实验方法来研究线粒体定位和核细胞周期激酶CDK1功能

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Biology

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Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

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Abstract

Introduction

在哺乳动物中,细胞周期进展取决于由细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶(的Cdks)1控制的高度有序的事件。通过其胞质,细胞核,和中心体定位,其CyclinB1 / CDK1能够在有丝分裂的不同的事件,如核膜破裂和中心体分离2同步。其CyclinB1 / CDK1保护有丝分裂细胞抗凋亡3,促进线粒体分裂,线粒体平均分配给新成立的子细胞4的关键一步。

在增殖哺乳动物细胞中,线粒体ATP经由氧化磷酸化(OXPHOS)机械(电子传递链),它是由5多亚基复合物生成;复杂的I - 复杂V(CI-CV)。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH):泛醌氧化还原酶或复合物I(CI)是理解的五个配合物5的最大和最小。在复杂的C的45亚基,其中14 onsists形成催化核心。一旦组装好,复杂的假定的L形结构有一个臂突出到基体和嵌入在内膜6,7-另一个臂。在CI亚基突变是多种线粒体紊乱8的原 ​​因。在OXPHOS一支高效CI不仅需要整体线粒体呼吸9,而且对成功的细胞周期进程10。 Unravelling在健康和疾病这种膜结合酶复合物的功能所依据的机制可以启用新的诊断程序和先进的治疗策略的开发。在最近的研究中,我们已经发现,中CyclinB1 / CDK1复杂易位到在(峡2),G2 /(有丝分裂)M期线粒体和磷酸CI亚基以提高线粒体的能量生产,潜在地抵消细胞中的细胞的增加的能源需求周期11。在这里,我们笑wcase实验程序,并且可以被用来研究否则核/质激酶的线粒体易位策略,其线粒体底物,以及使用其CyclinB1 / CDK1,例如他们的线粒体定位的功能的后果。

这一发现在需要的时候提示特定线粒体表达这种复杂​​的击倒的研究中CyclinB1 / CDK1复杂易位到线粒体。以实现蛋白质的特异性线粒体表达,人们可以在感兴趣的蛋白的N-末端添加一个线粒体靶向序列(MTS)。线粒体靶向序列使线粒体蛋白到他们正常居住12线粒体的排序。我们使用来自人的细胞色素C氧化酶亚基8A(COX8)的前体衍生的87碱基线粒体靶向序列,并克隆到绿色荧光蛋白(GFP)-tagged CyclinB1的或红色荧光蛋白(RFP)-tagged含质粒的帧CDK1。该方法使我们能够针对CyclinB1的和CDK1进入线粒体,具体地改变这些蛋白质的线粒体表达而不影响它们的核池。通过荧光标记这些蛋白质,我们能够监视他们的实时定位。同样,我们推出了MTS到含有RFP标记的显性负CDK1的质粒,使我们能够明确打掉CDK1的线粒体表达和功能。它具有双本地化一样CDK1激酶的线粒体和核函数来区分是必不可少的。工程MTS到这些双功能激酶的N端提供了一个很好的策略,很容易被采用和有效的。

因为CDK1是细胞周期激酶,它是基本的,以确定细胞周期进展时CDK1被本地化为线粒体。为了实现这一目标,我们已利用的新方法具d,来监测细胞中的DNA含量。传统的方法包括使用的BrdU(溴脱氧尿苷),一种合成的胸苷类似物,它在细胞周期的S期合并到新合成的DNA代替胸苷。然后正在积极复制它们的DNA的细胞可以使用抗BrdU抗体进行检测。这种方法的一个缺点是,它需要的DNA变性通过苛刻的方法,如酸或热处理,这可能导致在结果中13,14之间的不一致性,以提供所述的BrdU抗体的访问。另外,我们采用了类似的方法,以监测不同的胸苷类似物,埃杜的积极分裂的细胞。检测的EdU不需要苛刻的DNA变性,中性清洁剂处理使检测试剂来访问这些EDU在新合成的DNA。所述的EdU方法已被证明是更可靠的,一致的,并与高通量分析15的潜力。

最后,T○确定CDK1的线粒体基质中,我们使用了一种名为2D-DIGE蛋白质组学的工具,这是经典的双向电泳的高级版本。二维电泳根据在第二第一维和分子量等电点分离蛋白。由于翻译后修饰,如磷酸化影响的蛋白质的等电点和分子量,2D凝胶可检测不同样品中的蛋白质的磷酸化状态之间的差异。蛋白质的大小(面积和强度)掩护变化与蛋白质的表达水平,允许多个样品间的定量比较。使用这种方法,我们能够区分磷酸化蛋白质在野生型与突变线粒体靶向CDK1表达细胞。特定蛋白质斑点,在野生型显示,但在线粒体靶向突变CDK1制备失踪分离并通过质谱法鉴定。

在传统的2D凝胶,三苯甲烷染料被用来可视化凝胶上的蛋白质。 2D-DIGE使用荧光蛋白标签与蛋白质的电泳迁移率的影响最小。不同的蛋白质样品可以用不同的荧光染料,混合在一起,并通过相同的凝胶上分离,从而允许在单一凝胶16多个样品的共电泳进行标记。这最大限度地减少了凝胶到凝胶变体,它是在基于凝胶的蛋白质组学研究的一个关键问题。

