de P. gingivalis com células hospedeiras. Para investigar o efeito da PG0228 em P. , foi comparada a capacidade das estirpes parentais e mutantes para interagir com células HUVEC capacidade de interagir com as células hospedeiras gingivalis 's. O protocolo de sobrevivência (Figura 2) foi aplicado a este estudo. Assim, ambas as estirpes foram crescidas até à fase logarítmica, conforme descrito no passo 2. Ambas as estirpes apresentaram curvas de crescimento semelhantes e, portanto, não há problemas significativos com a normalização do número de células antes da infecção foi encontrado. Após sete dias de incubação, as UFC foram observados no sangue de umplacas de gar (Figura 3). Várias diluições de 1:10 (Figura 3a), 1: 100 (Figura 3C) e 1: 1000 (Figura 3B) foram plaqueadas em placas de agar sangue. Como pode ser visto na Figura 3A o número de colónias eram demasiado elevados para avaliar; as colônias eram inseparáveis ​​entre si e designados como "demais para contar" [TMTC]. A diluição na Figura 3B foi muito baixa como muito poucas colônias são obtidas. As diluições de 1: 100 como mostrado na Figura 3C era desejável, como as colónias são discerníveis e o número de colónias foram manejável para contar. Resultados similares foram encontrados para o V3150 estirpe mutante (Figura 3D). Assim, o CFUs foram contadas a partir das placas com o factor de diluição de 1: 100.

Usando o número de UFC e o factor de diluição, foi calculado o número estimado de bactérias viáveis ​​recuperados para cada estirpe. Dividindo o número de viable bactérias recuperadas ao número inicial de bactérias resulta numa razão definida como a eficiência de invasão. Ao comparar as eficiências de invasão de ambas as estirpes, tipo selvagem W83 sobreviveu dentro HUVECs com alta eficiência, enquanto as estirpes carentes PG0228 mostraram uma redução significativa na sobrevivência (Figura 4).

Para verificar melhor que o defeito foi devido a sobrevivência, em vez de internalização reduzida das bactérias, foi realizada análise por microscopia. HUVECs infectados com P. gingivalis foram visualizadas sob um microscópio (Figura 5). Neste exemplo, um HUVEC é apresentado. Para determinar o número de bactérias internalizadas múltiplas imagens foram tiradas a diferentes distâncias focais para obter uma pilha de Z permitindo a identificação espacial-temporal de internalizado P. gingivalis. Além disso, pelo menos 40 células / ensaio, devem ser analisadas (por cada réplica biológica) e o número de bactérias internalizadas enumerados para cada rchuva. Se o número de bactérias internalizadas é a mesma para cada estirpe quando visto sob um microscópio, em seguida, ambas as estirpes de invadir células HUVEC em partes iguais; No entanto, o mutante V3150 tem uma capacidade reduzida para sobreviver, enquanto no interior da célula hospedeira como pode ser visto no ensaio de protecção de antibiótico.

Figura 3
Figura 3. Resultados de um ensaio de sobrevivência bacteriana. Protocolo para a sobrevivência das bactérias intracelulares foi utilizado para avaliar a capacidade de tipo selvagem P. gingivalis W83 e um deficiente V3150 mutante em PG0228 para invadir e sobreviver dentro HUVECs. Bactérias viáveis ​​internalizadas são determinados pela visualização da UFC após incubação de HUVECs- P. gingivalis mistura em placas de agar de sangue de sete dias, em condições anaeróbicas. Placas de sangue são colocados na caixa de luz que aumenta o contraste e facilita a contagem do UFC. Várias diluições foram examined. HUVECs infectados com P. gingivalis W83 diluição 1:10 (A), diluição 1: 1000 (B), e diluição de 1: 100 (C). HUVECs infectados com P. diluição gingivalis V3150. 1: 100 (D) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Comparação de uma taxa de sobrevivência entre cepas bacterianas parentais e mutantes. HUVECs foram infectadas com o tipo selvagem P. gingivalis W83 e um mutante deficiente na V3150 PG0228. Protocolo para a sobrevivência, como descrito na Figura 2, foi seguido. O experimento foi realizado três vezes em triplicata ea média ± desvios-padrão são apresentados. Invasão eficiência representa sobreviveram / bactérias iniciais.* A estirpe mutante foi estatisticamente significativa de sobrevivência reduzida quando comparada com a estirpe tipo selvagem W83 (P <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Exemplo de uma análise microscópica de P. gingivalis internalizadas por HUVECs. HUVECs foram infectadas com BCECF-AM marcado P. gingivalis durante 30 minutos a uma MOI de 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). As células foram fixadas com paraformaldeído e marcado com TRITC-faloidina e DAPI. A imagem mostra uma única HUVEC com o núcleo (A) e F-actina (B) corados azul e vermelho, respectivamente. A seta indica P. gingivalis rotulado verde (C). A ima mescladage é produzido para mostrar P. invasão em HUVECs (D) gingivalis. As imagens foram produzidas usando microscópio de varredura confocal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Todos os métodos acima podem ser utilizados para conceber ensaios específicas para avaliar a interacção de bactérias anaeróbicas com células eucarióticas. No entanto, há várias considerações para realizar com sucesso experiências. Primeiro são as estirpes microbianas para ser utilizados num estudo.

