Emulsões água em óleo: Um novo sistema para a montagem de proteínas de ligação de clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos

Chemistry
 

Summary

Este manuscrito descreve um método simples e de alto rendimento para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos que é base de emulsões de água-em-óleo. Demonstramos a eficácia do método na montagem de clorofilas nativas com quatro variantes de água-solúvel em clorofila recombinante proteínas de ligação (WSCPs) de plantas Brassica expressos em E. coli.

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Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments. J. Vis. Exp. (109), e53410, doi:10.3791/53410 (2016).

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Abstract

Clorofilas (CHLS) e bacteriochlorophylls (Bchls) são os principais co-fatores que realizam a colheita de luz da fotossíntese e de transporte de elétrons. Sua funcionalidade depende criticamente sobre a sua organização específica dentro grandes complexos de proteínas e elaborados múltiplas subunidades transmembrana. A fim de compreender a nível molecular destes complexos como facilitar a conversão da energia solar, que é essencial para compreender proteína de pigmento, e interacções pigmento de pigmento, e o seu efeito sobre a dinâmica excitados. Uma maneira de ganhar tal entendimento é através da construção e estudar complexos de Chis com proteínas recombinantes solúveis em água simples. No entanto, a incorporação dos Chis e Bchls lipofílicos em proteínas solúveis em água, é difícil. Além disso, não existe um método geral que pode ser utilizado para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui, demonstramos um sistema de transferência simples e alta à base de emulsões de água-em-óleo, o qual permite burroembly de proteínas solúveis em água com Chis hidrofóbicos. O novo método foi validado por reunião de versões recombinantes da proteína de ligação à clorofila solúvel em água de plantas Brassicaceae (WSCP) com Chl a. Nós demonstramos a montagem bem-sucedida de Chl A utilizando lisados ​​impuros de WSCP expressando E. célula de E. coli, que podem ser utilizados para o desenvolvimento de um sistema de tela genética para as proteínas de ligação Chl-solúveis em água novos, e para estudos de interacções proteína-Chl e processos de montagem.

Introduction

pigmentos hidrofóbicos, tais como clorofilas (CHLS), bacteriochlorophylls (Bchls) e carotenóides são os principais cofatores na centros de reação fotossintética e proteínas de colheita de luz que realizam transporte de elétrons, e captura de energia de luz e transferência. Os centros de reação e a maior parte dos complexos de colheita de luz Chl-ligação são proteínas transmembrana. A proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de não oxigênicos bactérias fotossintéticas-enxofre verde 1,2 e a proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados 3 são exemplos excepcionais de proteínas de colheita de luz solúveis em água. A ligação de clorofila proteínas solúveis em água (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae e plantas Amaranthaceae 4, 5 são outro exemplo único, mas em contraste com FMO e PCP, estes não são nem envolvidos na captura de luz nem em qualquer um dos reacção fotossintética primária e sua phy precisafunções fisiológi- são ainda incerto 5-8. A sua afinidade de ligação a Chl elevada conduziram a uma função sugerida como transportadores transientes de Chis e derivados de Chi 9,10. Alternativamente, se a hipótese de que WSCP desempenha um papel importante na limpeza Chis em células danificadas e protege contra danos induzidos photooxidative-Chl 7,11-13. Mais recentemente, sugeriu-se que as funções de WSCP como um inibidor de protease e desempenha um papel na resistência herbívoros assim regula a morte celular durante o desenvolvimento da flor 14. WSCPs são divididos em duas classes principais de acordo com as suas propriedades fotofísicas. A primeira classe (classe I, por exemplo. De Chenopodium album) pode sofrer fotoconversão sobre iluminação. Classe WSCPs II de plantas Brassica, que não se submetem a fotoconversão 5,10, estão subdivididos em classes IIa (ex., A partir de Brassica oleracea, Raphanus sativus) e IIb (por exemplo., De Lepidium virginicum Lepidium virginicum foi resolvida por cristalografia de raios-X em resolução de 2.0 a 8. Ela revela um homotetrâmero simétrica em que as subunidades da proteína formar um núcleo hidrofóbico. Cada subunidade se liga a um único Chl o que resulta em um arranjo apertado de quatro Chis estreitamente empacotadas dentro das core.This simples arranjo todos Chl faz WSCPs um sistema modelo potencialmente útil para o estudo de ligação e montagem de complexos de Chl-proteína, e os efeitos da vizinha Chis e ambientes de proteína sobre as propriedades espectrais e eletrônicas de Chis individuais. Além disso, pode fornecer modelos para a construção de proteínas Chl vinculativos artificiais que podem ser utilizados para os módulos de luz de colheita em dispositivos fotossintéticos artificiais.

Estudos rigorosos de WSCPs nativas não são viáveis ​​porque os complexos purificados a partir de plantas contêm sempre uma mistura heterogénea de tetrâmeros com diferentes combinações de Chl ae Chl b 9. Assim, um método para a montagem de WSCPs expressos de forma recombinante com Chis in vitro é necessário. Este é desafiada pela solubilidade em água desprezável de Chis que faz com que seja impossível montar o complexo in vitro misturando simplesmente as apoproteínas solúveis em água com pigmentos em soluções aquosas. Montagem in vitro misturando as apoproteínas com membranas de tilacóides 15 foi demonstrada, mas este método é limitado à Chis nativa presente nos tilacóides. Schmidt et ai. informou sobre a montagem de vários derivados de Chi e de Bchl com WSCP de couve-flor (CaWSCP), expressando de forma recombinante uma proteína marcada com histidina em E. coli imobilizando-o sobre uma coluna de Ni-afinidade e a introdução de derivados de Chi solubilizados em detergentes 11. Com sucesso reconstituição do WSCPs recombinantes de A. thaliana 6, e couves de Bruxelas (BoWSCP), nabo japonês (RshWSCP) umd Virgínia pepperweed (LvWSCP) por um método semelhante foram também relatados.

Aqui, apresentamos um romance, método geral, direto para a montagem de Chis com WSCP que não requerem marcação ou imobilizar as proteínas. Baseia-se na preparação de emulsões de suas soluções aquosas dos apoproteínas solúveis em água, em óleo mineral. As proteínas são assim encapsulados em água-em-óleo (W / O) microgotículas com superficial muito elevada em relação ao volume de 16. Os cofactores hidrofóbicos são, em seguida, dissolvido no óleo e são facilmente introduzidos nas gotículas da fase oleosa. Relatamos usando o método para a montagem de diversas variantes de apoproteínas WSCP recombinante expressos em E. coli com Chl a. Nós demonstramos a montagem a partir de lisados ​​em bruto de bactérias que sobre-expressam WSCP que podem ser utilizados como um sistema de rastreio para o desenvolvimento de novas proteínas de ligação de Chl.

Protocol

1. Preparar Chl um estoque Solutions

  1. Passo crítico: executar todos os passos de preparação de clorofila numa hote química, sob luz verde (520 nm) ou, no escuro, a fim de minimizar o fotoenvelhecimento. Sempre adicionar azoto ou árgon antes de congelar os pigmentos para armazenamento. Assegurar que todos os solventes são grau analítico.
  2. Pesar cerca de 5 mg de células Spirulina platensis liofilizadas ou outras células contendo apenas cianobactéria Chl a em tilacóides e esmagá-lo usando um almofariz e pilão.
  3. Carregar células trituradas numa coluna de vidro e lava-se com cerca de 50-100 ml de acetona a 100%, a fim de remover os carotenóides. Descarte a fração laranja / verde eluída.
    Nota: Se a fracção de laranja não é eluída com 100 ml de acetona continuar a lavagem das células com acetona até fracção verde começa a eluir.
  4. Acetona Exchange com 100% de metanol e recolher a fracção verde contendo Chl a. O volume de eluído fractião pode variar entre 50-100 ml. No início, a fracção eluida tem uma cor verde escuro, que muda para verde pálido na extremidade de eluição. Quando a cor da fraco elua se transforma em verde pálido parar a eluição.
  5. Evapora-se o metanol utilizando um evaporador rotativo até que o extracto é completamente seca. Não aplique calor para a solução; assegurar que a temperatura do banho de água do evaporador não exceda 30 ° C.
    Nota: O tempo de evaporação depende do volume da fracção de metanol a ser evaporado e pode variar entre 10-60 min. É importante secar o extracto completamente.
  6. Dissolve-se os pigmentos do extracto seco num pequeno volume de éter dietílico (cerca de 5-10 ml), e filtrar através de lã de algodão. Certifique-se de que os pigmentos são completamente dissolvido em éter, antes de filtrar.
  7. Evapora-se o éter dietílico até os pigmentos estarem completamente secos (10-30 min).
    Nota: Os pigmentos secos pode ser purgado com e mantido sob atmosfera de azoto ou árgon a -20 ° C, no escuro, até processamento posterior.
  8. Dissolve-se os pigmentos secos no menor volume possível de 100% de metanol (cerca de 1 ml), mesmo se não tudo está completamente suspenso. Adicionar 4 ml de acetona à solução, e agite suavemente o vidro, a fim de dissolver completamente os pigmentos.
  9. Usando uma pipeta de Pasteur, carregar a amostra suavemente sobre uma coluna de DEAE Sepharose equilibrada em 100% de acetona.
  10. carotenóides eluir (uma tira amarelo-laranja), com 100% de acetona. Então, eluir Chl a (faixa verde) com mistura 3: 1 v / v de acetona / metanol.
    Nota: O volume de acetona e mistura de acetona / metanol é aproximadamente equivalente ao volume de DEAE Sepharose carregada na coluna.
  11. Verifique Chl a pureza por cromatograf ia em camada fina utilizando uma 68: (v / v) de uma mistura 2 de diclorometano / n-hexano / isopropanol / metanol como eluente 17: 25: 5.
  12. Evapora-se o solvente usando um evaporador rotativo até que a Chl a é completamente seco (10-60 min).
    Nota: O Chl seco a pode ser purgado com azoto ou árgon e armazenados sob atmosfera de árgon à temperatura de -20 ° C no escuro.
  13. Prepare uma solução estoque Chl por re-dissolução do Chl a seco em 2-4 ml de etanol a 100%.
    Nota: O coeficiente de extinção de um Chl em 663 nm é 74.400 cm -1 m -1 (83,3 cm-1 (mg / mL) -1) em etanol. Uma solução de estoque típico deve ter uma DO de 1860 que corresponde a uma concentração de 25 mM (23 mg / ml). A adição de 20 ul desta lingua a uma emulsão contendo 5 ml de fase orgânica, e 1 mg de WSCP em 1 ml de resultados fase aquosa, de uma mistura com um excesso molar de 10 vezes de uma Chl vs. WSCP.

2. Preparar fase orgânica da emulsão

Nota: A fase orgânica da emulsão é composta de óleo mineral contendo 4,5% (v / v) de Span 80 e 0,4% (v / v) de Tween 80.

  1. Pesa-se um tubo de 50 ml de 0,2 g de tween 80, 1,8 g de Span 80, e 38 g de óleo mineral. Misture bem todos os componentes e arrefecer no gelo.
    Nota: A fase orgânica pode ser armazenado em 4 ° C até uma semana.

3. Preparação da fase aquosa da emulsão

Nota: A fase aquosa da emulsão pode ser composta de qualquer WSCP purificada ou extracto em bruto de bactérias que sobre-expressam WSCP.

  1. Preparar uma fase aquosa contendo WSCP purificada.
    1. Crescer as bactérias E. coli BL21 contendo o plasmídeo WSCP 12 em 1 L de meio LB a 37 ° C até à DO de 0,3-0,6.
    2. Induzir a expressão da proteína por adição de IPTG 1 mM. Após a indução crescer as bactérias a 30 ° C durante 12-16 hr.
    3. Colheita bactérias por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    4. Dissolver o sedimento em tampão e sonicate vinculativo sobre gelo (30 seg on, 15 seg off, cinco vezes). Utilizar 10 ml de tampão para o sedimento, obtido pela centrifugação de 250 ml demeio LB com células que sobreexpressam a proteína.
      Nota: Dependendo do método de purificação, o tampão de ligação pode ser composta de 100 mM de tampão fosfato, pH 7,2 ou 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 5 mM de EDTA.
    5. Girar o lisado celular a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    6. Purifica-se por cromatografia de afinidade WSCP. Dependendo da tag fundido com WSCP, purificar as proteínas recombinantes utilizando o sistema de cromatografia de afinidade comercialmente disponível adequado para a purificação de proteínas, seguindo as instruções do fabricante.
    7. Para a preparação da emulsão, utilizar WSCP purificada em tampão fosfato 50 mM, pH 7,8. Certifique-se de que a quantidade final de proteína utilizada para a reconstituição é de 0,5-1,0 mg por 1 ml de tampão.
  2. Preparar uma fase aquosa contendo lisado bacteriano em bruto com WSCP.
    1. Crescer as células de E. coli BL21 contendo WSCP-expressando plasmídeo em 250 ml de meio LB a 37 ° C até 0,3-0,6 OD.
    2. Induzem a expressão de proteínas com1 mM de IPTG e bactérias crescem durante a noite a 30 ° C.
    3. Colheita de células bacterianas por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    4. Dissolve-se o sedimento em 1-2 ml de 50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,8, sonicar (30 seg ligado, 15 segundos desligado, três vezes) e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    5. Preparar a fase aquosa da emulsão por mistura de 0,125 ml de sobrenadante com 0,875 mL de 50 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,8.

4. Montagem de WSCP com Chl a em Emulsão

  1. Transferência de 5 ml de mistura de óleo-agente tensioactivo para um frasco de vidro e arrefecer em gelo. Antes de pipetagem, verificar que todos os componentes da fase orgânica são muito bem misturados e não existe separação de fases entre tensioactivos e óleo mineral.
  2. Adicionar 1 ml de fase aquosa gelada preparadas como no ponto 3 a 5 mL de fase orgânica.
  3. Misturar ambas as fases, utilizando um homogeneizador de tecidos durante 2 min a 9500 rpm em gelo.
  4. ETAPA CRÍTICA: A partir dessa etapa, executar todas as medidas adicionais sob luz verde (520 nm), a fim de minimizar o fotoenvelhecimento. Adicionar 20 ul de 25 mM de Chl uma solução de estoque (ver secção 1.13) à emulsão. Dispersar sacudindo e invertendo o frasco de vidro. Certifique-se de que a Chl é distribuída uniformemente na emulsão.
  5. Incubar a emulsão durante 1-2 horas em gelo no escuro.
  6. A fim de quebrar a emulsão de gotas de água e separadas da fase orgânica transferir a emulsão para tubos de 1,5 ml de plástico e centrifugar a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    Nota: Se o conjunto é bem sucedido, a fase aquosa inferior deve ter uma cor verde.
  7. Descarte a fase de óleo superior e adicionar 1 ml de óleo mineral. Misture bem o óleo mineral com a emulsão sedimentado por vortex ou lançando o tubo completamente. Girar a amostra a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Repita este passo até um menisco clara separando o aquoso e mineiroal fases de óleo, sem qualquer emulsão intermédia é obtida.
  8. Execute esta etapa em uma capa química. Após as fases de óleo e aquosas minerais estão claramente separados, remover o óleo mineral e adicionar 1 ml de éter dietílico saturado com água. Vortex e girar a amostra a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Repita esta etapa duas vezes.
  9. Após a segunda centrifugação, remover o éter dietílico e deixar os tubos abertos durante 5-20 minutos na capa.
  10. Finalmente, carregar a fase aquosa contendo o WSCP / Chl um complexo sobre uma coluna de dessalinização e elui-se com tampão apropriado para outras experiências.
    Nota: A proteína é estável em tampões de fosfatos e tris em uma ampla gama de pH (6,0-7,5). A amostra pode ser armazenada a 4 ° C protegida da luz até um mês.

Representative Results

Apoproteínas WSCP recombinantes foram montados com um Chl em emulsões / O w de acordo com o protocolo descrito na secção anterior. O protocolo foi implementado utilizando fases aquosas contendo os WSCPs puros, ou lisados ​​de células de E. coli que sobre-expressam WSCP (Figura 1). O protocolo é simples, rápida e não requer qualquer equipamento especial, exceto um homogeneizador de tecidos.

A absorvância e espectros de CD de complexos de Chl quatro variantes recombinantes WSCP, nomeadamente RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP LvWSCP e são mostrados na Figura 2. Estes são semelhantes em forma de faixa e a posição espectros previamente relatado dos respectivos complexos nativos 10,18, 19. Estes resultados mostram claramente que WSCP / complexos Chl reconstituídos em W sistema / O emulsão assemelha-se os complexos nativas.

E. coli que expressam WSCPs foram utilizadas como a fase aquosa da emulsão. Os lisados ​​de bactérias que não expressam WSCPs foram usadas como controlo negativo. Montagem positiva de WSCP com um Chl é facilmente observado por a cor verde da fase aquosa, mas apenas nos lisados ​​de células que expressam WSCP (Figura 3). Gotas contendo estes lisados ​​característica distinta Chl a fluorescência em imagens de microscopia confocal. Isto implica que a montagem de complexos bem sucedida WSCP / Chl pode ser detectado directamente nas gotas de água, o que pode ser a base para os sistemas de rastreio baseados em emulsão W / O.

figura 1
Figura 1: Montagem de WSCP com Chis em W / O Emulsões (A. de E. coli que expressam WSCP. Quando a emulsão estiver pronta, Chis são adicionados à emulsão. Após a reconstituição, as gotas de água são separados da fase orgânica por centrifugação. (B) do sistema de emulsão W / O pode ser utilizada para o rastreio de transferência rápida e elevada para reconstituição positivo de WSCPs com Chis. A fluorescência do WSCP / Chl complexo podem ser detectados diretamente das microgotas de água por um microscópio confocal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Absorvância e espectros de CD WSCP / Chl a Complexos Apoproteínas de quatro.WSCP variantes foram reconstituídos com excesso molar de 10 vezes de Chl a. Os espectros de absorção (a) foram normalizados a 1 em 673nm para BoWSCP (preto), CaWSCP (verde), e RshWSCP (azul) e 663nm para LvWSCP (vermelho). Os mesmos factores de normalização foram utilizados para o CD (b). Reproduzido com permissão de 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Scanning microscopia de fluorescência e triagem visual de montagem complexa WSCP / Chl (A) SDS-PAGE de E.. Os lisados ​​celulares coli BL21 antes e após a reconstituição com um Chl nas emulsões W / O. Pista 1: sem células BL21 o plasmídeo WSCP, pista 2: células BL21 com o PLA WSCPSmid sem indução por IPTG, pista 3: células BL21 com o plasmídeo WSCP induzida com IPTG. Pista 4, 5 e 6 são as mesmas amostras que as pistas 1, 2 e 3, respectivamente, mas após a separação da fase aquosa da fase orgânica, da emulsão. Pequenas alíquotas de cada amostra foram corridos num gel de SDS-proteína. Pista M: marcador de tamanho de proteína. Imagens das amostras antes e depois da separação de fase são apresentados no topo de cada pista. (B) as imagens microscópio confocal de gotas de W / O preparados com um Chl na fase de óleo. As gotículas na imagem esquerda não continha qualquer proteína enquanto aqueles na imagem à direita continha proteína WSCP. A fluorescência foi monitorizada a 682 nm. Reproduzido com permissão de 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O nosso objectivo foi desenvolver um novo sistema para a montagem geral de proteínas de ligação a clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui mostra-se que o novo sistema de reconstituição com base em W / O emulsão é uma abordagem geral comprovada para o trabalho para a montagem de apoproteínas WSCP de couves de Bruxelas, couve-flor, rabanete japonês e Virginia pepperweed recombinante expressos em E. coli. Aqui os resultados são apresentados a partir de reconstituição de 1 mg de WSCP com excesso molar de 10 vezes de Chl a. No entanto, também é possível utilizar concentrações mais baixas de WSCP para reconstituições e diferentes razões molares / proteína de Chl. A quantidade mínima de proteína, que fomos capazes de montar em emulsões de E / S W foi de 100 ug, enquanto que o pigmento a proporção de proteína pode variar de 5: 1 e até 20: 1. Além disso, o volume de fase aquosa pode ser reduzido até 50 mL. Neste trabalho é apresentada a montagem de WSCP com Chl a. No entanto, também é possível montarWSCP com outros Chis hidrofóbicos, Bchls e seus derivados. Atualmente, estamos testando o nosso sistema com outras proteínas de ligação de pigmentos solúveis em água, tais como FMO e PCP.

Embora, nosso método é rápido e simples, existem alguns passos críticos, que precisam ser considerados durante a preparação / O W e reconstituição de WSCP com Chl. Os frascos de vidro, que são utilizados para a preparação da emulsão, precisa de ser limpo e livre de detergente. Mesmo pequenos vestígios de detergentes em frascos vai afetar a preparação da emulsão e resultar em baixa qualidade da emulsão. Além disso, os frascos devem estar completamente seca. Outro passo fundamental, que possam influenciar a eficiência reconstituição, é completamente dispersão de Chl na fase orgânica da emulsão. Portanto, é importante misturar completamente um pequeno volume de Chl em 5 ml de emulsão. Também é importante fazer o maior número de etapas conforme necessário para quebrar a emulsão e remover completamente o óleo mineral da fase aquosa. Quaisquer vestígios de óleo mineral em ph da águaase pode influenciar novas experiências.

W / O emulsão é uma abordagem alternativa para o método estabelecido por Schmidt et al. 11, que foi baseado em imobilizar WSCP marcada com His na coluna de cromatografia de afinidade e incubando com Chis. Embora, o método de Schmidt et ai., Provou funcionar para diferentes WSCPs, requer proteínas marcadas com His e pode resultar na ligação não específica de Chis por ligação para as histidinas da tag. Além disso, a imobilização de proteínas sobre uma superfície sólida pode influenciar a estrutura de proteínas, influenciando assim o processo de montagem com os pigmentos. Além disso, Chl, o qual foi utilizado para a montagem de WSCPs neste sistema foi dissolvido quer em tampão contendo detergentes ou 40% 11,12 metanol. Tais solventes podem resultar em agregação de pigmento e / ou a ligação não específica de Chl WSCP. O nosso novo sistema de reconstituição com base em W / O emulsão não se baseia na imobilização das proteínas ao suporte sólido. Therefore, nenhuma marca de purificação fundido a WSCPs é necessária, e proteínas recombinantes com sequência nativa podem ser montados. Outra vantagem importante do método de W / O é para minimizar a agregação de pigmentos que podem influenciar a eficiência de reconstituição, oligomerização e estequiometria pigmento / proteína. Isto é porque os pigmentos hidrofóbicos são dissolvidos na fase de óleo e a sua introdução nas gotículas W / O é activado pela superfície elevada em relação ao volume dos últimos. Além disso, a ligação não especifica de Chis por WSCP é contornada desde pigmentos hidrofóbicos não podem difundir-se entre as fases orgânicas e aquosas da emulsão. Apenas pigmentos que são montados de forma activa por WSCP durante a reconstituição pode entrar nas microgotículas de água da emulsão.

O método de montagem de WSCP com pigmentos por mistura com WSCP tilacóides isolado 10 é similar ao sistema de emulsão W / S aqui apresentados. Ele requer detergentes ou solventes orgânicos para Solubilizing os Chis, nem a marcação das proteínas. No entanto, o método de W / O pode ser utilizada com quaisquer pigmentos que é solúvel na fase oleosa enquanto que o método anterior é limitado a Chis que são originalmente presente nas membranas tilacóides. Assim, montagem com Chl a pura ou Chl d é possível a partir porque estes estão disponíveis a partir de cianobactérias thylakoids de, por exemplo. Synechocystis PCC 6803 ou Acaryochloris marina, respectivamente. No entanto, não é viável para reconstituir com WSCP Chl b uma vez que este pigmento é sempre acompanhada por um Chl em tilacóides. Por outro lado, a montagem WSCP em emulsão W / O pode ser testado com quaisquer derivados de Chi, Bchl ou de porfirinas naturais ou artificiais. Ele não requer o uso de membranas fotossintéticas e, assim, ele está livre de interferências de componentes extra-membrana tais como ficobilissoma que podem ser associadas às membranas de cianobactérias. O método de W / O está apenas limitada pela solubilidade dos pigmentos na fase de óleo de umnd, portanto, adequados para a montagem WSCP com quaisquer derivados Chl, BCHL ou porfirinas naturais ou artificiais.

Em resumo, apresentamos aqui um método geral para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Suas vantagens de foram demonstrados pela montagem bem-sucedida de Chl a com diferentes WSCPs recombinantes de plantas Brassica tão claramente indicados por espectroscópicos e resultados bioquímicos. Além disso, demonstrou como o protocolo de montagem W / O pode ser utilizada para o rastreio rápido de WSCP / Chl montagem complexa, utilizando lisados ​​de células de E. coli que sobre-expressam WSCPs recombinantes e extractos brutos de Chl. Desta forma, podemos ignorar demorados passos de purificação de proteínas e a necessidade de quebrar emulsões a fim de separar as gotas de água a partir da fase orgânica também pode ser evitado pelo uso de microscopia de fluorescência para visualizar diretamente a montagem em gotas de água. A aplicabilidade geral do novo método faz com que seja um usoferramenta ful para estudar a ligação cofator e montagem, e os mecanismos de energia e de transferência de elétrons em complexos de proteína de cofactor transmembrana através da concepção e construção dos seus análogos de proteínas solúveis em água artificiais simplificados.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

DN reconhece o apoio do FP7 UE projectos PEPDIODE (GA 256672) e REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), e uma bolsa de investigação pessoal (nº 268/10) do Israel Science Foundation. Agradecemos Prof. Shmuel Rubinstein, da Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas, Universidade de Harvard, Cambridge MA, EUA para tirar as imagens de microscopia confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mineral oil Sigma M5904
Span80 Sigma 85548
Tween80 Sigma P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges Bio Rad 10011164 Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column GE Healthcare Life Science 17-5248-02 Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare Life Science 17-0709-01 Chromatography medium for chlorophyll purification

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References

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