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Protocol

1.从培养细胞线粒体的分离

  1. 分离缓冲液的制备细胞(IBC)缓冲
    1. 制备的0.1M Tris / MOPS(三(羟甲基)氨基甲烷/ 3-(N-吗啉代)丙磺酸):将12.1克的Tris在800毫升的蒸馏水中,使用MOPS粉末调节pH值至7.4,加蒸馏水至总在4℃的1升和存储量
    2. 制备0.1M的EGTA(乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸)/的Tris:将38.1克的EGTA在800毫升的蒸馏水中,使用的Tris粉末调节pH值至7.4,加蒸馏水至1升,总体积并保存在4℃
    3. 制备的1M蔗糖:溶解34.23克在100毫升的蒸馏水中的蔗糖,使20毫升等份,并储存在-20℃。
    4. C缓冲区通过加入10ml的0.1M Tris / MOPS和1ml的0.1M EGTA /的Tris至20ml制备100ml的IB:制备IB C缓冲区; 1M的蔗糖。加蒸馏水至100ml的总体积。调节pH至7.4。
  2. 细胞裂解液的制备
    1. 制备含有20mM Tris-盐酸(pH值7.5),150毫摩尔NaCl,1mM EDTA中(乙烯二氨基四乙酸),1mM的EGTA裂解缓冲液,1%的Triton-X-100的2.5mM焦磷酸钠,1mM的β-甘油磷酸盐,1mM的原钒酸钠。使用前右添加蛋白酶抑制剂1微克/毫升亮肽素和1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)。
  3. 线粒体的分离
    1. 收获3×10 7细胞用冰冷的1×PBS(磷酸盐缓冲盐水),pH值7.4和离心的细胞以600×g离心10分钟,在4℃弃去上清液并重新悬浮在5毫升冰冷的IB C缓冲区沉淀。
    2. 均质使用玻璃/玻璃组织研磨约10分钟的细胞。转移匀浆至15ml管中并离心,在600×g离心10英里北,4℃为功能性线粒体,使用玻璃/特氟隆耦合,因为它是线粒体比玻璃/玻璃组织研磨机损害较小。
    3. 收集在7000 XG 10分钟,取上清液进入1.5毫升管和离心4℃将上清转移到1.5ml管,并保存为胞浆蛋白。
    4. 4℃洗涤沉淀(线粒体)两次用200微升冰冷的IB C缓冲区和离心机在7000 XG 10分钟
    5. 弃上清,重新悬浮在细胞裂解液沉淀,并立即使用或在-80℃下以备将来使用存储。弃去上清液后,如果需要的功能的线粒体,重悬浮在剩余缓冲器沉淀。稀释线粒体级分进一步可能导致的线粒体功能的丧失。储存在冰上,并在1使用制备 - 3小时,以取得最佳效果。
    6. 超声处理的再悬浮沉淀用于在30 3秒的脉冲串冰浴,离心机以10,000×g离心5分钟,并保存上清液作为线粒体级分。

CDK1,其CyclinB1和COXIV,线粒体蛋白质居民2.联合免疫

  1. 生长在盖玻片上5×10 4个细胞在24孔板中的O / N或高达70%汇合。吸出培养基并用500μl冰冷的1×PBS,pH值7.4洗细胞两次。
  2. 固定用在RT 500微升冰冷的4%多聚甲醛10分钟的细胞。吸定影液和用500μl1×PBS中的3次,每次用轻轻摇动在RT 5分钟洗细胞。
  3. 透用0.2%的Triton X-100将细胞在500微升PBS中在RT下5分钟。吸出溶液和洗涤细胞3次,每次5分钟用500微升PBS中。添加封闭溶液(500微升,在含有1%吐温20的PBS的1%BSA(牛血清白蛋白))在室温30分钟。
  4. 稀释第一抗体1:250(体积比)在5001;在不同的物种中产生所需的初级抗体阻断溶液并孵育细胞,以避免交叉信令l的(CyclinB1的(小鼠)和COXIV(兔)或CDK1(小鼠)和COXIV(兔)在RT 30 - 60分钟或O / N在4℃
  5. 用500μl的1×PBS中的3次,每次5分钟洗涤盖玻片,然后用稀释的第二抗体孵育:于500μl阻断在RT溶液1小时,接着用500微升PBS洗涤3次,每次5分钟1000。
  6. 安装20微升防褪色的安装解决方案的盖玻片和密封用指甲油的幻灯片。图像使用荧光显微镜马上或幻灯片保持在黑暗中,在4℃下1 - 2周。

3.完整的线粒体的碳酸钠提取

  1. 生长约20×10 7个细胞,收获,用PBS洗一次并分离线粒体如第1除法线粒体所述隔离成两个参数最后离心以沉淀线粒体(步骤1.3.4之前)之前的TS;保存一半用作总线粒体(步骤3.2)中,使用另一半碳酸钠萃取(以下步骤3.3-3.6)以分离可溶和膜结合的蛋白质。
  2. 裂解总线粒体沉淀用细胞裂解液的30微升和裂解储存在-80℃下,直到免疫印迹使用。
  3. 加入250微升的0.1M Na 2 CO 3(碳酸钠),pH值11.0,向线粒体粒料的另一半,并在冰上孵育30分钟。
  4. 离心以100,000×g离心20分钟。收集上清并继续执行步骤3.5。裂解用30微升细胞溶解缓冲液并声处理的如在步骤1.3.6沉淀。在-80℃下保存,直到免疫印迹使用。
  5. 的20%的新鲜的三氯乙酸(TCA)等体积添加到上清液以沉淀蛋白质,并保持在冰上30分钟。
  6. CentrifUGE以15,000 xg离心10分钟。弃去上清液,在-80℃下溶解在80微升细胞裂解液和储存的颗粒直到免疫印迹使用。

4,线粒体的内膜和外膜(Mitoplasts的分离)的分离

  1. 生长约20×10 7个细胞,收获,用PBS洗一次并作为最后的离心沉淀线粒体(步骤1.3.4之前)在第1分开的线粒体级分中描述成10等分隔离线粒体。
  2. 溶解在低渗蔗糖缓冲液中指定浓度的30微升每粒料(1毫摩尔EDTA,10毫MOPS / KOH(氢氧化钾),pH值7.2;蔗糖浓度从25测距 - 200毫米)具有或不具有50μg/ ml的胰蛋白酶( 见表1),并在冰上孵育30分钟。
  3. 加入3微升10毫的PMSF(达到1毫PMSF的终浓度)至含有小瓶停止t时胰蛋白酶他胰酶消化,并在冰上孵育10分钟。
  4. 离心在4℃下10分钟14000 XG。在-80转移上清液到新的管中,在细胞裂解缓冲液,声处理30微升裂解沉淀如在步骤1.3.6和存储℃。

5.构建线粒体靶向GFP / RFP标记中CyclinB1 / CDK1载体的构建及线粒体定位的确认

  1. 克隆靶向序列的线粒体(MTS;来自人细胞色素C氧化酶亚基8A(COX8的前体衍生的核苷酸之间76) - 161)在帧分成GFP的N-末端或RFP在质粒pEGFP-N1或pERFP的NheⅠ和BamHⅠ位点-N1载体使用标准分子克隆技术。
  2. 当设计中CyclinB1和CDK1基因的PCR引物,添加BamHⅠ限制性酶识别位点(粗体)的5'的PCR引物。
    正向CDK1 BamH1位5'CAG牛逼GG ATCÇAA TGG AAG ATT ATA CCA AAAŤ
    反向CDK1 BamH1位5“CTG牛逼GG ATCÇTG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    CyclinB1的正向5 BamH1位“ATA TGG ATC CAA TGG TCC CGC TCA GAG
    反向CyclinB1的BamH1位5“ATA TGG ATC CTG C​​AC CTT TGC CAC AGCÇ
  3. 放大用这些引物根据标准技术CDK1和CyclinB1的基因。消化的PCR产物用1微升BamHⅠ限制性酶于37℃2小时。运行在1%琼脂糖凝胶的消化产物。使用刀片,切割正确-sized DNA片段并纯化从使用凝胶提取试剂盒凝胶中的DNA。
  4. 消化MTS-的pEGFP-N1和与1微升的BamHI酶的MTS-pERFP-N1质粒1微克,在37℃2小时。加入1μl小牛的INTEStinal碱性磷酸酶(CIP)在37℃,30分钟。运行在1%琼脂糖凝胶的消化产物和纯化从凝胶线性质粒如步骤5.3。
  5. 通过从步骤5.4和5μlCDK1或中CyclinB1的来自步骤加入1微升质粒5.3到3微升连接酶缓冲液,0.5微升T4连接酶的,和20.5微升的dh 2 O的设置了连接反应孵育O / N在4℃。
  6. 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞用连接混合物的10μL的下列标准技术和生长的细菌中的10毫克/毫升卡那霉素的含有LB琼脂平板上O / N在37℃以获得菌落。
  7. 挑选出由O殖民地/使用无菌枪头ñ生长板,将尖端插入5毫升含卡那霉素-LB-管和孵育O / N。隔离根据制造商的方案使用小量制备试剂盒的质粒,并用标准技术测序质粒。
  8. 转成倍增长MCF10A细胞(接种在96-孔板1.5×10 4个细胞)与来自步骤5.7的MTS-CDK1-RFP或MTS-CyclinB1的-GFP质粒通过制备1的质粒/转染试剂:2的比例(重量:V,100毫微克:0.2微升)在100μl无血清和无抗生素的培养基。
  9. 孵育在质粒/试剂混合物的细胞48小时,在37℃在CO 2培养箱的湿度控制(5%CO 2,相对湿度95%)。
  10. 通过在100μlDMSO中溶解粉末的50微克制备线粒体红色和绿色荧光染料的1mM储备溶液。稀释储备溶液1:400在1×PBS中,以得到2.5微米的工作的解决方案。储备溶液可以储存在-20℃下一年。
  11. 混合2微升的红色染料2.5μM用培养基98微升,以制备50nM的最终浓度。
  12. 用含有培养基2分钟红色染料取代CyclinB1的-GFP轴承MCF10A细胞(在步骤5.8中产生)的细胞培养基。重复同样的过程与CDK1-RFP轴承MCF10A细胞绿色染料。
  13. 用100μl1×PBS洗涤两次,以摆脱过量染色溶液,1×PBS中添加100微升到96孔板中。
  14. 可视化的线粒体和CyclinB1的-GFP(通过在494 488 nm,发射激发 - 536 nm),而CDK1-RFP(通过在565 560 nm,发射激发 - 620纳米)上的96孔板在荧光显微镜下以40倍的放大倍率。

6.通过2D-DIGE差异磷酸化蛋白质的鉴定

  1. 样品制备
    1. 隔离线粒体并裂解线粒体级分如步骤1.3。添加20%三氯乙酸(在水中三氯乙酸),以每个样品并涡旋15秒的等体积。孵育的样品在冰上30分钟的蛋白质溶液中沉淀出来。
    2. 离心样品在4℃,9300 XG 5分钟,取出上清液,加入60微升冷丙酮(100%),其次是离心在4℃9300 XG 5分钟。
    3. 重复丙酮洗涤步骤(步骤6.1.2)一次,除去上清液,并重新悬浮在50μlDIGE标记缓冲液(7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,30毫摩尔Tris,pH值8.5)的样品。
  2. 准备荧光染料
    1. 制备储备溶液:将在5微升新鲜二甲基甲酰胺(DMF)的染料(5纳摩尔)至1纳摩尔/微升的最终浓度。储存在-20 摄氏度股票染料溶液直到使用了几个月。
    2. 制备工作溶液:允许染料设置在RT 5分钟。稀释1μl的用4微升DMF中的染料的200皮摩尔/微升的最终浓度。置于冰上使用过程中。注意:工作溶液在-20℃下保存3个星期。
  3. 标签蛋白质
    1. 将1微升每工作12.5微克蛋白染料溶液。根据需要扩展。对于池的标准,加61;对工作的Cy2解决方案,汇集蛋白300微克湖
    2. 涡旋30秒和离心机在4℃下以12,000×g下30秒。在冰上孵育在黑暗中30分钟。加入1微升每工作溶液1微升用的10mM赖氨酸的停止标记。拌匀,并在黑暗中在冰上孵育10分钟。
    3. 池单独标记的样本及与再水化缓冲液(7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,1.2%destreak,1%pharmalytes,溴酚蓝)混合。总成交量将125微升。
    4. 30秒涡旋样品,并允许样品设置在RT 30分钟。负载125微升样品到7厘米pH为4 - 9,等电聚焦(IEF)的条。
  4. 第一维电泳
    1. 广场上的电极板带材持有人(棺材),确保带人是完全清洁和干燥。吸取125微升样品成棺材,整个棺材均匀扩散。
    2. 使用tweezeRS,拿起IEF带,小心撕下塑料保护盖,并将其放置(凝胶面朝下)放入棺材/补液缓冲区。避免诱捕气泡。慢慢地填满棺 - 与矿物油(1 1.5毫升),并把棺材上覆盖的棺材。
    3. 开始等电聚焦以下表2中的协议:
      注意:一旦运行完成后,可以带在-80℃下储存于塑料管或直接转移到平 ​​衡和第二维。
  5. 第二个维度-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
    1. 平衡
      1. 解冻SDS平衡缓冲液(每片8毫升,6M尿素,30%甘油,2%SDS)中。称出二硫苏糖醇(DTT;每1ml SDS平衡缓冲液10毫克DTT)中。 DTT溶解成4毫升SDS平衡缓冲液。
      2. 称出IAA(碘乙酰胺,每1ml的SDS平衡缓冲液25毫克IAA)。IAA溶解成4毫升SDS平衡缓冲液。
      3. 熔体1毫升密封在水浴以备后用琼脂糖溶液。
      4. 如果带被冻结,让他们完全解冻。地方剥离胶的一面朝上放入托盘再溶胀。用DTT添加4毫升SDS平衡缓冲液至每个条孵育轻轻摇动15分钟。
      5. 倒掉所有的DTT SDS平衡缓冲液。与IAA添加4毫升SDS平衡缓冲液到每个带材和孵育轻轻摇动另外15分钟。与IAA缓冲平衡后,倒入SDS平衡缓冲液。
    2. SDS-PAGE上
      1. 解开小型凝胶,取出梳子和冲洗凝胶和的DDH 2 O.井在凝胶底部运行之前,取出白色胶带。定位正确的凝胶带,硅胶方向是当场切割的关键。
      2. 将凝胶平放在柜台与中小板和凝胶顶部面临Ëxperimenter。铺设带材到具有阳极端高大板(++与条形码结束)的面向凝胶的左侧。用一把尺子,慢慢往下推带至凝胶表面。避免捕集带材和凝胶之间的气泡。站在玻璃板立场凝胶起来。
      3. 1毫升热封琼脂糖溶液加入到盒的开口。确保所有气泡压出采用平尺。组装该装置,并以恒定125 V运行凝胶90分钟。
      4. 当凝胶运行完毕,放置在用2毫升DDH 2 O的生物分子成像仪,凝胶和扫描与635 nm激发激光器和665nm的发射滤光片的荧光采集模式的凝胶。
    3. 磷染色
      1. 修复用50%甲醇和10%乙酸的混合物(10毫升)30分钟的凝胶的两倍。用10毫升的水冲洗10分钟,三次和染色用10ml磷蛋白染色为60 - 90分钟,随后用10ml脱色溶液30分钟三次脱色。
      2. 用10ml水清洗5分钟,两次,图像的凝胶在532纳米/ 560纳米激发/发射的激光凝胶扫描仪。
    4. 蛋白质的消化和鉴定
      1. 消费的所有差分使用根据制造商的说明机器人点选取器表示从凝胶到微孔板蛋白质斑点,和1小时在室温添加100mM碳酸氢铵(2ml)中脱色的凝胶片。用2ml 100%乙腈脱水,在真空浓缩洗两次,并干燥30分钟。
      2. 再水化凝胶片用在50mM碳酸氢铵100μl的13毫微克/微升改性猪胰蛋白酶的16小时在37℃。收集上清液,并进一步用100μl的5%三氟乙酸中提取的蛋白质中的50%乙腈30分钟。
      3. 通过真空离心机concent集中肽降至5微升rator和基质辅助激光解吸电离分析-飞行时间-串联质谱法分析(MALDI TOF-MS / MS)17。

7. 在体外激酶分析

  1. 基材准备。
    1. 子克隆复合体I(CI)的亚基(NDUFV1,NDUFV3,NDUFS2,NDUFB6和NDUFA12),其被鉴定为差异磷酸CDK1目标,到pGEX-5X-1的矢量,以产生谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-tagged细菌表达质粒11。用净化后的协议之下的高亲和性谷胱甘肽列CI亚基。
      1. 培养GST标记的含大肠杆菌菌株BL-21中的Luria-BERTANI(LB)肉汤中在37℃摇动50微克/毫升氨苄青霉素的直到0.6达到光密度(OD)CI亚基。异丙基BD-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加到崇拜URE为0.1毫米的最终浓度,并孵育额外的3小时。
      2. 离心机在600×g离心10分钟以收集细菌,重悬浮于5ml含5mM的DTT,1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒1×PBS缓冲液和0​​.1%的溶菌酶。裂解的细胞通过超声处理二十5秒的脉冲串,并通过离心在600 xg离心除去细胞碎片10分钟。
      3. 收集上清液并在4体积比与谷胱甘肽 - 琼脂糖4B珠孵育:1(上清液:珠)在RT 1小时。
      4. 洗脱从珠的GST融合蛋白用3ml谷胱甘肽洗脱缓冲液中的分子多孔膜管道(10毫在50mM的Tris-HCl,pH 8.0的还原的谷胱甘肽),并经受洗脱蛋白质透析(分子量截止12 -14千道尔顿)用1×PBS / 1mM EDTA中。存储纯化的蛋白质在- 80℃。
  2. CDK1激酶分析
    1. 在此之前开始激酶屁股AY,设置加热块到30℃和100℃。解冻商业中CyclinB1 / CDK1酶复合物,并在冰上基板。
    2. 准备冰上反应混合物。由于32磷ATP同位素参与,准备在1.5ml样品管所有的反应混合物含O形环,以防止放射性物质扩散螺丝帽。
      注意:按照放射性物质保护规则。至少在一个手臂的长度,使用一个8毫米厚的有机玻璃屏蔽和工作。擦拭与水以任意污染区。
    3. 制备含1×CDK1缓冲液(50mM的Tris-HCl,10毫氯化镁,2毫摩尔DTT,1毫EGTA,0.01%的Brij 35,pH值7.5),0.6毫冷的ATP,0.1微居里32 p ATP的30微升反应缓冲液, 2单位中CyclinB1 / CDK1和底物蛋白质的6微克。将音量调节到30微升用的DDH 2 O.为阳性对照反应,代替用0.01毫组蛋白H1,一个公知的中CyclinB1 / CDK1基底基板。
      1. 对于负CONTRO升的反应,(1)替换为只GST蛋白质和(2)用0.01毫组蛋白H1 + 0.5μMRO-3306,选择性CDK1抑制剂替换衬底基板。
    4. 用移液管和离心机拌匀,使所有液体管的底部,最小化污染的风险。孵育在30℃下60分钟。
    5. 添加6微升5×SDS样品缓冲液以终止反应,并在100℃下变性10分钟。 2小时在160 V于10%的SDS-PAGE凝胶上运行样品,或直至染料前沿到达凝胶的末端。凝胶转移到一个色谱纸并用保鲜膜包好。
      注意:与放射性同位素接触的所有液体应该被视为放射性废物和由环境健康与安全服务机构按规定的准则5加仑聚坛处置。
    6. 露出凝胶于X射线胶片1天或根据使用放射性同位素的比活性长达1周在-20℃下和酶。

8.定点突变,以产生显性负CDK1(D146N)

  1. 设计诱变引;两个引物,以彼此互补的,含有突变位点(G将由核苷酸替换为N个而不是D氨基酸酸编码)由20个碱基每侧11两侧。
  2. 制备50微升聚合酶链反应含有1x反应缓冲液(PCR)混合物,2.5毫的dNTP,引物10μM的(正向和反向),40纳克的模板,和的DDH 2 O添加2.5单位DNA聚合酶到反应。
  3. 运行以下PCR程序:95℃3分钟,95℃30秒,55℃,30分钟,68℃6分钟; 16个周期(注:68℃孵育时间是由该DNA的大小决定1分钟/ kb需要的DNA≤10kb的对于较大的DNA,2分钟/ kb加上每个循环10秒。)。 68℃7分钟按照在4℃下按住,直到准备使用。
  4. 加2微升DPN限制性内切酶(10U /微升)和5.7微升DPN我缓冲液,用手指轻轻敲击拌匀,在37℃下反应1小时。
  5. 将10微升DPN我处理过的PCR产物到50微升DH5α感受态细胞进行转化。在冰上孵育30分钟,接着45秒热休克在42℃下和5分钟在冰上。加入500微升的LB和电镀到LB琼脂平板上之前,在37℃下摇动1小时。孵育O / N在37℃。
  6. 从Ô挑取菌落/ N种植用无菌黄色的枪头琼脂平板上,滴尖到含有5ml的LB的试管中,在37℃摇床增长O / N。使用小量制备试剂盒分离质粒并测序质粒按照制造商的协议来确认突变。

9.测定细胞周期长度的用EdU掺入法

  1. 细胞分选
    1. TRansfect 2×10 5细胞用所示载体(MTS-GFP / RFP,MTS-CyclinB1的-GFP / CDK1-WT-RFP或MTS-CDK1-DN-RFP)中使用1-一个6孔板:2(重量:v 2.5微克:5微升)的DNA的比率:转染试剂混合物在2.5ml无血清和无抗生素的培养基48小时来制备。活排序细胞经由流稳定表达GFP标记CDK1和RFP标记CyclinB1的蛋白血细胞计数。
      1. 洗涤细胞用1×PBS,加100微升胰蛋白酶入菜,并在37℃孵育5分钟。加2ml培养基以收集细胞,并通过他们通过一个70微米的过滤器,以产生单细胞悬浮液。它们装载到流式细胞仪之前用在PBS(FCS / PBS)的500μl的1%胎牛血清的洗涤单细胞悬浮液。
      2. 设置按照既定协议,18门与GFP和RFP染色双阳性细胞分选参数。收集的分选的细胞出来的细胞仪的成管,包含3宁细胞培养基,并利用这些细胞用EdU脉冲追踪标记细胞周期进程的分析如在协议9.2。
  2. 细胞周期长度使用这些EDU标签流式细胞仪分析测量
    1. 种子分选的细胞在6孔板中,每孔和培养O / N为2.5×10 5个细胞在37℃下在CO 2培养箱中的密度。添加的EdU到培养基中,在25微米的最终浓度。在CO 2培养箱中1小时在37℃下。
    2. 洗涤细胞用1%BSA于500μlPBS中并在2小时的时间间隔收集它们在1.5ml试管,共10 - 12小时。
    3. 离心细胞,在350×g离心5分钟,弃上清。通过加入100微升的在室温15分钟定影液(所述的EdU标记试剂盒中由制造商提供)移去沉淀并充分混合。
    4. 洗涤细胞用1毫升的PBS三次的1%BSA的。修复细胞再次用0.5毫升70%的乙醇O / N在4℃
      注意:乙醇定影是淬灭内部GFP / RFP荧光临界由于重组标签蛋白的表达。
    5. 再次离心细胞,在350×g离心5分钟,并用PBS中1毫升%BSA洗一次沉淀。重悬在1ml透化缓冲液(0.1%的Triton-X-100的1%BSA,0.2毫克/毫升RNA酶A的PBS)的细胞在室温20分钟。
    6. 洗涤细胞用1ml PBS中的1%BSA的一次。加入0.5毫升反应鸡尾酒每管拌匀。孵育在室温下反应混合物在黑暗中30分钟。
    7. 在PBS中1毫升%BSA在PBS中一次1毫升1%的BSA和染色的DNA用50微克/毫升碘丙锭(PI)洗涤。
    8. 用流式细胞仪分析细胞遵循的教育和积极的人口。染色DNA含量EDU-标记的细胞(PI染色,X轴)和埃杜(Alexa的647染色,Y轴)目前散点图。
      1. 使用亚历克斯APC渠道a647-EDU利用三十分之六百七十带通滤波器与所有光线目前小于685纳米击中该过滤器;和藻红蛋白(PE)信道来与在它前面的所有的光目前小于600纳米击中该过滤器15分之581带通滤波器PI。
      2. 将第一张含管细胞进入流式细胞仪和用于采集标准的门控策略:地块FSC-X区SSC-区形态其次是PI(PE通道)×Alexa647-EDU(APC通道)的细胞染色。所有管逐一采集每个样品10000个事件记录数据。
      3. 确定使用流式细胞以下建立的协议11,30的数据分析软件的流动细胞和相位长度的细胞周期时相分布。

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Representative Results

中CyclinB1和CDK1的亚线粒体定位

碳酸钠提取用于确定一种蛋白质是否位于线粒体内或外表面,即外膜上。一旦蛋白被示出为在线粒体内本地化,亚线粒体定位的进一步确定可以通过用蛋白酶消化mitoplasting组合制成。来指定其CyclinB1或CDK1的副线粒体定位,mitoplasts通过稀释在低渗缓冲液线粒体与200毫渗透蔗糖浓度降低至25mM的隔离。外膜开始于蔗糖的150mM的破裂,而内膜保持完好直至在( 图1A)的蔗糖的25mM的终浓度。在与mitoplasting组合,蛋白酶保护测定可使用tryps进行在消化之后外膜破裂暴露的蛋白质。这将导致在间空间的蛋白质消化。如果感兴趣的蛋白是从胰蛋白酶消化的保护,这表明该蛋白质的线粒体基质定位。在这个代表性的人物,线粒体基质蛋白Hsp60的,和膜间隙蛋白质Timm13被用作子线粒体定位标记。与Hsp60的但不像Timm13,CyclinB1的和CDK1类似被保护,胰酶消化,表明其线粒体基质中的定位( 图1B)。

MTS-和GFP标记中CyclinB1和CDK1蛋白表达线粒体

MTS是在帧中的CyclinB1的或CDK1基因的N末端,其在它们的C-末端具有GFP或RFP的标签克隆。所得的重组蛋白是线粒体定位的GFP-或RFP标记赛扬clinB1或CDK1。产生并在此研究中使用的构建体的列表显示在图中。使用这些构建体,CyclinB1的和/或CDK1在线粒体的过表达来实现,由分离的线粒体级分的蛋白质印迹这里所示( 图2)。

其CyclinB1 / CDK1的潜在目标线粒体通过2D-DIGE测定

CDK1属于丝氨酸/苏氨酸(S / T)激酶家族催化磷酸从ATP转移至脯氨酸(P)的取向S或T残基。 ,在CDK1(D146N)的146位替换天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)残留的点突变产生显性负(DN)CDK1突变19。研究线粒体CDK1的功能,通过构建的质粒产生的线粒体靶向CDK1-DN蛋白(pERFP-N1 MTS-CDK1-dn)中含有29个氨基酸,经度与吸烟有关的RFP标记的DN-CDK1人类细胞色素C氧化的VIII亚基的G线粒体定位序列(MTS)。制备线粒体靶向ERFP蛋白pERFP-N1 MTS被用作空载体对照。在G2线粒体磷酸化蛋白/既构建体转染M细胞被与pH值4-10胶条的二维凝胶分析概要分析。用空载体转染( 图3,上图)相比,一组线粒体磷蛋白的显然是不存在或在CDK1-DN转染( 图3,下图)下降。检测到的点的质谱分析测定由CDK1在线粒体磷酸的蛋白的身份。

细胞周期和测定期长度的用EdU脉冲追踪分析

为了研究细胞周期磨片的进展Ñ ​​线粒体中CyclinB1 / CDK1水平提高,使用胸苷类似物的脉冲追踪标记实验,乙炔基脱氧尿苷(EDU)进行标记经历DNA合成的20个细胞的群。此方法允许细胞周期通过跟踪的EdU阳性人群时,细胞通过S和G2 / M期的进展和G1期积累捕获在一个22小时的窗口的可视化。结果表明标记的S期细胞的进展通过G2 / M期并出现在G1期尽可能快4小时在细胞中表达野生型线粒体中CyclinB1 / CDK1相比,6小时在用矢量控制或突变CyclinB1的/转染的细胞CDK1( 图4A),这表明线粒体中CyclinB1的该增强/ CDK1加速的细胞周期进程。

图1
图1. 线粒体细胞周期蛋白1 / CDK1本土化矩阵。(AB)中CyclinB1和CDK1的亚线粒体定位由mitoplasting和蛋白酶保护法检测,数字已经从王某等人在 2014年11修改。总(T),沉淀(P)和上清液(S)组分进行用所示抗体免疫印迹分析。 TIMM13(一个空间间蛋白)和HSP60(基质蛋白)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
(质粒表示图2 线粒体CDK1构建体的表达。从线粒体CyclinB1的针对性和/或野生型或显性负突变体转染CDK1细胞中分离出的线粒体分数的印迹在底部11。的pEGFP-N1-MTS和pERFP-N1-MTS载体是为MTS-CyclinB1的和MTS-CDK1分别)空载体对照。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. CDK1的潜在线粒体基质。从线粒体有针对性的空载体(pERFP-N1-MTS,上图)或突变CDK1(pERFP-N1-MTS-CDK1-DN转G2 / M-见顶细胞中提取的线粒体蛋白质,下图)分别用Cy5标记(绿色),由2-D凝胶上分离和磷酸化蛋白染色用磷染料(红色)。这个数字已经从王某等人。201411修改。“>请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. 线粒体CDK1提高G2 / M过渡和整体周期进程。
用EdU脉冲追踪标记细胞周期分析。的EdU标记的细胞的散点图直方图绘制为DNA含量(X轴)和埃杜(Y轴)。在每个面板的下图显示的EdU的平均荧光强度标记核。分别表示在小时时间点脉冲的EdU 11日之后。对于所有时间点,门显示以下种群得出:G0 / G1期,S和G2 / M期。 6,8和10小时的时间点,埃杜标记G1 *,S / G2 *,和G2 / M *种群被示出。这个数字已经从王某等人修改,2014年11 请点击此处查看该图的放大版本。

使用浓度蔗糖
没有胰蛋白酶 25毫米 50毫米 100毫米 150毫米 200毫米
+胰蛋白酶 25毫米 50毫米 100毫米 150毫米 200毫米

表1.低渗蔗糖缓冲器用于步骤4.2

步骤1 30 V 12小时步骤和保持
第2步 300 V 0.5小时步骤和保持
第3步 1,000V, 0.5小时梯度
至5,000V 1.33小时梯度
第5步至5,000V 20000 V小时步骤和保持

表2.等电协议用 ​​于步骤6.4.5

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Discussion

往其他亚细胞蛋白质一样,线粒体有针对性的蛋白质具有自己的原发性或继发性结构中的定位信号,即引导他们以精心的蛋白质易位和折叠机21,22的帮助下,细胞器。线粒体靶向从独占线粒体驻地蛋白质如COX8获得的序列(MTS)可以被添加到任何基因序列的N末端 ​​至特异性蛋白靶向进入线粒体11,23,24。这里,其CyclinB1和CDK1基因克隆到含有载体COX8 MTS和表达时,重组CyclinB1的和CDK1被本地化为线粒体。这种方法的优点是,它使基因表达的修饰在特定亚细胞隔室,在此情况下线粒体,在不改变整体的基因表达。有了这个战略,线粒体特定核激酶的功能,CDK1被取消termined。同样,通过加入MTS来显性负CDK1,击倒的CDK1的特定线粒体功能达到了,这使线粒体CDK1的特定目标的识别,并启用的线粒体缺失CDK1功能的功能后果的分析。 CDK1的表达,而不在这两个线粒体和细胞核CD​​K1表达增强多边贸易体制的标签结果,因此,复杂的CDK1比线粒体行动的后果进一步调查。

然而,正如我们已经在通过加入MTS的标签把一些激酶进入线粒体经历了几次失败的尝试这一方法可能不适合所有基因产物。某些细胞系可以是转染相当抗性,并发现最佳的协议可能是耗时。即使当细胞是健康的,转染是成功的,荧光标记的蛋白质的工作表现出一些问题SUCH作为聚合,不正确的定位,非功能性融合体,和弱的信号。

线粒体和mitoplasts的隔离的主要限制包括从其它细胞或亚线粒体区室的低收率和可能的污染。有人建议,贴壁细胞不通过常规的化学或机械的方法有效地破裂,因此,使得难以从培养的粘附细胞获得高数量的线粒体。在这里,我们利用MCF10A细胞贴壁培养。得到约30 - 50微克线粒体蛋白质,3的起始量- 5×分别利用10 7个细胞。同质化的步骤是线粒体制剂的最终产量的另一个临界点。根据所使用的细胞系,中风和/或均化的时间的数量可以变化。为MCF10A细胞,我们观察到,通过玻璃/玻璃匀浆均质化10分钟是必需的,而小鼠胚胎fibroblaSTS(MEF)只需要3 - 5均化分钟。因为过度均化可能造成对线粒体膜的损伤,并触发线粒体成分的释放,对于每种细胞系的标准条件应根据经验来确定。使用玻璃 - 玻璃匀浆的增加相比,玻璃/特氟龙匀浆线粒体制剂的产率。细胞的起始量以及细胞的冷冻/解冻可能改变必需破开细胞笔划的数量。最后,蛋白质变性和聚集可能由于均化过程中样品的局部加热发生。它是,因此,必须预先冷却的组织研磨机和在此过程中保持在冰上的样品。

在这篇文章中提出的另一种方法是使用的EdU标记,以实时监测细胞周期。的EdU是一种改性的胸苷类似物,其荧光是一个明亮,光稳定的Alexa Fluor染料标记。的EdU是艾菲ciently掺入新合成的DNA。这个方法是利用增殖细胞与核苷类似物,溴脱氧尿苷(BrdU)标记的传统标签的一个更好的选择。活性的DNA合成过程中的BrdU掺入DNA中。的BrdU标记的DNA的定量通过比较苛刻的方法,如高温或高酸性暴露了BrdU的抗体结合的BrdU分子要求DNA变性。用于DNA变性严酷治疗可能影响样品的质量和费时。用EdU,洗涤剂透通常是足够的的EdU检测试剂来访问该DNA。而不需要使用苛刻的化学品或热进行DNA连接,所述的EdU方法是更容易使用,更准确和一致。除了提供的EdU的优势,一直存在关于使用埃杜研究扩散的担忧。的EdU表明超过72小时的治疗轻微的抗增殖活性,这可以减少到negl当脉冲的EdU保持igible水平在1小时25。

用EdU标记采用的一个变形例是在固定的时间和方法。该试剂盒建议一个15分钟的固定与所提供的定影液。然而,用70%乙醇的额外的固定是利用在该实验。有两个原因使用乙醇:1)跟踪随时间变化的细胞周期进程,进行时间点实验,其中收集细胞,每2小时。将细胞 4℃保持在70%的乙醇,直到所有的实验时间点的已经完成。实际上,细胞可以保持在70%乙醇较长(数周至数月),如果需要的话。 2)用于实验的细胞稳定地与GFP标记CDK1和/或RFP标记CyclinB1的转染。若要从GFP / RFP荧光分开的EdU和PI信号,乙醇固定是利用变性GFP和RFP的蛋白质,因此在执行这些EDU的前解其荧光ðPI染色。变性的GFP / RFP蛋白是基本上完全无荧光,这大概是因为在色团不再从淬火26,27的保护。

以确定CDK1的线粒体靶,2D-DIGE法,这是优于传统的2D凝胶在许多方面使用。在2D-DIGE,不同的荧光染料, 例如 :中,Cy 3,第5和2中,用于标记的样品,其允许在一个凝胶上高达3个样品,减少的变异,而不需要运行重复像在标准的2D凝胶。在2D-DIGE使用的荧光染料具有相比,在100毫微克/点,因此,这需要在2D-DIGE凝胶与高点的分辨率和运行蛋白量较小三苯甲烷类染料的0.2纳克/现货灵敏度非常高出版质量凝胶扫描。自动软件被用于检测,量化和限定差异表达的蛋白质。由于高点分辨率,差分样品中蛋白质表达CAn为使用软件辅助现货量化比较准确;低至10%的差异可以通过2D-DIGE进行检测,容易使翻译后修饰的可视化。利用软件辅助在凝胶分析也可以更快地获得数据。然而,由于设备,如荧光扫描仪,需要进行图像采集,使用这种方法产生额外的费用。 2D-DIGE的其它限制包括疏水蛋白的差表示,以及与极端等电点和很大的分子量28,29蛋白质。使用替代的技术,如免疫细胞化学或免疫印迹以2D-DIGE获得的结果进一步验证须确认新发现。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

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References

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