É crucial para a comparação de duas estirpes com ambos o ensaio de sobrevivência, bem como por análise de microscopia de que eles estão em fases de crescimento semelhantes e atingir as concentrações de células semelhantes como quaisquer diferenças na acima pode influenciar a eficiência invasão 13. Quando as curvas de crescimento diferem entre duas cepas bacterianas, os ajustes devem ser feitos para finalmente alcançar padrões de crescimento semelhantes que compartilham concentrações consistentes 21. Além disso, as bactérias devem ser disperso uniformemente a fim de evitar a agregação de células. Além disso, é crítico para seleccionar antibióticos que eliminam efectivamente as bactérias extracelulares. Se antibiótico escolhido tem efeitos deletérios sobre as células hospedeiras, em seguida,uma alternativa aos antibióticos ou enzimas líticos podem ser usadas 24,25. Finalmente, a heterogeneidade estirpe deve ser considerada; apesar de uma espécie pode ser identificada para invadir as células hospedeiras, pode haver diferença importante na patogenicidade de uma estirpe de um outro 26 e, assim, um estudo piloto deve ser realizada para cada estirpe a ser examinado.

Um segundo passo é crítico para estabelecer um tempo de incubação óptimo e inoculo bacteriano (multiplicidade de infecção [MOI], que é o número de bactérias utilizadas para infectar célula hospedeira) na concepção dos protocolos. Períodos de incubação mais curtos irá avaliar a capacidade das bactérias para ser internalizada pelas células hospedeiras, enquanto os pontos de tempo mais longos podem ser necessários para determinar a sobrevivência de bactérias, bem como a replicação intracelular 27. Como a sobrevivência intracelular da bactéria pode ser afectada pela MOI a ser usada, é melhor para testar múltiplos MOIs para assegurar que nenhum dano a células foi causada que iria levar à morte celular ou permeabilizEd membranas com acesso a morte intracelular das bactérias aos antibióticos. Depois de estabelecer MOI e de incubação vezes necessárias para responder à pergunta específica que está sendo solicitado, o experimento é executado de acordo com o protocolo; No entanto, várias diluições em série da mistura de lise celular eucariótica-bactérias deve ser feita. O factor de diluição óptima será determinada com base em CFUs observados. Fatores de diluição que resultam em pratos com 50-200 CFU são ideais para avaliar a eficiência de sobrevivência. Se a contagem de CFU é demasiado elevada, as colónias são indiscerníveis uns dos outros e que se torna difícil contar manualmente cada colónia. Se a contagem de CFU é demasiado baixo, pequenos desvios exagerar a mudança de dobragem entre as estirpes a ser analisado, bem como produzem grandes desvios padrão entre repetições.

Um terceiro ponto crítico é preparar células hospedeiras que são saudáveis ​​e prontos para interagir com as bactérias. No protocolo anterior, as células hospedeiras são cultivadas separadamente usando tec assépticas padrãohniques. O uso de antibióticos e antifúngicos em cultura de tecidos pode ser aconselhável, especialmente para biólogos iniciante de cultura de células. No entanto, antes de efectuar o ensaio de sobrevivência, as células hospedeiras devem ser cultivadas em meio livre de antibióticos durante pelo menos 12 horas antes da transferência das células para dentro da câmara anaeróbia. Uma vez no interior da câmara, a mídia deve ser trocado com meio sem antibiótico anaeróbio para não colidir com bactérias anaeróbias durante a infecção. Se existem problemas com a ligação de células hospedeiras em placas de cultura de tecidos de plástico ou de lamelas, pode ser aconselhável aplicar um revestimento adesivo tal como poli-L-lisina ou gelatina. Além disso, as técnicas para pratos de cultura de tecidos de revestimento com uma matriz produzido naturalmente membrana basal semelhante extracelular (ECM) pode fornecer o investigador com mais in vivo como condições 28,29. Lise de células hospedeiras exige um detergente equilibrada capaz de abrir células hospedeiras sem alterar viabilidade bacteriana. Embora não saponina kbactérias doentes, podem inibir o crescimento de algumas espécies. Antes de os nossos estudos o efeito de saponina sobre P. gingivalis estirpes a ser utilizado para a análise de hospedeiro-patogénio foi verificado que não têm nenhum efeito sobre o crescimento / sobrevivência. Se as bactérias são altamente sensíveis aos detergentes, incluindo saponina, ciclos de congelamento e descongelamento repetidos ou água destilada pode ser utilizado para lisar as células hospedeiras com pouco dano para as bactérias.

Um quarto ponto crítico inclui as considerações a serem tomadas durante a execução dos experimentos de microscopia. Primeiro, é a utilização de um corante fluorescente para etiquetar as bactérias a serem usadas para o protocolo de microscopia. Muitos métodos de rotulagem em vigor para as bactérias necessitam de um anticorpo primário ou corantes bacterianas habituais com limitações significativas, tais como efeitos tóxicos e de lixiviação do corante no entorno dando assim elevado ruído de fundo. BCECF-AM é um corante de membrana permeável comumente usado como um indicador fluorescente de pH intracelular em ambos os procariotas e eucariotas 30-32. Verificou-se ser eficaz na identificação de uma gama de bactérias anaeróbicas em estudos anteriores 33-35. BCECF-AM só irá rotular bactérias viáveis ​​capazes de esterificação. A conversão de BCECF por esterases intracelulares resultados de uma forma fluorescente que se escapa para fora das células muito mais lentamente do que o seu composto parental. Existem muitos corantes fluorescentes e técnicas de coloração que pode ser usado 36; No entanto, este protocolo descreve uma técnica de fixação / coloração simples que pode ser usado com praticamente qualquer microrganismo. Além disso, outros corantes (TRITC-faloidina e DAPI) são usados ​​para distinguir mais claramente os limites das células eucarióticas e conta-se apenas as bactérias que interagem com as células hospedeiras.

Corantes fluorescentes são suscetíveis a foto-branqueamento e há vários antifades comerciais e meios de montagem disponíveis que podem impedir o enfraquecimento do sinal fluorescente 37. Há também opções entre-set duro de montagem de mídia umnd soft-definido queridos. Enquanto os mais difíceis de definir pode resultar em mudanças significativas no índice refratário, bem como o encolhimento e dano tecidual 38 os meios de comunicação soft-ajuste requerem selantes, tais como unha polonês, para garantir a lamela. Então, devido às variações observadas entre as células eucarióticas infectadas; o número de bactérias internalizadas entre células pode variar e, portanto, várias células eucarióticas deve ser utilizado para a análise. Em nossos estudos, pelo menos quarenta células eucarióticas são avaliadas e internalizado bactérias enumeradas por experiência 33,34. Finalmente, para visualizar claramente células individuais, células eucariotas utilizados para a infecção não devem ser cultivadas até à confluência. Exames microscópicos de infecção intermedia Prevotella com células epiteliais mostrou preferência por regiões específicas da membrana da célula hospedeira, e as bactérias não aderem aos locais onde as células epiteliais estavam em contato uns com os outros e não tinha lamellipodia 39.

O limitação da microscopia poderia ser seu baixo rendimento. Assim, para os dados quantitativos em larga escala sobre a propriedade de bactérias invasivas uma citometria de fluxo também pode ser utilizada 40. Este método envolve o uso de bactérias marcadas com fluorescência (que pode ser realizada como descrito para as bactérias a serem usadas para a microscopia) e permite estudar amostras múltiplas de cada vez que pode ser atractiva para alguns investigadores.

Modificações os dois protocolos podem ser feitos para identificar vias envolvidas na absorção de célula hospedeira de bactéria. Invasão bacteriana sucesso ocorre em cinco etapas: (1) de fixação (2) de entrada / internalização (3) O tráfico (4) persistência e (5) saída 41. Assim, durante a entrada / internalização, a bactéria localiza-se com o hospedeiro e usurpa a célula hospedeira para a internalização através da modificação de transdução de sinal. Inibidores metabólicos selectivos podem ser adicionados a células hospedeiras para determinar as alterações de sinalização que conduz a invasão bem sucedida. Paralatrunculin exemplo, que inibe a polimerização da actina, pode ser utilizado para estudar o modo como o rearranjo do citoesqueleto afecta internalização de P. gingivalis. Os anticorpos que têm como alvo receptores ou siARN capaz de derrubar certos genes específicos de células também pode ser usado para uma melhor compreensão da célula hospedeira envolvidas em eventos de sinalização internalização bacteriana. Embora todos os inibidores metabólicos deve ter o mínimo efeito global em células hospedeiras, excepto o que está a ser investigada, é importante para garantir os tratamentos inibidores não têm um efeito tóxico sobre as bactérias.

Estudos futuros olharia para aperfeiçoar algumas destas técnicas, eventualmente, atingir um mais in vivo como condição. No artigo de corrente, quer bactérias ou células hospedeiras são expostas a ambientes agressivos. Dependendo do organismo, a linha de células, e meta do experimento alguns investigadores pode preferir executar o protocolo anteriormente referido, numa incubadora com CO 2. No entanto, a lesão periodontals refletir um microambiente anaeróbio em que as bactérias interagem com o hospedeiro. Um estudo que examinou variações na resposta celular ao desafio com bactérias orais sob aeróbica contra condições anaeróbicas informou que sob tensão reduzida de oxigênio (2% de oxigênio) bactérias, por exemplo, Tannerella forsythia, P. gingivalis e P. intermedia provocou níveis mais elevados de IL-8 e TNFa em comparação com as condições aeróbicas 42. A capacidade das células eucarióticas para sobreviver em condições anaeróbias foi também confirmada por estudos que examinaram a capacidade das células estaminais mesenquimais humanas, células estaminais do folículo dental humana, fibroblastos gengivais humanos, células de carcinoma gengival, e células epiteliais orais humanas 43,44,45. Nossos estudos utilizando WST-1 ensaio de proliferação celular mostrou que HUVECs pode sobreviver por até 48 horas, sob condições anóxicas. Foi tomada a decisão de infectar as células na câmara anaeróbica, porque P. gingivalis é sensível a pelomospheric níveis de oxigénio, enquanto HUVECs pode sobreviver a períodos de tempo prolongados em condições anaeróbias. A pesquisa futura investigar a aplicação de dispositivos de cultura de células micro-fluídico que fornecem o oxigénio para uma superfície de uma monocamada (como uma artéria) e condições anaeróbicas na outra 46. Desta forma, as condições não será sacrificado tanto para bactérias ou anfitrião em cima de infecção. Em resumo, estão descritos alguns protocolos simples que podem ser utilizados para análise da interacção hospedeiro-patogénio para as bactérias anaeróbias. Estes protocolos foram igualmente utilizados para avaliar o efeito de internalinas bacterianas, proteínas que promovem a invasão bacteriana 40, bem como as bactérias não-invasivos substitutos que expressam uma proteína que confere propriedades invasivas sobre a bactéria 47.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B Coy Laboratory Products Model 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood BBL 221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool LifeLine Technology FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit LifeLine Technology LL-0003
TrypKit LifeLine LL-0013
Saponin Riedel-de Haen 16109
Gentamicin Sulfate Salt Sigma-Aldrich G-1264
Metronidazole Sigma-Aldrich M-3761
BCECF-AM LifeTechnologies B1150
TRITC Phalloidin  Sigma-Aldrich P1951
18 mm Circular Coverslips Electron Microscopy Sciences 72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200

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