Eksperimentelle tilnærminger til å studere mitokondrie lokalisering og funksjon for en kjernefysisk Cell Cycle Kinase, Cdk1

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

I pattedyr, er cellesyklusprogresjon avhenger sterkt organisert hendelser som styres av cykliner og cyklin-avhengige kinaser (CDK'er) 1. Gjennom sitt cytoplasma, kjernekraft, og centrosomal lokalisering, er CyclinB1 / Cdk1 i stand til å synkronisere ulike hendelser i mitosen som kjernekraft konvolutt sammenbrudd og sentrosomen separasjon to. CyclinB1 / Cdk1 beskytter mitotiske celler mot apoptose 3 og fremmer mitokondrie fisjon, et avgjørende skritt for en lik fordeling av mitokondriene til de nydannede dattercellene 4.

I prolifererende mammalske celler blir mitokondriell ATP genereres via oksidativ fosforylering (OXPHOS) maskiner (elektrontransportkjeden), som er sammensatt av 5 fler subenhet-komplekser; kompleks I - kompleks V (CI-CV). Nikotinamidadenindinukleotid (NADH): ubiquinone oksidoreduktase eller kompleks I (CI) er den største og minst forstått av de fem komplekser 5. Komplekset consists av 45 subenheter, 14 som danner det katalytiske kjerne. Når sammenstilt, i komplekset forutsetter en L-formet struktur med en arm som rager inn i matrisen, og den andre armen innleiret i den indre membranen 6,7. Mutasjoner i CI subenheter er årsaken til en rekke mitokondrie lidelser 8. En funksjonelt effektiv CI i OXPHOS er nødvendig ikke bare for total mitokondriell respirasjon 9, men også for vellykket cellesyklusprogresjon 10. Unravelling mekanismene bak bruken av denne membranbundet enzymkompleks i helse og sykdom kan føre til at utvikling av nye diagnostiske prosedyrer og avanserte terapeutiske strategier. I en fersk undersøkelse, har vi funnet at CyclinB1 / Cdk1 kompleks translocates i mitokondriene i (Gap 2) G2 / (Mitosis) M fase og fosforylerer CI underenheter for å forbedre mitokondrieenergiproduksjon, potensielt å kompensere økte energibehovet til celler under celle syklus 11. Her sho viwcase eksperimentelle prosedyrer og strategier som kan brukes til å studere mitokondrietrans av ellers atom / cytoplasma kinaser, deres mitokondrielle underlag samt funksjonelle konsekvenser av deres mitokondrie lokalisering ved hjelp CyclinB1 / Cdk1 som et eksempel.

Den finne at CyclinB1 / Cdk1 kompleks translocates i mitokondriene ved behov førte til at studier av mitokondriene spesifikke overekspresjon og knockdown av dette komplekset. For å oppnå mitokondrier-spesifikk ekspresjon av proteiner, kan man legge til en mitokondrier målretting sekvens (MTS) i den N-terminale ende av proteinet av interesse. Mitokondrier rettet mot sekvenser tillate sortering av mitokondrie proteiner til mitokondriene hvor de normalt bor 12. Vi har brukt en 87 basis mitokondrier målretting sekvens dannet fra forstadiet av humant cytokrom c oksidase subenheten 8A (COX8) og klonet den inn i grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged CyclinB1 eller Red FluorescerendeProtein (RFP) -tagged Cdk1 inneholder plasmider i rammen. Denne metoden tillot oss å målrette CyclinB1 og Cdk1 inn i mitokondriene, spesielt endring av mitokondrie uttrykk for disse proteinene uten at det påvirker deres atom bassenget. Ved fluorescens merking disse proteinene, var vi i stand til å overvåke deres lokalisering i sanntid. Tilsvarende har vi innført MTS inn i et plasmid som inneholder RFP-merket dominant negativ Cdk1, som tillater oss å spesifikt slå ned mitokondrie uttrykk og funksjoner Cdk1. Det er viktig å skille mellom mitokondrielle og atom funksjoner av kinaser som har to lokaliseringer som Cdk1. Ingeniør MTS til N-terminalen i disse to funksjonelle kinaser har en god strategi som er lett å bli anvendt og effektiv.

Siden Cdk1 er en cellecyklus-kinase, er det grunnleggende for å bestemme den cellesyklusprogresjon når Cdk1 er lokalisert til mitokondriene. For å oppnå dette, har vi benyttet en ny metod å overvåke DNA-innhold i celler. Tradisjonelle metoder inkluderer bruk av BrdU (bromdeoksyuridin), en syntetisk analog tymidin, som inkorporerer inn i den nysyntetiserte DNA i S-fasen av cellesyklus for å erstatte tymidin. Da cellene som er aktivt replikerende deres DNA kan påvises ved anvendelse av anti-BrdU-antistoff. En ulempe ved denne metoden er at den krever denaturering av DNA for å gi adgang for BrdU-antistoff ved harde metoder som syre eller varmebehandling, noe som kan føre til inkonsistens mellom resultater 13,14. Alternativt, benyttet vi en lignende tilnærming til å overvåke aktivt delende celler med en annen tymidin analog, Edu. Edu deteksjon krever ikke harde DNA denaturering som mildt vaskemiddel behandling gjør at deteksjonsreagensen å få tilgang til Edu i nylig syntetisert DNA. EDU metoden har vist seg å være mer pålitelig, konsistent og med potensial for høy gjennomstrømming analyse 15.

Til slutt, to bestemme mitokondrie substrater av Cdk1, brukte vi en proteomikk verktøy kalt 2D-DIGE, som er en avansert versjon av klassiske to-dimensjonal elektroforese. Todimensjonal elektroforese separerer proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt i den første dimensjon og molekylvekt i den andre. Etter post-translasjonelle modifikasjoner så som fosforylering påvirke det isoelektriske punkt og molekylvekt av proteinene, kan 2D-geler detektere forskjellene mellom fosforylering statusene til proteiner i forskjellige prøver. Størrelsen (område og intensitet) av protein ble endringer med uttrykket nivå av proteiner, slik kvantitativ sammenligning mellom flere prøver. Ved hjelp av denne metoden, var vi i stand til å skille de fosforylerte proteiner i villtype versus mutante mitokondrier målrettet Cdk1 uttrykker celler. De spesifikke protein flekker som viste i villtypen, men manglet i mitokondriene målrettede mutant Cdk1 forberedelse ble isolert ogidentifisert via massespektrometri.

I tradisjonelle 2D geler, blir trifenylmetanfargestoffer brukt til å visualisere proteinene på gelen. 2D-DIGE bruker fluorescerende protein etiketter med minimal effekt på protein elektromobilitet. Forskjellige proteinprøver kan merkes med forskjellige fluorescerende fargestoffer, blandet sammen og adskilt ved de samme gelene, slik at ko-elektroforese av flere prøver på en enkelt gel 16. Dette minimaliserer gel-til-gel variasjoner, som er et kritisk problem i gel-baserte proteomics studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering av Mitokondrier fra dyrkede celler

  1. Utarbeidelse av isolasjonsbuffer for Cells (IBC) Buffer
    1. Fremstille 0,1 M Tris / MOPS (tris (hydroksymetyl) aminometan / 3- (N -morpholino) propansulfonsyre): Oppløs 12,1 g Tris i 800 ml destillert vann, justere pH til 7,4 ved hjelp av MOPS-pulver tilsettes destillert vann til et totalt volumet av en L og oppbevares ved 4 o C.
    2. Fremstille 0,1 M EGTA (etylenglykol bis (2-aminoetyleter) tetraeddiksyre) / Tris: Oppløs 38,1 g EGTA i 800 ml destillert vann, justere pH til 7,4 ved bruk av Tris-pulver tilsettes destillert vann til et totalt volum på 1 liter og oppbevar ved 4 o C.
    3. Forbered en M Sukrose: Oppløs 34,23 g sukrose i 100 ml destillert vann, gjøre 20 ml prøver, og oppbevar ved -20 o C.
    4. Forbered IB c buffer: Fremstill 100 ml IB c buffer ved tilsetning av 10 ml 0,1 M Tris / MOPS og 1 ml av 0,1 M EGTA / Tris til 20 ml; Av 1 M sukrose. Tilsett destillert vann til et totalvolum på 100 ml. Juster pH til 7,4.
  2. Utarbeidelse av Cell Lysis Buffer
    1. Klargjør lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (etylen-diamino-tetraeddiksyre), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β- glycerofosfat, 1 mM natriumortovanadat. Legg proteinaseinhibitorer 1 ug / ml leupeptin og 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) rett før bruk.
  3. Isolering av Mitokondrier
    1. Avling 3 x 10 7 celler med iskald 1 x PBS (fosfatbufret saltvann), pH 7,4 og sentrifuger cellene ved 600 xg i 10 min ved 4 o C. Kast supernatanten og re-suspendere pellet i 5 ml iskald IB c buffer.
    2. Homogen cellene ved hjelp av en glass / glass vevsmaler i ca 10 min. Overfør homogenatet til et 15 ml rør og sentrifuger ved 600 xg i 10 min ved 4 o C. For funksjonell mitokondrier, bruke glass / Teflon kobling som det er mindre skadelig for mitokondriene enn glass / glassfiberduk jeksel.
    3. Samle supernatanten til 1,5 ml rør og sentrifuger ved 7000 xg i 10 min ved 4 o C. Overfør supernatanten til et 1,5 ml rør og lagre det i cytosol-protein.
    4. Vask pelleten (mitokondriene) to ganger med 200 ul iskald IB c buffer og sentrifuger ved 7000 xg i 10 min ved 4 o C.
    5. Kast supernatanten og re-suspendere pelleten i cellelyseringsbuffer og bruke den umiddelbart eller lagres ved -80 ° C for fremtidig bruk. Hvis funksjonelle mitokondriene er nødvendig, re-suspendere pelleten i den gjenværende buffer etter kassering av supernatanten. Fortynning av mitokondrie fraksjonen videre kan resultere i tap av funksjon av mitokondrier. Oppbevar på is og bruke preparatet i 1-3 timer for best resultat.
    6. Sonikere resuspendert pellet i tretti tre-sec bursts i enisbad, sentrifuger ved 10 000 xg i 5 minutter, og supernatanten lagre som mitochondrial fraksjon.

2. Co-farging av Cdk1, CyclinB1 og COXIV, en mitokondrie Resident Protein

  1. Vokse 5 x 10 4 celler på dekkglass i 24-brønners plater O / N eller opp til 70% konfluens. Aspirere mediet og vaske cellene to ganger med 500 ul iskald 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Feste cellene med 500 ul iskald 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 10 min. Aspirer fikseringsløsning og vask av cellene med 500 pl 1 x PBS tre ganger, 5 minutter hver med forsiktig risting ved RT.
  3. Permeabilisere cellene med 0,2% Triton X-100 i 500 ul PBS i 5 min ved RT. Aspirer løsningen og vask cellene 3 ganger, 5 minutter hver med 500 ul PBS. Tilsett blokkeringsløsning (500 ul, 1% BSA (bovint serumalbumin) i PBS inneholdende 1% Tween 20) i 30 minutter ved RT.
  4. Fortynn de primære antistoffene 1: 250 (v: v) i 5001; l av blokkeringsløsning og inkuber i cellene med ønskede primære antistoffer dannet i forskjellige arter for å unngå kryss-signalering (CyclinB1 (mus) og COXIV (kanin) eller Cdk1 (mus) og COXIV (kanin) ved romtemperatur i 30 - 60 min eller O / N ved 4 o C.
  5. Vask objektglassene med 500 ul av 1 x PBS tre ganger, 5 min hver, og deretter inkubert med sekundært antistoff fortynnet 1: 1000 i 500 ul blokkeringsløsning ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av vasking med 500 ul PBS 3 ganger, 5 min hver.
  6. Monter Dekk med 20 ul anti-fade monteringsløsning og forsegle lysbilder med neglelakk. Bilde lysbilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med en gang eller holde i mørket ved 4 o C i 1 - 2 uker.

3. Sodium Carbonate Utvinning av Intakt Mitokondrier

  1. Grow ca 20 x 10 7 celler, høste, vaske en gang med PBS og isolere mitokondrier som beskrevet i kapittel 1. Del mitokondrie-isolater i to parts før den siste sentrifugering for å pelletere mitokondriene (før trinn 1.3.4); redninger halv til å bli brukt som den totale mitochondria (trinn 3.2), bruker den andre halvparten av natriumkarbonat ekstraksjon (etter trinn 3.3 til 3.6) for å skille løselige og membranbundne proteiner.
  2. Lyse den totale mitokondriene pellet med 30 pl av cellelyseringsbuffer og lagre løsningen ved -80 ° C inntil den ble brukt i immunblotting.
  3. Tilsett 250 ul 0,1 M Na 2 CO 3 (natriumkarbonat), pH 11,0, for den andre halvparten av mitokondriell pellet og inkuber på is i 30 min.
  4. Sentrifuger ved 100.000 xg i 20 min. Samle supernatanten og fortsett til trinn 3.5. Lyse pellet ved bruk av 30 pl av cellelyseringsbuffer og sonikere som i trinn 1.3.6. Oppbevar ved -80 ° C inntil brukes i immunblotting.
  5. Legge til et likt volum av 20% rykende trikloreddiksyre (TCA) til supernatanten for å utfelle proteinene og holder på is i 30 min.
  6. sentrifugeuge på 15 000 xg i 10 min. Kast supernatanten, oppløse pelleten i 80 mL av cellelyseringsbuffer og oppbevares ved -80 ° C inntil den ble brukt i immunblotting.

4. Separasjon av indre og ytre Membraner av Mitokondrier (Isolering av Mitoplasts)

  1. Grow ca 20 x 10 7 celler, høste, vaske en gang med PBS og isolere mitokondrier som beskrevet i punkt 1. skille mitokondrielle fraksjoner i 10 like store deler før den siste sentrifugering for å klumpe mitokondriene (før trinn 1.3.4).
  2. Løs opp hver pellet i 30 pl av den angitte konsentrasjon av hypoton sukrose-buffer (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (kaliumhydroksid), pH 7,2; sukrose konsentrasjon i området 25-200 mM) med eller uten 50 mg / ml trypsin ( se tabell 1) og inkuberes 30 minutter på is.
  3. Tilsett 3 pl 10 mM PMSF (for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1 mM PMSF) til trypsin inneholdende ampuller for å stoppe than trypsin fordøyelse og inkuber på is i 10 min.
  4. Sentrifuger ved 14000 x g ved 4 ° C i 10 min. Overfør supernatanten til et nytt rør, lyse pelleten i 30 mL av cellelyse buffer, sonicate som i trinn 1.3.6, og oppbevar ved -80 o C.

5. Bygging av Mitokondrier-målrettet GFP / RFP-merket CyclinB1 / Cdk1 Vektorer og bekreftelse av mitokondrie Lokalisering

  1. Klone mitokondriene målrettet mot sekvens (MTS, avledet fra forløperen til humant cytokrom c oksidase subenheten 8A (COX8) mellom nukleotidene 76 - 161) i rammen i den N-terminale ende av GFP eller RFP ved NheI og BamHI-setene av pEGFP-N1 eller pERFP -N1 vektorer ved hjelp av standard molekylære kloningsteknikker.
  2. Ved utforming PCR primere for CyclinB1 og Cdk1 gener, legge BamHI restriksjonsenzymgjenkjennelses (fet) til 5 'av PCR primere.
    Forward Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Omvendt Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Forward CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Omvendt CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Forsterker CDK1 og CyclinB1 gener ved anvendelse av disse primere følgende standardteknikker. Fordøye PCR-produkter med 1 pl BamHI restriksjonsenzym ved 37 ° C i 2 timer. Kjør fordøyelsen produkter på en 1% agarosegel. Ved hjelp av et barberblad, kuttet de riktige dimensjonerte DNA-fragmenter ut og rense DNA fra gelen ved hjelp av en gel utvinning kit.
  4. Fordøye 1 ug av MTS-pEGFP-N1 og MTS-pERFP-N1 plasmider med 1 pl BamHI-enzym ved 37 ° C i 2 timer. Tilsett 1 mL av Calf-Intestarm-alkalisk fosfatase (CIP) i 30 minutter ved 37 ° C. Kjør fordøyelsesprodukter på en 1% agarosegel og rense lineære plasmider fra gelen som beskrevet i trinn 5.3.
  5. Sett opp en ligation reaksjonen ved å tilsette en ul plasmid fra trinn 5,4 og 5 ul Cdk1 eller CyclinB1 fra trinn 5,3 til 3 mL av ligasebufferoppløsning, 0,5 mL av T4 ligase, og 20,5 mL av dH 2 O. Inkuber O / N ved 4 ° C.
  6. Transformere Escherichia coli DH5a-kompetente celler med 10 ul av ligeringsblandingen etter standardteknikker og dyrke bakteriene på 10 mg / ml kanamycin-inneholdende LB-agarplater O / N ved 37 ° C for å oppnå kolonier.
  7. Plukk ut en koloni fra O / N vokst plater ved hjelp av en steril pipette tips, setter spissen inn i en 5 ml kanamycin-LB-holdige rør og inkuber O / N. Isolere plasmid ved hjelp av miniprep-sett i henhold til produsentens protokoll og sekvensere plasmid ved bruk av standard teknikker.
  8. Transfektere eksponentielt voksende MCF10A-celler (1,5 x 10 4 celler sådd ut på 96-brønners plater) med MTS-Cdk1-RFP eller MTS-CyclinB1-GFP plasmider i trinn 5.7 ved å fremstille et plasmid / transfeksjon reagens-forhold på 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 pl) i 100 pl serum-og antibiotika-fritt medium.
  9. Inkuber cellene i plasmid / reagens blandingen i 48 timer ved 37 ° C i en CO2-inkubator med fuktighet kontroll (5% CO2, 95% relativ fuktighet).
  10. Fremstille 1 mM stamløsning av mitokondrielle rødt og grønt fluorescerende fargestoffer ved oppløsning av 50 ug av pulver i 100 ul DMSO. Fortynne stamløsninger 1: 400 i 1 x PBS for å oppnå 2,5 uM arbeidsløsninger. Forrådsløsningene kan oppbevares ved -20 ° C i ett år.
  11. Bland 2 ul av 2,5 uM av rødt fargestoff med 98 mL av kulturmedium for å fremstille en 50 nM sluttkonsentrasjon.
  12. Erstatte cellekulturmediet av CyclinB1-GFP bærende MCF10A-celler (som ble generert i trinn 5.8) med rødt fargestoff inneholdende medium i 2 min. Gjentasamme prosedyre med grønt fargestoff for Cdk1-RFP bærende MCF10A celler.
  13. Vask to ganger med 100 ul 1 x PBS for å bli kvitt overflødig fargeløsning, tilsett 100 mL 1x PBS til 96-brønns plate.
  14. Visual mitochondria og CyclinB1-GFP (eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 494 til 536 nm) og Cdk1-RFP (eksitasjon ved 560 nm og emisjon ved 565 til 620 nm) på 96-brønners plater med fluoriserende mikroskop ved 40X forstørrelse.

6. Identifisering av forskjellig fosforylerte proteiner via 2D-DIGE

  1. Prøvepreparering
    1. Isoler mitokondrier og lyse mitokondrielle fraksjoner som i trinn 1.3. Legge til et likt volum av 20% TCA (trikloreddiksyre i vann) til hver prøve og vortex i 15 sek. Inkuber prøvene på is i 30 min som proteinene felles ut av oppløsningen.
    2. Sentrifuger prøvene ved 9300 xg ved 4 ° C i 5 minutter, fjern supernatanten, og tilsett 60 ul kald aceton (100%) etterfulgt avsentrifugering ved 9300 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
    3. Gjenta aceton vasketrinnet (trinn 6.1.2) en gang til, fjerne supernatanten og re-suspen prøvene i 50 ul DIGE merking buffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Klargjør fluorescerende fargestoffer
    1. Fremstille stamoppløsning: Oppløs fargestoffer (5 nmol) i 5 ul av frisk dimetylformamid (DMF) til en sluttkonsentrasjon på 1 nmol / ul. Oppbevar lager fargeløsning ved -20 o C til bruk for et par måneder.
    2. Fremstille arbeidsløsning: Tillat fargestoffer for å sette ved romtemperatur i 5 minutter. Fortynn 1 mL av fargestoff med 4 ul av DMF til en endelig konsentrasjon på 200 pmol / ul. Hold på is under bruk. Merk: Arbeidsoppløsningen kan oppbevares ved -20 ° C i 3 uker.
  3. Merk Proteiner
    1. Bland 1 mL av arbeidsfargeløsning per 12,5 mikrogram protein. Skalere opp etter behov. For sammenslåtte standarder, tilsett 61; l Cy2 arbeidsløsning til 300 mikrogram sammenslåtte protein.
    2. Vortex i 30 sek og sentrifuger ved 4 ° C i 30 sekunder ved 12.000 x g. Inkuber på is i mørke i 30 min. Stopp merkingen ved å tilsette 1 pl 10 mM lysin per 1 mL av arbeidsløsning som brukes. Bland godt og inkuber på is i mørket i 10 min.
    3. Basseng individuelt merket prøver og bland med rehydratisering buffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, bromfenolblått). Totalt volum vil være 125 ul.
    4. Vortex prøver for 30 sekunder og tillate prøvene å sette ved romtemperatur i 30 minutter. Load 125 mL av prøvene bort på 7 cm pH 4-9, isoelektrisk fokusering (IEF) strimler.
  4. Først Dimension Elektroforese
    1. Plasser stripe holdere (kister) på elektroden plate, noe som gjør at strippe holdere er helt ren og tørr. Pipetter 125 ul prøver i en kiste, spre jevnt over hele kisten.
    2. Bruke tweezers, plukke opp IEF stripen, forsiktig fjerne plastbeskyttelsesdekselet, og sett den (gel siden ned) i kisten / rehydrering buffer. Unngå fangst luftbobler. Sakte fylle kiste (1 - 1,5 ml) med mineralolje og plassere kisten dekker på kistene.
    3. Begynne isoelektrisk fokusering følge protokollen i tabell 2:
      Merk: Når løpet er ferdig, kan de strimler lagres i plastrør ved -80 ° C eller direkte flyttet til likevekt og den andre dimensjonen.
  5. Second Dimension - Sodium Dodecyl Sulfate-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)
    1. likevekt
      1. Tine SDS -ekvilibreringsbuffer (8 ml per stripe, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS). Vei opp ditiotreitol (DTT, 10 mg DTT per 1 ml SDS ekvilibreringsbuffer). Løs opp DTT inn i 4 ml SDS -ekvilibreringsbuffer.
      2. Vei opp IAA (iodoacetamide, 25 mg IAA per 1 ml SDS ekvilibreringsbuffer).Løs opp IAA i 4 ml SDS -ekvilibreringsbuffer.
      3. Smelt 1 ml tetningsmidler agarose oppløsning i et vannbad for senere bruk.
      4. Dersom stripene var frosset, tillate dem å tine helt. Legg strimler gel siden opp i reswelling skuffen. Tilsett 4 ml SDS ekvilibreringsbuffer med DTT for hver strimmel og inkuber i 15 minutter med forsiktig risting.
      5. Hell av alt SDS ekvilibreringsbufferen med DTT. Tilsett 4 ml SDS ekvilibreringsbuffer med IAA for hver strimmel og inkuber i 15 min med forsiktig risting. Etter likevekt med IAA buffer, hell av sikkerhetsdatabladet ekvilibreringsbufferen.
    2. SDS-PAGE
      1. Pakk mini gels, fjern kammen og skyll gel og brønnene med DDH 2 O. Fjern det hvite bånd i bunnen av gelen før drift. Orientere stripe på gel riktig, er gel orientering kritisk for spot skjæring.
      2. Plasser gel flatt på telleren med den lille platen opp og gel toppen vendt experimenter. Legge bånd på høye plate med anode enden (++ ende med strekkode) vendt mot venstre side av gel. Ved hjelp av en linjal, sakte skyve stripe ned på gel overflaten. Unngå å fange luftbobler mellom stripen og gel. Stå gelen opp i en glassplate stand.
      3. Tilsett 1 ml varm forsegling agarose løsning til åpningen av kassetten. Sørg for at alle luftbobler presses ut ved hjelp av en flat linjal. Monter apparaturen og kjøres gelen ved en konstant 125 V i 90 min.
      4. Når gelen er ferdig kjører, plassere gel på en biomolekylære kamera med 2 ml DDH 2 O og skanne gel i fluorescens oppkjøpet modus med 635 nm eksitasjon laser og 665 nm utslipp filter.
    3. Fosfoproteinet Farging
      1. Løs gel med 50% metanol og 10% eddiksyre-blanding (10 ml) i 30 min to ganger. Vask med 10 ml vann i 10 minutter tre ganger, og flekken med 10 ml fosfoprotein flekk for 60-90 minutter, fulgt avavfarging med 10 ml destain løsning for 30 min tre ganger.
      2. Vask med 10 ml vann 5 min to ganger og bilde gelen med en laser gel skanner ved 532 nm / 560 nm Eksitasjon / utslipp.
    4. Protein Fordøyelse og Identification
      1. Vesenet alle forskjellig uttrykt protein flekker fra gelen inn i mikroplate brønnene ved hjelp av en robot spot-picker i henhold til produsentens spesifikasjoner, og tilsett 100 mM ammonium bikarbonat (2 ml) i 1 time ved RT destain gel stykker. Dehydrere med 2 ml 100% acetonitril vask to ganger og tørk i en vakuum-konsentrator i 30 minutter.
      2. Rehydrere gel stykker med 100 pl av 13 ng / ul modifisert svine-trypsin i 50 mM ammoniumbikarbonat i 16 timer ved 37 ° C. Samle supernatantene og ytterligere ekstrahere proteinene med 100 ul av 5% trifluoreddiksyre i 50% acetonitril i 30 min.
      3. Konsentrer peptidene ned til 5 mL av vakuumsentrifuge concentOperatøren og analysere med Matrix pasning Laser desorpsjon ionisering - Time of Flight - tandem massespektrometri analyse (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. I Vitro kinase analyse

  1. Forberedelse av underlag
    1. Sub-klon kompleks I (CI) underenheter (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, og NDUFA12), som er identifisert som differensielt fosforylerte CDK1 mål, inn i pGEX-5X-en vektor for å produsere glutation-S-transferase (GST) -tagged bakteriell uttrykk plasmider 11. Rens CI-underenheter ved hjelp av høyaffinitet glutation kolonner etter den under protokollen.
      1. Kultur-GST merket CI subenhet inneholdende Escherichia coli-stamme BL-21 i Luria-Bertani (LB) medium med 50 ug / ml ampicillin i et risteapparat ved 37 ° C inntil en optisk tetthet (OD) på 0,6 ble nådd. Legg isopropyl-BD-tio-galaktopyranosid (IPTG) til dyrkingenure ved en sluttkonsentrasjon på 0,1 mM og inkuberes i ytterligere 3 timer.
      2. Sentrifuger ved 600 xg i 10 minutter for å samle bakterier og re-suspen i 5 ml 1 x PBS-buffer inneholdende 5 mM DTT, 1 x proteinase-inhibitor cocktail, og 0,1% lysozym. Lyse cellene ved sonikering i tyve 5 er skurer, og fjerne celleavfall ved sentrifugering ved 600 xg i 10 min.
      3. Samle supernatanten og inkuber med glutation-agarose 4B kuler ved en volumforhold på 4: 1 (supernatant: perle) i 1 time ved RT.
      4. Eluere GST-fusjonsproteinene fra kulene sammen med 3 ml glutation elueringsbuffer (10 mM redusert glutation i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) og underkaste de eluerte proteinene til dialyse i molekyl porøs membranslangen (molekylvekt cut-off 12 -14 kilodalton) med 1 x PBS / 1 mM EDTA. Oppbevar rensede proteiner ved - 80 o C.
  2. Cdk1 Kinase Assay
    1. Før du starter kinase assay, satt varmeblokker til 30 ° C og 100 ° C. Tine kommersielle CyclinB1 / Cdk1 enzymkompleks og underlag på is.
    2. Forbered reaksjonsblandingen på is. Siden 32 P ATP isotop er involvert, forberede alle reaksjonsblandinger i 1,5 ml prøverør med skrulokk som inneholder en O ring for å hindre spredning av radioaktivitet.
      Forsiktig: Følg radioaktive materialet beskyttelsesregler. Bruk en 8 mm tykk plexiglass skjerming og arbeid i det minste på en armlengdes avstand. Tørk av eventuelle forurensede området med vann.
    3. Fremstille en 30 pl reaksjonsbuffer inneholdende 1 x Cdk1 buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM kald ATP, 0,1 uCi 32P ATP, 2 enheter av CyclinB1 / Cdk1 og 6 ug av substrat-protein. Juster volumet til 30 pl med DDH 2 O. For positiv kontroll reaksjon, erstatte underlaget med 0,01 mM Histone H1, en velkjent CyclinB1 / Cdk1 underlaget.
      1. For negative control reaksjonene (1) erstatte substratet med GST-proteinet bare og (2) å erstatte substratet med 0,01 mM Histone H1 + 0,5 pM RO-3306, en selektiv inhibitor Cdk1.
    4. Bland godt med pipette og sentrifuge for å bringe all væsken til bunnen av røret, noe som minsker risikoen for forurensning. Inkuber ved 30 ° C i 60 min.
    5. Tilsett 6 ul 5x SDS prøvebuffer for å stoppe reaksjonen og denaturering ved 100 ° C i 10 min. Kjøres prøvene på 10% SDS-PAGE-gel ved 160 V i 2 timer, eller inntil fargestoff fronten har nådd enden av gelen. Overfør gel på en kromatografi papir og sjal med plastfolie.
      Forsiktig: All væske i kontakt med radioisotoper bør behandles som radioaktivt avfall og avhendes på en 5-gallon poly carboy levert av miljø helse og sikkerhet tjenester som per institusjonelle retningslinjer.
    6. Utsette gelen for røntgenfilm for en dag eller opp til en uke ved -20 ° C, avhengig av den spesifikke aktiviteten til radioisotopen benyttesog enzymet.

8. seterettet mutagenese for å generere dominant negativ Cdk1 (D146N)

  1. Design mutagenese primere; to primere, komplementære til hverandre, som inneholder den mutante området (G vil bli erstattet av en nukleotid til å kode for N i stedet for D-aminosyre) flankert av 20 baser på hver side 11.
  2. Forbered en 50 pl Polymerase Chain Reaction (PCR) blanding som inneholder 1x reaksjon buffer, 2,5 mM dNTP, 10 mm primere (både forover og bakover), 40 ng av malen, og DDH 2 O. Legg 2,5 U DNA-polymerase i reaksjons.
  3. Kjør følgende PCR-program: 95 ° C 3 minutter, 95 ° C 30 sek, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 sykluser (Merk: 68 ° C inkubasjonstiden er bestemt av størrelsen av DNA 1 min / kb er nødvendig for DNA ≤ 10 kb For større DNA, 2 min / kb pluss 10 sekunder per syklus..). Følg med 68 ° C 7 min og holde ved 4 ° C til den er klar til bruk.
  4. Legg til2 ul av DPn-restriksjonsenzym (10 U / pl) og 5,7 pl DPN I buffer, bland godt med forsiktig kran med fingeren og inkuberes reaksjonen ved 37 ° C i 1 time.
  5. Overføre 10 ul DPN I-behandlede PCR-produktene inn i 50 ul av DH5a kompetente celler for transformasjonen. Inkuber på is i 30 min, etterfulgt av 45 sek varmesjokk ved 42 ° C og 5 minutter på is. Legg 500 mL av LB og riste ved 37 ° C i 1 time før utplating på LB-agarskåler. Inkuber O / N ved 37 o C.
  6. Plukk en koloni fra O / N vokst agar plater ved hjelp av en steril gul pipette, slippe spissen inn i et rør som inneholder 5 ml LB, og vokse O / N i en 37 o C shaker. Isolere plasmid ved anvendelse av en miniprep-kit og sekvensere plasmidet for å bekrefte mutasjonen i henhold til produsentens protokoll.

9. Fastsettelse av Cell Cycle fase Lengder med Edu innlemmelse analysen

  1. Cell Sorting
    1. transfect 2 x 10 5 celler med den angitte vektorer (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP eller MTS-Cdk1-dn-RFP) i en 6-brønns plate ved anvendelse av 1: 2 (w: v , 2,5 ug: 5 ul) forholdet mellom DNA: Transfeksjon Reagens blanding fremstilt i 2,5 ml serum-fri og antibiotika kulturmedium i 48 timer. Levende sortere celler som stabilt uttrykker GFP-merket Cdk1 og RFP-merkede CyclinB1 proteiner via strømningscytometer.
      1. Vask cellene med 1 x PBS, tilsett 100 mL av trypsin i formen og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Tilsett 2 ml kulturmedium for å samle cellene, og sende dem gjennom et 70 um filter for å generere en enkeltcelle-suspensjon. Vask enkelt celle suspensjon med 500 mL av 1% føtalt kalveserum i PBS (FCS / PBS) før du setter dem på strømningscytometer.
      2. Sett opp sorteringsparametre følgende etablerte protokoller 18 gating for doble positive celler farget med både GFP og RFP. Samle de sorterte celler som kommer ut av cytometeret inn i en tube containing cellekulturmedium og bruke disse cellene for analyse av cellesyklusprogresjon med Edu puls-chase merking som i protokollen 9.2.
  2. Måling av cellesykluslengden Bruke Edu Merking flowcytometrisystemer analysen
    1. Seed sortert celler i 6-brønns plater ved en tetthet på 2,5 x 10 5 celler per brønn og kulturen O / N ved 37 ° C i en CO2 inkubator. Legg EDU til kulturmediet til en sluttkonsentrasjon på 25 uM. Inkuber ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 1 time.
    2. Vask cellene med 1% BSA i 500 ul PBS og samle dem i et 1,5 ml rør ved 2 timers intervaller for en total på 10 - 12 timer.
    3. Sentrifuger cellene ved 350 xg i 5 min, kast supernatanten. Løsne pellet ved å tilsette 100 mL av fikseringsløsning (levert av produsenten i EDU merking kit) i 15 min ved RT og bland godt.
    4. Vask cellene med 1 ml av 1% BSA i PBS tre ganger. Festceller på nytt med 0,5 ml 70% etanol O / N ved 4 o C.
      Merk: Etanol feste er kritisk for å bråkjøle den interne GFP / RFP fluorescens på grunn av det rekombinante-taggede proteinekspresjon.
    5. Sentrifuger cellene på nytt ved 350 xg i 5 minutter og vaskes pelleten med 1 ml av 1% BSA i PBS en gang. Re-suspendere cellene i 1 ml permeabiliseringsbuffer (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNase A i PBS) i 20 minutter ved RT.
    6. Vask cellene med 1 ml av 1% BSA i PBS en gang. Tilsett 0,5 ml reaksjons cocktail inn i hvert rør og bland godt. Inkuber reaksjonsblandingen ved RT i 30 min i mørket.
    7. Vask med 1 ml av 1% BSA i PBS en gang og flekk-DNA med 50 ug / ml propidiumjodid (PI) i 1 ml av 1% BSA i PBS.
    8. Analyser cellene ved flowcytometri å følge EDU-positive befolkningen. Present scatter prikkplott av Edu-merkede celler farget for DNA-innhold (PI flekker, X-aksen) og Edu (Alexa 647 flekker, Y-akse).
      1. Bruk APC kanal for Alexa647-edu benytte en 670/30 band pass filter med alt lys tilstede mindre enn 685 nm treffer som filter; og fysoerytrin (PE) kanal for PI med en 581/15 band pass filter foran den med all lys til stede mindre enn 600 nm treffer som filter.
      2. Sett de første tube inneholder celler i flowcytometri og bruke en standard gating strategi for oppkjøpet: Plot FSC-området X SSC-området for morfologi fulgt av PI (PE kanal) X Alexa647-Edu (APC kanal) for cellefarging. Rekord data for alle rør én etter én anskaffe 10.000 hendelser per prøve.
      3. Bestemme cellesyklus fase fordeling av cellene og fase lengder ved hjelp av en strømnings-cytometri dataanalyse-programvare følgende etablerte protokoller 11,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sub-mitokondrie lokalisering av CyclinB1 og Cdk1

Natriumkarbonat ekstraksjon blir brukt til å bestemme hvorvidt et protein er plassert inne i mitokondriene eller på den ytre overflate, nemlig ytre membran. Når et protein er vist å lokalisere inne i mitokondriene, kan ytterligere bestemmelse av sub-mitokondriell lokalisering gjøres via mitoplasting kombinert med proteasenedbrytning. For å angi under mitokondrielle lokalisering av CyclinB1 eller Cdk1, ble mitoplasts isolert ved fortynning av mitokondrier i hypotone buffere med avtagende konsentrasjoner av det osmotiske sukrose fra 200 mM til 25 mM. Den ytre membran begynner å sprekke ved 150 mM sukrose, mens den indre membran forblir intakt inntil den endelige konsentrasjonen på 25 mM sukrose (figur 1A). I kombinasjon med mitoplasting kan protease beskyttelsestest utføres ved hjelp av Trypsi å fordøye utsatte proteiner følgende ytre membran ruptur. Dette vil resultere i fordøyelsen av intermembrane plass proteiner. Hvis proteinet av interesse er beskyttet fra trypsin fordøyelse, indikerer dette mitokondrielle matriks lokaliseringen av proteinet. I denne representative tall, ble mitokondrie matrix protein hsp60 og intermembrane plass protein Timm13 brukt som sub-mitokondrie lokalisering markører. I likhet med hsp60 men i motsetning Timm13, CyclinB1 og Cdk1 ble beskyttet mot trypsin fordøyelsen, indikerer deres mitokondrie matrise lokalisering (figur 1B).

Mitokondrie Uttrykk for MTS- og GFP-merket CyclinB1 og Cdk1 Proteiner

MTS er klonet i ramme i den N-terminale ende av CyclinB1 eller CDK1 gener, som har GFP eller RFP koder ved sin C-terminale ende. Den resulterende rekombinante protein er mitokondriene målrettet GFP- eller RFP-merkede CyclinB1 eller Cdk1. Listen over de konstruksjonene som genereres og brukes i denne studien er vist i figuren. Ved hjelp av disse konstruksjoner overekspresjon av CyclinB1 og / eller Cdk1 i mitokondriene ble oppnådd, her vist ved Western blotting av de isolerte mitokondrielle fraksjoner (figur 2).

Potensielle MITOKONDRIELLE Mål av CyclinB1 / Cdk1 Avgjøres etter 2D-DIGE

Cdk1 tilhører serin / treonin (S / T) kinasefamilien å katalysere overføringen av en fosfat fra ATP til prolin (P) -orientert S eller T-rester. Et punkt mutasjon som erstatter en aspartat (D) rest med asparagin (N) i posisjon 146 av Cdk1 (D146N) genererer en dominant negativ (dn) Cdk1 mutant 19. For å studere funksjonen av mitokondriell Cdk1 ble en mitokondrier målrettet Cdk1-dn protein generert ved å konstruere et plasmid (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn) som inneholder en 29 aminosyre-long mitokondriell målretting sekvens (MTS) avledet fra subenheten VIII i det humane cytokrom C oksidase bundet til RFP-taggede dn-Cdk1. pERFP-N1-MTS produserende mitokondrier-målrettede ERFP protein ble anvendt som en tom vektorkontroll. Mitokondrie fosfoproteiner i G2 / M-celler transfektert med begge konstruksjonene ble profilert av 2D-gel analyse med pH 4-10 gel strimler. Sammenlignet med tomme vektor transfektanter (figur 3, øvre panel), en gruppe av mitokondrie fosfoproteiner var tilsynelatende fraværende eller redusert i Cdk1-dn transfektanter (figur 3, nedre panel). Massespektrometrianalyse av flekkene detekteres bestemmes identiteten av proteiner fosforylert av Cdk1 i mitokondriene.

Cellecyklusprogresjonen og finne fase Lengder med Edu Pulse-chase analyse

For å undersøke utviklingen av cellesyklusen when mitokondrie CyclinB1 / Cdk1 verdiene øker, en puls-chase merking eksperiment ved hjelp av en tymidinanalogen, etynyl deoxyuridine (Edu) ble utført for å merke populasjon av celler som gjennomgår DNA-syntese 20. Denne metoden gjør at visualisering av cellesyklusen tatt over en 22 timers vindu ved å spore EDU-positive befolkningen når celler utvikle seg gjennom S og G2 / M faser og akkumuleres i G1 fasen. Resultatene viser at merket S-faseceller kommet gjennom G2 / M fase og dukket opp i G1 fase så fort som 4 timer i celler som uttrykker villtype mitokondriell CyclinB1 / Cdk1, sammenlignet med 6 timer i celler transfektert med en vektor kontroll eller mutant CyclinB1 / Cdk1 (figur 4A), noe som indikerer at forbedring av mitokondriell CyclinB1 / Cdk1 akselererer cellesyklusprogresjon.

Figur 1
Figur 1. mitokondrie CyclinB1 / Cdk1 lokaliserer i Matrix. (AB) Under mitokondrielle lokalisering av CyclinB1 og Cdk1 oppdaget av mitoplasting og protease beskyttelsestest, figur har blitt forandret fra Wang et al., 2014 11. Den total (T), pellet (P), og supernatanten (S) fraksjoner ble underkastet Western blot-analyse med angitte antistoffer. TIMM13 (en inter-plass protein), og hsp60 (en matrise protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur to
Figur 2. Uttrykk av mitokondrie Cdk1 konstruksjoner. Western blotting av mitokondrielle fraksjoner isolert fra celler transfektert med mitokondrier målrettet CyclinB1 og / eller villtype eller dominant negativ mutant Cdk1 (plasmider er angitt på bunnen 11. pEGFP-N1-MTS og pERFP-N1-MTS vektorer var tomme vektor kontroller for henholdsvis MTS-CyclinB1 og MTS-Cdk1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Potensielle MITOKONDRIELLE Underlag av Cdk1. MITOKONDRIELLE proteiner utvunnet fra G2 / M-toppet celler transfektert med mitokondrier målrettet tom vektor (pERFP-N1-MTS, øvre panel) eller mutant Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, lavere panel) ble merket med Cy5 (grønn), adskilt av 2-D-gel og fosforylerte proteiner ble farget med fosfoprotein fargestoff (rødt). Dette tallet har blitt forandret fra Wang et al. 2014 11."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Mitokondrie Cdk1 Forbedrer G2 / M Overgang og Overall Cycle Progresjon.
Cellesyklus analyse med Edu puls-chase merking. Spredningsplott histogrammer av Edu-merkede celler ble trukket for DNA-innhold (X-aksen) og Edu (Y-aksen). De lavere tall i hvert panel viser gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av Edu merket kjerner. Tidspunktene ble angitt i timer etter at Edu puls 11. For alle tidspunkter, ble portene viser følgende grupper trekkes: G0 / G1, S og G2 / M. For 6, 8 og 10-timers tidspunkter, utdannings- og merket G1 *, S / G2 *, og G2 / M * populasjoner vises. Dette tallet har blitt forandret fra Wang et al., 2014 11. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.

Sukrose Konsentrasjoner Brukte
Ingen trypsin 25 mm 50 mm 100 mm 150 mm 200 mm
+ trypsin 25 mm 50 mm 100 mm 150 mm 200 mm

Tabell 1. hypoton Sukrose Buffere brukt for trinn 4.2

Trinn 1 30 V 12 timer Trinn og hold
trinn 2 300 V 0,5 timer Trinn og hold
trinn 3 1000 V 0,5 timer gradient
5000 V 1,33 hr gradient
Trinn 5 5000 V 20 000 V hr Trinn og hold

Tabell 2. Isoelektrisk protokoll som brukes for Trinn 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I likhet med proteiner bestemt for andre subcellulære organeller, mitokondrie målrettet proteiner besitter målrettingsignaler innenfor deres primære eller sekundære struktur som henvise dem til organeller med hjelp av forseggjorte protein translocating og folding maskiner 21,22. Mitokondrier målretting sekvenser (MTS) hentet fra utelukkende mitokondrielle bosatt proteiner som COX8 kan legges til N-terminalen av noen gensekvensen å målrette spesifikke proteiner inn i mitokondriene 11,23,24. Her ble CyclinB1 og Cdk1 gener klonet inn COX8 MTS inneholder vektorer og ved uttrykk, ble det rekombinante CyclinB1 og Cdk1 lokalisert i mitokondriene. Fordelen med denne tilnærmingen er at den muliggjør endring av genekspresjon i en bestemt sub-cellulær kammer, i dette tilfellet mitokondriene, uten å endre den generelle genekspresjon. Med denne strategien, mitokondrier-spesifikke funksjoner av en kjernefysisk kinase, ble Cdk1 DEbestemt. På samme måte ved å legge MTS til en dominant negativ Cdk1, slå ned i mitokondriene spesifikke funksjonene Cdk1 ble oppnådd, som tillot identifisering av mitokondrier spesifikke mål av Cdk1, og aktivert analyse av funksjonelle konsekvenser av mitokondrie fravær av Cdk1 funksjon. Overekspresjon av Cdk1 uten MTS tag resulterer i forbedret uttrykk for Cdk1 både mitokondrier og kjernen, og dermed kompliserer ytterligere undersøkelser av konsekvensene av mitokondrier spesifikke handlinger Cdk1.

Imidlertid kan denne tilnærmingen ikke være egnet for alle genprodukter som vi har opplevd noen mislykkede forsøk på å flytte noen kinaser i mitokondriene via tillegg av MTS tag. Noen cellelinjer kan være ganske motstandsdyktig mot transfeksjon, og å finne den optimale protokoll kan være tidkrevende. Selv når cellene er friske og transfeksjon er vellykket, arbeider med fluorescerende tagget proteiner viser noen problemer such som aggregering, feil lokalisering, ikke-funksjonelle fusjoner og svake signaler.

Store begrensninger av isolering av mitokondrier og mitoplasts omfatter lavt utbytte og mulig forurensning fra andre cellulære eller sub-mitokondrielle kammere. Det er foreslått at adherente celler ikke brytes effektivt ved hjelp av konvensjonelle kjemiske eller mekaniske metoder, og derfor gjør det vanskelig å oppnå høye mengder av mitokondrier fra dyrkede adherente celler. Her benyttet vi heft kulturer av MCF10A celler. Til å gi omtrent 30 - 50 ug mitokondrie protein, en start mengde på 3 - 5 x 10 7 celler ble anvendt. Homogeniser trinnet er et annet kritisk punkt for den endelige utbyttet av mitokondrielle preparater. Avhengig av cellelinjer som brukes, kan antallet av slag og / eller tid for homogenisering variere. For MCF10A celler, observerte vi at 10 minutter av homogenisering av glass / glass homogenisator er nødvendig, mens mus embryonale fibroblam (MEF) kreves bare 3-5 min av homogenisering. Ettersom overdreven homogeniseringen kan føre til skade på mitokondriemembranen og utløse frigjøring av mitokondrielle komponenter, bør standardbetingelser for hver cellelinje bli bestemt ved erfaring. Bruken av en glass-glass homogenisator øker utbyttet av mitokondrielle preparater sammenlignet med glass / Teflon homogenisatorer. Utgangs Mengden av celler, så vel som fryse / tining av celler kan endre antall slag som er nødvendig for å bryte opp cellene. Endelig kan protein denaturering og aggregering oppstå på grunn av lokalisert oppvarming av prøven i løpet av homogeniseringen. Det er derfor essensielt å pre-kjøle den vevsmaler og holde prøvene på is i løpet av denne prosedyren.

En annen fremgangsmåte presenteres i denne artikkelen, er bruken av EDU merking for å overvåke cellesyklus i sanntid. Edu er en modifisert tymidinanalogen som fluorescensmerkede med en lys, fotostabile Alexa Fluor fargestoff. Edu er effkelig inkorporert i nylig syntetisert DNA. Denne metoden er et bedre alternativ til bruk av tradisjonelle merking av prolifererende celler med en nukleosidanalog, bromdeoksyuridin (BrdU). BrdU inkorporeres i DNA under aktiv DNA-syntese. Kvantifisering av BrdU-merket DNA krever DNA denaturering av relativt harde metoder som høy varme eller høy surhet å avsløre BrdU molekyler for BrdU antistoffbinding. Den harde behandling for DNA-denaturering kan påvirke prøven kvalitet, og er tidkrevende. Med Edu, er vanligvis tilstrekkelig for EDU deteksjonsreagensen å få tilgang til DNA vaskemiddel permeabilization. Uten behovet for å bruke sterke kjemikalier eller varme for DNA-tilgang, er den EDU metoden enklere å bruke, mer nøyaktig og konsekvent. Bortsett fra fordelene Edu gir, har det vært noen bekymringer angående bruk av Edu å studere spredning. Edu viste en svak anti-proliferativ aktivitet på behandlinger over 72 timer, noe som kan reduseres til negligible nivåer når Edu puls ble holdt på en time 25.

En modifikasjon ansatt med Edu merking er feste tid og metode. Settet foreslo en 15 min fiksering med den medfølgende festeløsningen. Imidlertid ble en ytterligere fiksering med 70% etanol anvendt i dette eksperimentet. Det er to grunner for bruk av etanol: 1) for å følge cellesyklusutvikling over tid, en tid-punkts forsøk ble utført, hvor cellene ble samlet hver 2 timer. Cellene ble oppbevart i 70% etanol ved 4 ° C inntil alt av de eksperimentelle tidspunkter har blitt fullført. Egentlig kan cellene holdes i 70% etanol for lengre (flere uker til måneder) om nødvendig. 2) Cellene anvendt for forsøket var stabilt transfektert med GFP-merket Cdk1 og / eller RFP-merket CyclinB1. For å skille Edu og PI signaler fra GFP / RFP fluorescens, ble etanol fiksering brukt til å denaturere GFP og RFP proteiner, og dermed slukke fluorescens før du utfører Edu end PI farging. Denaturerte GFP / RFP-proteiner er i det vesentlige helt ikke-fluorescerende, antagelig fordi kromoforen ikke lenger beskyttet mot å slukke 26,27.

For å identifisere målet for mitokondrie Cdk1, ble 2D-DIGE metoden, som er overlegen i forhold til tradisjonelle 2D-geler på mange måter anvendes. I 2D-DIGE, forskjellige fluorescerende fargestoffer, for eksempel Cy 3, 5 og 2, brukes til merking av prøver, noe som gjør det mulig å kjøre opp til 3 prøver i en gel, noe som reduserer variabiliteten uten å måtte gå veien replikater som i standard 2D gel. De fluorescerende fargestoffer som brukes i 2D-DIGE har en meget høy følsomhet på 0,2 ng / sted, sammenlignet med den i trifenylmetanfargestoffer ved 100 ng / sted, således, som krever mindre mengde av proteiner kjørt på 2D-dige geler med høy flekk oppløsning og publiserings kvalitet gel skanninger. En automatisert programvare brukes til å påvise, kvantifisere og definere ulikt uttrykte proteiner. På grunn av høye spot oppløsning, differensial protein uttrykk i prøver can sammenlignes nøyaktig ved hjelp av programvaren assistert sted kvantifisering; en forskjell så lav som 10% kan påvises via 2D-DIGE, muliggjør visualisering av post-translasjonelle modifikasjoner lett. Bruken av programvare-hjulpet in-gel analyse gjør det også raskere innhenting av data. Imidlertid, ettersom utstyr, slik som fluorescerende skannere, er nødvendig for bildeopptak, anvendelsen av denne fremgangsmåte innebærer ekstra kostnader. Andre begrensninger av 2D-DIGE inkluderer dårlig representasjon av hydrofobe proteiner samt proteiner med ekstreme isoelektriske punkter og store molekylvekt 28,29. Videre validering av resultatene oppnådd med 2D-DIGE ved bruk av alternative teknikker, slik som immunocytochemistry eller western blot er nødvendig for å bekrefte nye funn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics