Metabolsk Karakterisering av polarisert M1 og M2 benmargavledede Makrofager Bruke Sanntids Ekstracellulær Flux Analyse

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (105), e53424, doi:10.3791/53424 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mens makrofager spiller en sentral rolle i nesten alle sykdommer, de molekylære mekanismene som regulerer deres fenotype er fortsatt ikke helt raknet. Makrofager vise høy heterogenitet og som svar på mikromiljøet vedta ulike fenotyper 1. LPS (+ IFNy) -indusert klassisk aktivert M1 eller M (LPS) makrofager fremme betennelse og beskytter verten mot forskjellige typer mikrobielle trusler 2. Andre bruker IFNy alene eller i kombinasjon med TNF som stimuli for å fremkalle M1 polarisering. IL-4 og / eller IL-13 induserer alternativ makrofagaktivering og disse M2 eller M (IL-4) celler er potente suppressorer og kontrollere for pågående immunresponser 3. Polariserte makrofager vise en tydelig regulering av cellenes stoffskifte med LPS-aktiverte M1 makrofager omgår en metabolsk bryter til økt glykolyse 4-6. Motsatt, forbedret fettsyre oksidasjon (FAO) og mitokondrielle oxidative fosforylering (OXPHOS) gir vedvarende energi i IL-4-indusert M2 makrofager 7-9. Således er endret metabolisme ikke bare en karakteristikk av polariserte makrofag-undergrupper, er det også en forutsetning for riktig polarisering og inflammatorisk regulering. Viktigere, hemningen av glykolyse eller OXPHOS / FAO har vist seg å svekke M1 eller M2 aktivering henholdsvis 8,10. Som sådan, kan identifisere metabolske endringer i makrofager bli brukt som et verktøy for å vurdere deres polarisering status og inflammatorisk potensial.

En konsekvent metode som måler makrofag-metabolisme kan derfor brukes til å forutsi hvorvidt et stoff, gene knock down eller annen behandling påvirker makrofag polarisering og funksjon. I denne videoen er et ekstracellulært flux analysator brukes til å karakterisere bioenergi profiler av naive, M1 og M2 makrofager.

Dette manuskriptet detaljer en optimalisert protokoll som tillater målingav alle relevante glykolyse parametere (glykolyse, maksimal glykolyse og glycolytic reserve) og mitokondrienes funksjon egenskaper (totalt respirasjon, basal mitokondriell respirasjon, ATP produksjon, proton lekkasje, maksimal respirasjon og reserveluftkapasitet) i en enkelt analyse. Ved hjelp av denne eksperimentelle oppsettet kan bioenergi sammenlignes mellom kontroll og 'endres' (f.eks genet slå ned, transgen overekspresjon eller farmakologisk behandling) celler.

Protocol

1. Dyrking og polariserings benmargavledede Makrofager

  1. Dag 0: Isoler femur og tibia bein fra 6-10 uker gamle mus av interesse (C57Bl / 6 i denne analysen).
  2. Fjern muskelvev fra beina og plassere beina i en 9 cm petriskål fylt med iskald PBS.
  3. Overfør benene til en 9 cm Petriskål fylt med 70% etanol og rist platen i 30 sekunder.
  4. Overfør benene til en frisk 9 cm petriskål fylt med iskald steril PBS.
  5. Skjær femur og tibia i begge ender med steril saks.
  6. Spyle bein med 10 ml iskald steril PBS ved hjelp av en 10 ml sprøyte og en 25 G nål. Samle benmargen i en 50 ml tube.
  7. Overfør benmargceller til en ny 50 ml tube bruker en 23 G nål.
  8. Gjenta dette trinnet med en 25 G nål. Merk: Disse trinnene er nødvendig for å fjerne celleklumper og beinrester.
  9. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  10. Kast supernatant og resuspender cellene i 40 ml cellekulturmedium (RPMI-1640 pluss 2 mM L-glutamin, 10% FCS, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml) og 15% filtrert L-929-celle ( ATCC, CCL-1) -conditioned medium inneholdende M-CSF (eller alternativt 10 ng / ml rekombinant, M-CSF i stedet for L-929-celle-kondisjonert medium).
    Merk: generasjonen av L-929 cellekondisjonerte medium ble beskrevet tidligere i dette tidsskriftet i 2013. 11
  11. Kultur cellene fra ett muse i to 15 cm petriskåler (ikke bruk cellekulturbehandlede plater siden makrofag ikke vil løsne fra denne plast) i 20 ml kulturmedium per plate i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
  12. Tilsett 10 ml friskt cellekulturmedium på dag 3, uten å fjerne 20 ml eldre cellekulturmedium.
  13. Erstatte det gamle mediet for hver plate med 20 ml frisk kultur medium på dag 6. Å gjøre dette, vil ikke-adherente celler også bli fjernet.
  14. Dag 8:
    1. Løsne celler ved å inkubere dem 5 mi ved 37 ° C i 10 ml citrat saltvann (135 mM kaliumklorid pluss 15 mM natriumcitrat i H 2 O, autoklavert) og vask med 10 ml PBS. Telle moden benmarg-avledede makrofager (BMDM) på dag 8 ved hjelp av en celleteller.
    2. Kontroller dannelsen av modne (CD11b + F4 / 80 +) BMDM ved visuell inspeksjon eller ved flowcytometri. Blokk 10 5 1/100-celler med anti-CD16 / CD32 i PBS i 20 min i 100 ul PBS, inkuberes med anti-1/200 CD11b-FITC pluss 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 ved RT, vask og analysere ved flowcytometri.
      Merk: Dyrking mus benmargavledede makrofager har blitt publisert i detalj tidligere i denne beretning ved Ying et al 11..
  15. Seed 50.000 celler (optimal celletellinger må optimaliseres) per brønn i en mikroplate-cellekultur i 100 ul kulturmedium. Ikke frø celler i bakgrunnen korrigerings brønner (A1, A12, H1, H12) og sette medium bare (ingen celler) i disse brønnene. Tips: Hold pipetten på skrå enanfall halvveis ned på siden av brønner for de homogent cellelag.
  16. La cellene sedimentere ved romtemperatur i en cellekultur hette i 1 time. Dette vil fremme enda celle distribusjon og redusere kanteffekter. Overvåk tilslutning ved hjelp av et mikroskop og kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  17. Tre timer etter plating, stimulerer cellene i 24 timer med 10 ng / ml LPS, eller 20 ng / ml rekombinant muse-IL-4 for å generere M1 eller M2 makrofager, respektivt. Inkluder ubehandlede naive (M0) makrofager som en kontroll. Vurdere riktig M1 og M2 makrofag polarisering ved måling av LPS-indusert sekresjon av IL-6, IL-12, TNF (ELISA) og IL-4-indusert arginase-1-aktivitet og / eller MMR (CD206) og MGL (CD301) overflate-ekspresjon (flowcytometri), som beskrevet tidligere, 3,11.
    Merk: På dette punktet, kan cellene være (forhånds) -behandlet med farmakologiske forbindelser av interesse eller makrofager kan stimuleres med andre faktorer. Siden kan variasjonen mellom separate brønner være substantial, er det tilrådelig å bruke minst 4 og ideelt sett seks brønner per tilstand.

2. Utarbeidelse av Ekstracellulær Flux analysen

  1. Hydrat sensorkassetten en dag før kjører analysen:
    1. Plasser sensoren kassetten opp ned ved siden av verktøyet plate.
    2. Fyll hver brønn av verktøyet platen med 200 ul kalibreringsløsning og lavere sensorkassetten på verktøyet platen senke sensorene i kalibreringsløsningen.
    3. Verifisere kalibreringsløsning nivået er høyt nok til å holde sensorene nedsenket og plass i en ikke-CO 2 37 ° C inkubator O / N.
  2. Forbered analysemedium på dagen for analysen som følger:
    1. Varm 50 ml XF-basismedium til 37 ° C.
    2. Legg 500 pl 200 mM L-glutamin for å få en 2 mM sluttkonsentrasjon.
    3. Juster pH til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH og sterilisere med et 0,2 um filter og holde analysemedium ved 37 ° C.
  3. Fjern forsiktig cellekulturmediet fra den polariserte makrofager og lagre det ved -20 ° C for fremtidig bruk (f.eks ELISA for å undersøke korrekt makrofag polarisering). Vask cellene med 100 ul assaymedium, tilsett 180 mL assaymedium per brønn og verifisere under mikroskopet at cellene ikke ble vasket bort. Plasser cellekulturplate i en 37 ° C inkubator uten CO2 i 1 time forut for analysekjøring.
  4. Forbered 10 x injeksjon forbindelse blandingene A til D som beskrevet i tabell 1, varmes opp til 37 ° C, justere pH til 7,4, og filtersteriliser.
    1. Gjør alle forbindelser i disse blandingene ved 10 x sluttkonsentrasjonen i brønnene cellekultur og optimalisere disse konsentrasjonene for hver celletype.
  5. Laste sensoren kassetten ved hjelp av disse laste guider med angitte volumer (tabell 1) av de preparerte 10x injeksjon sammensatte blandinger i havner A, B, C og D, respectively.
Blanding / Injection Forbindelser Volume lagt for å få 10x blanding (pl) Volume analysen Medium (ml) Volum injisert under kjøring (pl) Sluttkonsentrasjon i analysen
EN 2,5 M (45%) glukose 300 2.7 20 25 mm
B 5 mM oligomycin A (OM) 9 3.0 22 1,5 mikrometer
C 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 mikrometer
100 mM natriumpyruvat løsning 300 1 mm
D 5 mM antimycin A (AA) 15 3.0 28 2,5 mikrometer
5 mM rotenon (Rot) 7.5 1,25 mikrometer

Tabell 1. Injeksjon blandinger.

3. bioenergetiske Karakterisering av polarisert M1 og M2 BMDM bruker en Ekstracellulær Flux Analyzer

  1. Lag en analyse mal med analysen veiviser med to minutters MIX og 3 minutters måle tider og (minst) 3 mix og hastighetsmålinger looper før hver av de 4 injeksjoner (tabell 1), og etter den siste injeksjonen.
    Merk: Disse konsentrasjonene er gyldige for benmarg-avledede makrofager og Raw264.7 makrofagcellelinjene, men bør være optimalisert for hver celletype. Tilsetning av pyruvat i FCCP blandingen er nødvendig for å drivstoff maksimal åndedrett.
  2. Start løp ved å trykke på start nederst og følg instruksjonene i apparatet. Første last bilensetten plate med de hydratiserte prober for å tillate kalibrering av anordningen og ved belastningscelleplaten.
  3. Etter målingen ble omhyggelig forkaste alle analysemedium og lagre den analyserte cellekultur-mikroplater ved -20 ° C for fremtidig celle normalisering ved hjelp av celleproliferasjonsanalyse settet som beskrevet i detalj av leverandøren.
    1. I korthet fremstille en 1x celle-lyseringsbuffer ved fortynning av komponent B 20 ganger i destillert vann og fortynnet forbindelse A 400-ganger i 1 x celle-lyseringsbuffer. Tilsett 200 mL per brønn, inkuber 5 min ved RT og måle fluorescens med ~ 180 nm eksitasjon og ~ 520 nm utslipp maxima.
      Bemerk: Når man arbeider med ikke-adherente cellene, eller dersom dårlig tilslutning er et problem, den direkte celleproliferasjon sett kan brukes som et alternativ, siden denne protokollen krever ikke forkaster alle analysemedium. Likevel er denne direkte protokollen litt mindre følsom enn den protokoll som brukes i dette laboratoriet.
  4. Etter fluorescens måling, normalcelletallet i hver brønn som et forhold hvori den gjennomsnittlige celletall i alle naive makrofag brønnene settes til en.
    Merk: Protein kvantifisering (f.eks ved hjelp av en BCA assay) kan brukes som en alternativ måte å normalisere celler teller. Likevel, i våre hender dette assay var mindre følsomme i forhold til celleproliferasjonsanalyse kit.

Representative Results

Etter endt ekstracellulære flux analysen og celle kvantifisering, kan data være normalisert for celletall og analysert. Dette vil typisk gi ECAR og OCR plott som vist i figur 1A og 1B.

Etter injeksjon av glukose (A), økningen i ECAR representerer glykolyse rate. Den ekstra økningen i ECAR etter ATP syntase hemming med oligomycin (B) gir informasjon om glycolytic reserve og kapasitet (figur 1A). Ved analyse av OCR-verdier, oligomycin injeksjon (B) muliggjør beregning av oksygenforbruk som brukes for mitokondriell ATP syntese. FCCP (C) frakobler mitokondrielle åndedrett og de tilsvarende OCR målingene gi data om maksimal og reserveluftkapasitet. Til slutt, injeksjon av rotenon (Rot) og antimycin A (AA) blokk mitokondrie kompleks I og III, og den gjenværende OCR representerer de ikke-mitokondrie oksygen ulemperumption (figur 1B).

Figur 1
Figur 1: Stoffskifte parametre som stammer fra en XF Ekstracellulær flux analysen. (A) følgende parametre til mobil glykolyse beregnes ut fra de ECAR verdiene (km / h / min): glykolyse, maksimal glykolytisk kapasitet og glycolytic reserve. (B) OCR målinger (i pmol / min) blir brukt til å beregne den neste fundamentale parametre av mitokondriefunksjon: basal respirasjon, ATP produksjon, proton lekkasje, maksimal åndedrett og åndedretts ledig kapasitet. Gluc = glukose; OM = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid 4- (trifluormetoksy) phenylhydrazone; AA = antimycin; Rot = Rotenon Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter kjøringen, ECAR og OCR målinger 1 till 15 for hver brønn kan eksporteres til Excel og følgende glykolytiske parametrene kan beregnes ut fra de ECAR målinger som følger:

Non-glycolytic forsuring = avg. ECAR (1,2,3)

Glykolyse = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3)

Maksimal glycolytic kapasitet = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3)

Glycolytic reserve = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6)

Fra OCR priser, kan de neste metabolske egenskaper bestemmes:

Non-mitokondriell respirasjon = avg. OCR (13,14,15)

Basal respirasjon = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15)

ATP produksjon = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9)

Proton lekkasje =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15)

Maksimal respirasjon = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15)

Spare luftkapasitet (SRC) = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6)

Figur 2
Fig. 2: Metabolsk egenskapene til naive (M0), LPS- (M1) og IL-4- (M2) polariserte makrofager For hver måling, middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra 8 individuelle brønner er presentert. (A) Ekstracellulære forsuring priser (ECAR, i mph / min) og (B) oksygenforbruk (OCR, i pmol / min) er målt for forskjellig polarisert (M1 og M2) og naive makrofager (M0). Alle målinger ble normalisert for celletall (målt med CyQUANT) og gjennomsnittlig celletall av de naive makrofager ble satt til 1. Ijection A = glukose; B = oligomycin; C = FCCP; D = antimycin + Rotenon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Som vist i figur 2A, induserer makrofagaktivering med LPS øket glykolytisk metabolisme. Forskjellene mellom LPS og IL-4-behandlede makrofager er enda tydeligere når vi ser på oksygenforbruk (OCR) i figur 2B. Faktisk, mens det maksimale oksidative metabolismen er sterkt undertrykt i M (LPS), IL-4 induserer basal og spesielt maksimal respirasjon i M2 makrofager. Man bør merke seg at økt glycolytic er ganske unikt for M (LPS) makrofager, og er ikke nødvendigvis en karakteristikk av M1 makrofager siden M (IFNy) makrofager ikke viser forbedre glykolyse.

Samlet sett viser dette ekstracellulære flux analyse that IL-4-indusert M2 makrofager er preget av økt oksidativ metabolisme og spesielt høy reserveluftkapasitet (SRC), mens LPS-aktiverte makrofager skjerm forbedret glykolytisk stoffskifte og ikke har noe ledig luftkapasitet.

Discussion

Målet med vårt laboratorium er å forstå hvordan makrofag polarisering og funksjon kan bli påvirket med det endelige mål å forbedre utfallet av aterosklerose og andre betennelsestilstander 12. For å vurdere makrofag polarisasjon, en typisk måler LPS (+ IFNy) -indusert og IL-4-indusert genekspresjon av M1 og M2 markørgener (qPCR), bestemmer IL-6, IL-12, TNF og sekresjon NO (ved ELISA og Griess reaksjon) og undersøker IL-4-indusert CD71, CD206, CD273 og CD301 overflate uttrykk (ved flowcytometri) og arginase aktivitet 3,13. I tillegg kan apoptose-analyser (ved å Annexin V-/ PI farging), fagocytose analyser (med fluorescerende latekskuler og / eller pHrodo E. coli) og skumcelledannelsesanalyser (ved å DII-oxLDL opptak, LipidTOX nøytralt lipid-farging) bli utført for å evaluere makrofag funksjonalitet 14. I tillegg kan ekstracellulære flux analyse utføres for å måle bioenergi profiler av polarisert macrophages som en ny og alternativ funksjonell avlesning.

Dette manuskriptet viser at makrofagen polarisering induserer metabolske omprogrammering med LPS-indusert makrofager bytter til økt glykolyse som energikilde. Omvendt, IL-4-indusert M2 makrofager bruke mitokondriell oksidativ fosforylering som den viktigste kilden til ATP. Viktigere, metabolsk omprogrammering ikke bare gir energi til de spesielle kravene i M1 og M2 polariserte makrofager. Faktisk metabolske endringer påvirker metabolittkonsentrasjoner som er direkte regulatorer av makrofagen fenotype 10,15,16. Derfor er makrofag stoffskiftet ikke bare en egenskap (som vist her i figur 2), men også en sjåfør av forskjellige makro polarisasjonstilstander og denne nye kunnskapen støttet den raske veksten av immunometabolism forskningsområdet i løpet av de siste par årene.

Men robuste målinger av metabolske profiler i makrofager forble vanskelig og hadde sine begrensninger. I denne studien er et ekstracellulært flux analysator påført robust måle glykolyse, glycolytic reserve, maksimal glycolytic kapasitet, ikke-glycolytic forsuring, basal og maksimal respirasjon, ATP produksjon, ekstra luftkapasitet, proton lekkasje og ikke-mitokondriell respirasjon i sanntid i en minimal mengde av makrofager.

Derfor har vi endret og forbedret produsentens protokoller som følger. Standarden Mito Stress Test (# 103015-100) foreslår å bruke medium med glukose og pyruvat og en protokoll med 3 injeksjoner (OM, FCCP, AA / Rot). Vi velger å starte analysen med glukose / pyruvat-free medium, tilsett glukose som et første injeksjon i port A (som i glykolyse Stress Test # 103020-100) og legge pyruvat sammen med FCCP uncoupler i porten C. På denne måten alle relevante glykolyse parametre er utledet fra ECAR målinger 1-9 og all relevant informasjon om mitochondrial funksjon fra OCR-målinger 4-15.

Legg merke til at det er avgjørende å injisere pyruvat sammen med FCCP til drivstoff maksimal respirasjon ved frakobling. Før du bruker denne kombinerte protokollen, bør man også bekrefte at to-Deoxy-D-Glukose (2-DG) senker ECAR nivåer etter analysen til de basale verdiene (1-3), og at de registrerte ECAR prisene 4-6 er faktisk grunn til glykolyse. I tillegg bør man forstå at forbindelseskonsentrasjonene og cellenumrene som brukes i dette manuskriptet er gyldige for benmarg-avledede makrofager og Raw264.7 makrofagcellelinjene, og bør være optimalisert for andre celletyper. Videre bør man være oppmerksom på at M-CSF, som brukes til å generere benmarg-avledede makrofager fremmer en M2-aktig anti-inflammatorisk fenotype. De presenterte resultater fra benmargavledede makrofager kan derfor være ikke fullt ut sammenlignbare målinger med primær vev bosatt makrofager eller makrofager cellelinjer som ikke krever M-CSF under celle culturing.

Sammenlignet med eksisterende metoder, krever denne protokollen minimale mengder av makrofager og gir raskt nesten alle grunnleggende metabolske celleegenskaper. Dette resulterer i nok overskudd celler til å utføre andre immunologiske analyser og til og med de celler som anvendes for Bioenergi profilering kan likevel brukes til annen hensikt etter analysen. Videre tillater den bestemte 96-brønners plateformat vurdere flere betingelser i sanntid på samme tid. Likevel kan den variasjon mellom individuelle brønner være betydelig, og derfor er bruk av minst 4 brønner pr tilstanden er ofte ønskelig. Tatt i betraktning denne begrensningen, likevel tillater den beskrevne ekstracellulære flux analyse for å kjøre mer enn 10 eksperimentelle betingelser (n = 6) på en gang, noe som er mye mer enn tradisjonelle teknikker.

Samlet gir denne artikkelen en enkel og reproduserbar funksjonell analyse som tillater å måle all relevant glykolyse og mitokondriell parammeterne i polariserte makro undergrupper. Denne teknikken kan tjene som en fremtidig anvendelse for å vurdere makrofagfunksjonen, og for å vurdere effekten av forskjellige manipulasjoner (f.eks gene knock down, nye legemidler, etc.) på makrofag s (metabolsk) fenotype. Som sådan kan ekstracellulære strømningsdata brukes i forbindelse med andre metoder for å gi inngående karakterisering av makrofagaktivering status.

Disclosures

Fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Seahorse Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G and 25G needles Becton Dickinson #300800 and #300600 To flushed bone marrow
10 ml syringes Becton Dickinson #307736 To flushed bone marrow
Petri dishes Greiner #639161 To culture bone marrow cells
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #C7026 For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #35011 For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)
XFe96 cell culture microplate Seahorse Bioscience #101085-004 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) Peprotech #214-14-B Used to induced alternative macrophage activation
lipopolysaccharide (LPS) Sigma #L2637 Pro-inflammatory stimulus
Seahorse Sensor Cartridge  Seahorse Bioscience #102416-100 Contains the probes for pH and O2 measurement
Seahorse XF Calibrant  Seahorse Bioscience #100840-000 Needed to hydrate the probes overnight 
XF base medium  Seahorse Bioscience #102353-100 Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes
L-glutamine Life Technologies #25030-081
D-(+)-Glucose Sigma #G8769 Fuels glycolysis once added to the cells
oligomycin A Sigma #75351 Inhibits mitochondrial ATP synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Sigma #C2920 Uncouples mitochondrial respiration
100 mM Sodium Pyruvate solution Lonza #BE13-115E Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis
Antimycin A Sigma #BE13-115EA8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Rotenone Sigma #BE13-115EA8674R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Casy Cell Counter Roche Diagnostics #05 651 697 001 Instrument to count cells
anti-CD16/CD32 eBioscience #14-0161 Fc receptor block flow cytometry
anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience #47-4801 Antibody to stain macrophages
anti-CD11b-FITC eBioscience #11-0112 Antibody to stain macrophages

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Comments

1 Comment

  1. After step 17 in your protocol, you have a note that says pharmaceutical compounds can be used at this point. Does that mean immediately following the LPS stimulation or does this mean 24 hours after the LPS stimulation?

    Also, in step 17, do you suggest treating wells directly with LPS or adding LPS to fresh media and replacing the media on the plate?

    Reply
    Posted by: Morgan N.
    January 24, 2018 - 12:25 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics