Metabolisk karakterisering af polariseret M1 og M2 knoglemarv-afledte Makrofager Brug Real-time Ekstracellulær Flux Analyse

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (105), e53424, doi:10.3791/53424 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mens makrofager spiller en central rolle i næsten alle sygdomme, de molekylære mekanismer, der regulerer deres fænotype er stadig ikke fuldt optrævlede. Makrofager vise high heterogenitet og som svar på mikromiljø vedtage forskellige fænotyper 1. LPS (+ IFNy) -induceret klassisk aktiveret M1 eller M (LPS) makrofager fremme inflammation og beskytte værten mod forskellige typer af mikrobielle 2 trusler. Andre alene eller i kombination bruge IFNy med TNF som stimuli til fremkaldelse M1 polarisering. IL-4 og / eller IL-13 inducerer alternative makrofagaktivering og disse M2 eller M (IL-4) celler er potente suppressorer og controllere af igangværende immune 3 svar. Polariserede makrofager vise en særskilt regulering af cellulær metabolisme med LPS-aktiverede M1 makrofager gennemgår en metabolisk skifte til forbedret glykolysen 4-6. Omvendt forbedret fedtsyreoxidation (FAO) og mitokondriel oxidative fosforylering (OXPHOS) giver vedvarende energi i IL-4-induceret M2 makrofager 7-9. Således ændret metabolisme er ikke kun en egenskab ved polariserede makrofag delmængder, er det også en forudsætning for korrekt polarisering og inflammatorisk regulering. Vigtigt er det, at hæmning af glykolyse eller OXPHOS / FAO har vist sig at svække M1 eller M2 aktivering henholdsvis 8,10. Som sådan kunne identificerer metaboliske ændringer i makrofager anvendes som et redskab til at vurdere deres polarisering status og inflammatoriske potentiale.

En konsekvent assay, der måler makrofag metabolisme kunne derfor anvendes til at forudsige, om et lægemiddel, gen vælte eller anden behandling påvirker makrofag polarisering og funktion. I denne video, er et ekstracellulært flux analysator bruges til at karakterisere bioenergetik profiler af naive, M1 og M2 makrofager.

Dette håndskrift detaljer en optimeret protokol, der tillader målingenaf alle relevante glycolyse parametre (glycolyse, maksimal glycolyse og glykolytisk reserve) og mitokondriefunktion karakteristika (total åndedræt, basal mitokondrie åndedræt ATP produktions-, proton lækage, maksimal åndedræt og reservedele respiratorisk kapacitet) i én enkelt analyse. Ved hjælp af denne forsøgsopstilling, kan bioenergetik sammenlignes mellem kontrol og "ændret" (f.eks gen vælte, transgene overekspression eller farmakologisk behandling) celler.

Protocol

1. Dyrkning og Polarizing knoglemarv-afledte makrofager

  1. Dag 0: Isoler lårben og skinneben knogler fra 6-10 uger gamle mus af interesse (C57BL / 6 i denne analyse).
  2. Fjern muskelvæv fra knoglerne og placere knoglerne i en 9 cm petriskål fyldt med iskoldt PBS.
  3. Overfør knoglerne til en 9 cm petriskål fyldt med 70% ethanol og ryst forsigtigt pladen i 30 sek.
  4. Overfør knoglerne til et frisk 9 cm petriskål fyldt med iskoldt sterilt PBS.
  5. Skær lårben og skinneben i begge ender med steril saks.
  6. Skyl knoglerne med 10 ml iskold sterilt PBS under anvendelse af en 10 ml sprøjte og en 25 G nål. Saml knoglemarven i et 50 ml rør.
  7. Overfør knoglemarvsceller til et nyt 50 ml glas med en 23 G nål.
  8. Gentag dette trin med en 25 G nål. Bemærk: Disse trin er nødvendige for at fjerne celleklumper og knogle-rester.
  9. Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  10. Kassér supernatant og resuspender cellerne i 40 ml cellekulturmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamin, 10% FCS, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml) og 15% filtreret L-929 celler ( ATCC, CCL-1) -konditioneret medium indeholdende M-CSF (eller alternativt 10 ng / ml rekombinant M-CSF i stedet for L-929-celle-konditioneret medium).
    Bemærk: Produktion af L-929-celle-medium blev beskrevet tidligere i dette tidsskrift i 2013. 11
  11. Dyrkning af cellerne fra en mus i to 15 cm petriskåle (ikke bruger cell culture-behandlede plader idet makrofag ikke vil løsne sig fra denne plast) i 20 ml dyrkningsmedium per plade i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator.
  12. Der tilsættes 10 ml frisk celledyrkningsmedium på dag 3, uden at ældre cellekulturmedium fjerne de 20 ml.
  13. Erstatte den gamle medium af hver plade med 20 ml frisk dyrkningsmedium på dag 6. gøre dette, vil ikke-adhærente celler også fjernes.
  14. Dag 8:
    1. Frigør celler ved at inkubere dem 5 mi ved 37 ° C i 10 ml citrat saltopløsning (135 mM kaliumchlorid plus 15 mM natriumcitrat i H2O, autoklaveret) og vaskes med 10 ml PBS. Count modne knoglemarvafledte makrofager (BMDM) på dag 8 ved hjælp af en celletæller.
    2. Kontroller dannelsen af ​​modne (CD11b + F4 / 80 +) BMDM ved visuel inspektion eller ved flowcytometri. Felt 10 5 celler med 1/100 anti-CD16 / CD32 i PBS i 20 minutter i 100 pi PBS, inkuberes med 1/200 anti-CD11-FITC plus 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 ved stuetemperatur, vask og analysere ved flowcytometri.
      Bemærk: Dyrkning museknoglemarv afledt makrofager er blevet offentliggjort i detaljer tidligere i dette tidsskrift af Ying et al 11..
  15. Seed 50.000 celler (optimale celletal skal optimeres) per brønd i en cellekultur mikroplade i 100 pi kulturmedium. Må ikke frø celler i korrektion baggrunden brønde (A1, A12, H1, H12) og sætte mediet kun (ingen celler) i disse brønde Tip:. Hold pipetten i en vinkel etBout halvvejs ned langs siden af ​​brøndene for de fleste homogent cellelag.
  16. Lade cellerne afregne ved stuetemperatur i en cellekultur hætte i 1 time. Dette vil fremme endnu cellefordeling og reducere randeffekter. Overvåge tilslutning ved mikroskopi og kultur i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator.
  17. Tre timer efter udpladning, stimulerer celler i 24 timer med 10 ng / ml LPS eller 20 ng / ml rekombinant muse-IL-4 til at generere M1 eller M2 makrofager, henholdsvis. Medtag ubehandlede naive (M0) makrofager som en kontrol. Vurdere korrekt M1 og M2 makrofag polarisering ved måling LPS-induceret sekretion af IL-6, IL-12, TNF (ELISA) og IL-4-induceret arginase-1-aktivitet og / eller MMR (CD206) og MGL (CD301) overfladeekspression (flowcytometri) som beskrevet tidligere 3,11.
    Bemærk: På dette tidspunkt kan celler (præ) -behandlede med farmakologiske forbindelser af interesse eller makrofager kan stimuleres med andre faktorer. Da kunne variationen mellem separate brønde være substantial, er det tilrådeligt at anvende mindst 4 og ideelt 6 brønde pr tilstand.

2. Forberedelse af det ekstracellulære Flux Assay

  1. Hydrere sensorpatron én dag før analysen køres:
    1. Placer sensoren patron på hovedet ved siden af ​​hjælpeprogrammet pladen.
    2. Fyld hver brønd af nytten plade med 200 pi kalibrant opløsning og sænk sensorpatron på nytten pladen nedsænkning sensorerne i kalibrant opløsning.
    3. Kontroller, at kalibrant løsning er højt nok til at holde sensorerne neddykket og sted i en ikke-CO 2 37 ° C inkubator O / N.
  2. Forbered assaymedium på dagen for assayet som følger:
    1. Warm 50 ml XF basismedium til 37 ° C.
    2. Tilsæt 500 pi 200 mM L-glutamin for at få en 2 mM slutkoncentration.
    3. Indstil pH til 7,4 under anvendelse af 1 N NaOH, og der steriliseres med en 0,2 um filter og holde assay medium ved 37 ° C.
  3. Fjern forsigtigt cellekulturmediet fra polariserede makrofager og opbevar det ved -20 ° C til senere brug (f.eks ELISA til at undersøge ordentlig makrofag polarisering). Vask cellerne med 100 pi assaymedium tilsættes 180 pi assaymedium per brønd og kontrollerer i mikroskop at cellerne ikke blev vasket bort. Placer celledyrkningspladen i et 37 ° C inkubator uden CO 2 til 1 time forud for analysekørsel.
  4. Forbered 10 x injektion forbindelse blandinger A Til D som beskrevet i tabel 1, opvarmes til 37 ° C, justere pH til 7,4 og Filtersteriliser.
    1. Gør alle forbindelser i disse blandinger ved 10x den endelige koncentration i cellekultur brønde og optimere disse koncentrationer for hver celletype.
  5. Indlæs sensoren patron med de medfølgende lastning guider med angivne mængder (tabel 1) af de forberedte 10x injektion sammensatte blandinger i havnene A, B, C og D, respectively.
Blanding / Injection Forbindelser Volumen tilsat for at få 10x blanding (pi) Volumen assaymedium (ml) Volumen injiceres under kørsel (pl) Slutkoncentrationen i assayet
EN 2,5 M (45%) glucose 300 2.7 20 25 mM
B 5 mM oligomycin A (OM) 9 3.0 22 1,5 uM
C 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 uM
100 mM natriumpyruvat opløsning 300 1 mM
D 5 mM antimycin A (AA) 15 3.0 28 2,5 uM
5 mM rotenon (Rot) 7.5 1,25 uM

Tabel 1. Injektion blandinger.

3. bioenergetic karakterisering af polariseret M1 og M2 BMDM bruger en Ekstracellulær Flux Analyzer

  1. Opret en assay skabelon med analysen guiden med to minutter MIX og 3 minutters FORANSTALTNING gange, og (mindst) 3 mix og hastighedsmålinger sløjfer før hver af de 4 injektioner (tabel 1), og efter den sidste injektion.
    Bemærk: Disse koncentrationer er gældende for knoglemarvafledte makrofager og RAW264.7 makrofag cellelinier, men bør optimeres for hver celletype. Tilføjelse pyruvat i FCCP blandingen er nødvendig til brændstof maksimal respiration.
  2. Start kørslen ved at skubbe start bunden og følg instruktionerne i apparatet. Første belastning bilentron plade med de hydrerede sonder til at tillade kalibrering af apparater og næste belastning cellepladen.
  3. Efter assayet, omhyggeligt kasseres alt assaymedium og gemme den analyserede cellekultur mikroplade ved -20 ° C til fremtidig celle normalisering ved hjælp af celleproliferationsassay kit som beskrevet i detaljer af leverandøren.
    1. Kort fortalt, udarbejde en 1x celle-lysepuffer ved fortynding komponent B 20 gange i destilleret vand og fortyndes forbindelse A 400-fold i 1x celle-lysis buffer. Tilsæt 200 pi per brønd, inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur og måle fluorescens med ~ 180 nm excitation og ~ 520 nm emission maxima.
      Bemærk: Når man arbejder med ikke-adhærente celler eller hvis dårlig vedhæftning er en bekymring, direkte celleproliferation kit kan anvendes som et alternativ, da denne protokol ikke kræver kassere alle assaymedium. Men denne direkte protokol er lidt mindre følsom i forhold til den anvendte protokol i dette laboratorium.
  4. Efter fluorescensmåling, normaliserecelletallet i hver brønd som et forhold, hvor den gennemsnitlige celletal af alle naive makrofag brønde sættes til 1.
    Bemærk: Protein kvantificering (fx med et BCA-assay) kan anvendes som en alternativ måde at normalisere celler tæller. Alligevel, i vore hænder dette assay var mindre følsomme i forhold til celleproliferationsassayet kit.

Representative Results

Efter afslutning af ekstracellulære flux assay og celle kvantificering, kan data normaliseres for celletal og analyseret. Dette vil typisk give ECAR og OCR plots som vist i figur 1A og figur 1B.

Efter injektionen af ​​glucose (A), stigningen i ECAR repræsenterer glycolyse sats. Den yderligere stigning i ECAR efter ATP syntase hæmning med oligomycin (B) indeholder oplysninger om den glycolytiske reserve og kapacitet (figur 1A). Ved analyse af OCR-værdier, oligomycin injektion (B) giver mulighed for beregning af iltforbrug anvendt til mitokondrie ATP-syntese. FCCP (C) afkobler mitokondrie respiration og de tilsvarende OCR målingerne giver data om maksimal og reservedele respiratorisk kapacitet. Endelig injektion rotenon (Rot) og antimycin A (AA) blokerer mitokondrie kompleks I og III, og den resterende OCR repræsenterer de ikke-mitokondrie ilt ulemperumption (figur 1B).

Figur 1
Figur 1: metaboliske parametre afledt fra en XF ekstracellulært flux assay. (A) Følgende parametre for cellulær glykolysen beregnes ud fra ECAR værdierne (i mph / min): glykolyse, maksimal glykolytisk kapacitet og glycolytisk reserve. (B) OCR målinger (i pMol / min) anvendes til at beregne de næste grundlæggende parametre for mitokondriefunktionen: basal respiration ATP produktion, proton lækage, maksimal respiration og reservedele respiratorisk kapacitet. Gluc = glucose; OM = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid 4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon; AA = antimycin A; Rot = Rotenon Klik her for at se en større version af dette tal.

Efter flugt, ECAR og OCR-målinger 1 intoL 15 for hver brønd kan eksporteres til Excel og de følgende glykolytiske parametre kan beregnes ud fra de ECAR målinger på følgende måde:

Ikke-glykolytisk forsuring = gns. ECAR (1,2,3)

Glykolysen = gns. ECAR (4,5,6) - gns. ECAR (1,2,3)

Maksimal glykolytisk kapacitet = gns. ECAR (7,8,9) - gns. ECAR (1,2,3)

Glykolytisk reserve = gns. ECAR (7,8,9) - gns. ECAR (4,5,6)

Fra OCR satser, kan de næste metaboliske egenskaber bestemmes:

Ikke-mitokondrie respiration = gns. OCR (13,14,15)

Basal respiration = gns. OCR (4,5,6) - gns. OCR (13,14,15)

ATP-produktion = gns. OCR (4,5,6) - gns. OCR (7,8,9)

Proton læk =gns. OCR (7,8,9) - gns. OCR (13,14,15)

Maksimal respiration = gns. OCR (10,11,12) - gns. OCR (13,14,15)

Spare respiratorisk kapacitet (SRC) = gns. OCR (10,11,12) - gns. OCR (4,5,6)

Figur 2
Figur 2:. Metaboliske karakteristika naive (M0), LPS- (M1) og IL-4- (M2) polariserede makrofager For hver måling, middelværdien og standardfejlen af middelværdien (SEM) af 8 individuelle brønde præsenteres. (A) Ekstracellulære forsuring satser (ECAR, i mph / min) og (B) forbrug ilt satser (OCR, i pMol / min) måles til forskelligt polariseret (M1 og M2) og naive makrofager (M0). Alle målinger blev normaliseret for celleantal (målt med CyQUANT) og den gennemsnitlige celletal af de naive makrofager blev fastsat til 1. IFremragning A = glucose; B = oligomycin; C = FCCP; D = antimycin + Rotenon. Klik her for at se en større version af dette tal.

Som vist i figur 2A, inducerer makrofagaktivering med LPS forøget glycolytisk metabolisme. Forskellene mellem LPS og IL-4-behandlede makrofager er endnu mere tydeligt, når man ser på forbrug oxygen satser (OCR) i figur 2B. Faktisk, mens den maksimale oxidative metabolisme er stærkt undertrykt i M (LPS), IL-4 inducerer basal og især maksimal respiration i M2 makrofager. Man bør bemærke, at øget glycolytisk er ret unik for M (LPS) makrofager og er ikke nødvendigvis et kendetegn for M1 makrofager siden M (IFNy) makrofager ikke vise styrke glykolyse.

Samlet set er dette ekstracellulære flux analyse viser that IL-4-induceret M2 makrofager er kendetegnet ved forbedret oxidativ metabolisme og især en stor uudnyttet respiratorisk kapacitet (SRC), mens LPS-aktiverede makrofager display forbedret glykolytisk stofskifte og ikke besidder nogen overskydende respiratorisk kapacitet.

Discussion

Målet med vores laboratorium er at forstå, hvordan makrofag polarisering og funktion kan påvirkes med det ultimative mål at forbedre resultatet af åreforkalkning og andre betændelsestilstande 12. For at vurdere makrofag polarisering, man typisk måler LPS (+ IFNy) -induceret og IL-4-induceret genekspression af M1 og M2 markørgener (qPCR), bestemmer IL-6, IL-12, TNF og NO sekretion (ved ELISA og Griess reaktion) og undersøger IL-4-induceret CD71, CD206, CD273 og CD301 overfladeekspression (ved flowcytometri) og arginase aktivitet 3,13. Derudover kan apoptose analyser (ved Annexin-V / PI farvning), fagocytose assays (med fluorescerende latexperler og / eller pHrodo E. coli) og skum celle dannelse assays (ved Dii-oxLDL optagelse LipidTOX neutralt lipid farvning) udføres for at evaluere makrofag funktionalitet 14. Derudover kan udføres ekstracellulære flux analyse til måling bioenergetik profiler af polariseret macrophages som en ny og alternativ funktionel udlæsning.

Dette håndskrift viser, at makrofag polarisering inducerer metaboliske omprogrammering med LPS-induceret makrofager skifter til øget glykolysen som deres energikilde. Omvendt IL-4-induceret M2 makrofager bruger mitokondriel oxidativ fosforylering som den vigtigste kilde til ATP. Vigtigere, metaboliske omprogrammering ikke kun giver energi til de særlige krav til M1 og M2 polariserede makrofager. Faktisk metaboliske ændringer påvirker metabolitkoncentrationer, der er direkte regulatorer af makrofag fænotype 10,15,16. Derfor makrofag stofskifte er ikke kun et karakteristisk (som vist her i figur 2), men også en drivkraft for distinkte makrofag polarisering stater, og den nye viden støttede den hurtige vækst i det immunometabolism forskningsområdet løbet af de sidste par år.

Men robuste målinger af metaboliske profiler i makrofager forblev vanskelig og havde deres begrænsninger. I denne undersøgelse er et ekstracellulært flux analysator anvendes til robust måling glycolyse, glycolytisk reserve, maksimal glycolytisk kapacitet, ikke-glycolytiske forsuring, basal og maksimal respiration, ATP-produktion, ekstra respiratorisk kapacitet, proton lækage og ikke-mitokondrielle respiration i realtid i en minimal mængde af makrofager.

Derfor har vi ændret og forbedret producentens protokoller som følger. Standarden Mito Stress Test (# 103015-100) foreslår at bruge medium med glucose og pyruvat og en protokol med 3 injektioner (OM, FCCP, AA / Rot). Vi vælger at starte analysen med glucose / pyruvat-frit medium, tilføje glucose som første injektion i port A (som i Glycolysis Stress Test # 103.020 til 100), og der tilsættes pyruvat sammen med FCCP afkobler i havn C. På denne måde , alle relevante glycolyse parametre er afledt af de ECAR målinger 1-9 og alle relevante oplysninger om mitochondrial funktion fra OCR-målinger 4-15.

Bemærk, at det er afgørende at injicere pyruvat sammen med FCCP til brændstof maksimal respiration efter frakobling. Før du bruger denne kombinerede protokol, bør man også kontrollere, at 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) sænker ECAR niveauer efter analysen til de basale værdier (1-3), og at de registrerede ECAR satser 4-6 er faktisk skyldes glykolyse. Derudover bør man forstå, at forbindelsen koncentrationer og celleantal, der anvendes i dette manuskript er gyldige for knoglemarvafledte makrofager og RAW264.7 makrofag cellelinier og skal optimeres for andre celletyper. Desuden bør man bemærke, at M-CSF, der anvendes til at generere knoglemarvafledte makrofager fremmer en M2-lignende antiinflammatorisk fænotype. De præsenterede resultater fra knoglemarvafledte makrofager kan derfor være ikke fuldt sammenlignelige med målinger med primært væv residente makrofager eller makrofager cellelinier, der ikke kræver M-CSF under celle culturing.

Sammenlignet med de eksisterende metoder, denne protokol kræver minimale mængder af makrofager og hurtigt giver stort set alle fundamentale metaboliske cellekarakteristika. Dette resulterer i nok overskydende celler til at udføre andre immunologiske assays og endda celler til bioenergetik profilering kan stadig anvendes til andre Hensigt efter analysen. Desuden især 96-brønds plade format giver vurdere flere betingelser i realtid samtidig. Alligevel kan variationen mellem individuelle brønde være betydelige, og derfor ønskes ofte at anvende mindst 4 brønde pr tilstand. Taget denne begrænsning i betragtning, der er beskrevet ekstracellulære flux analyse tillader stadig at køre mere end 10 eksperimentelle betingelser (n = 6) på en gang, hvilket er langt mere end de traditionelle teknikker.

Samlet set denne artikel giver et let og reproducerbar funktionel analyse, der gør det muligt at måle alle relevante glykolyse og mitokondrie parammetre i polariserede makrofag delmængder. Denne teknik kan tjene som en fremtidig anvendelse til at vurdere makrofagfunktion og til at evaluere virkningen af forskellige manipulationer (f.eks gen vælte, nye lægemidler, etc.) på makrofag s (metabolisk) fænotype. Som sådan kan ekstracellulære flux data anvendes i forbindelse med andre assays for at tillade grundig karakterisering af status makrofagaktivering.

Disclosures

Fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Seahorse Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G and 25G needles Becton Dickinson #300800 and #300600 To flushed bone marrow
10 ml syringes Becton Dickinson #307736 To flushed bone marrow
Petri dishes Greiner #639161 To culture bone marrow cells
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #C7026 For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #35011 For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)
XFe96 cell culture microplate Seahorse Bioscience #101085-004 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) Peprotech #214-14-B Used to induced alternative macrophage activation
lipopolysaccharide (LPS) Sigma #L2637 Pro-inflammatory stimulus
Seahorse Sensor Cartridge  Seahorse Bioscience #102416-100 Contains the probes for pH and O2 measurement
Seahorse XF Calibrant  Seahorse Bioscience #100840-000 Needed to hydrate the probes overnight 
XF base medium  Seahorse Bioscience #102353-100 Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes
L-glutamine Life Technologies #25030-081
D-(+)-Glucose Sigma #G8769 Fuels glycolysis once added to the cells
oligomycin A Sigma #75351 Inhibits mitochondrial ATP synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Sigma #C2920 Uncouples mitochondrial respiration
100 mM Sodium Pyruvate solution Lonza #BE13-115E Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis
Antimycin A Sigma #BE13-115EA8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Rotenone Sigma #BE13-115EA8674R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Casy Cell Counter Roche Diagnostics #05 651 697 001 Instrument to count cells
anti-CD16/CD32 eBioscience #14-0161 Fc receptor block flow cytometry
anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience #47-4801 Antibody to stain macrophages
anti-CD11b-FITC eBioscience #11-0112 Antibody to stain macrophages

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Comments

1 Comment

  1. After step 17 in your protocol, you have a note that says pharmaceutical compounds can be used at this point. Does that mean immediately following the LPS stimulation or does this mean 24 hours after the LPS stimulation?

    Also, in step 17, do you suggest treating wells directly with LPS or adding LPS to fresh media and replacing the media on the plate?

    Reply
    Posted by: Morgan N.
    January 24, 2018 - 12:25 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics