Génération améliorée de cardiomyocytes induite en utilisant une construction polycistroniques Exprimant rapport optimal de Gata4, MEF2C et Tbx5

Developmental Biology

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Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

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Abstract

La conversion directe des fibroblastes cardiaques (SCF) en cardiomyocytes induites (ICMS) détient un grand potentiel pour la médecine régénérative en offrant des stratégies alternatives pour le traitement de la maladie de coeur. Cette conversion a été obtenue par expression forcée de facteurs tels que définis Gata4 (G), MEF2C (M) et Tbx5 (T). Traditionnellement, ICMS sont générés par un cocktail de virus exprimant ces facteurs individuels. Cependant, la reprogrammation efficacité est relativement faible et la plupart de l'in vitro G, M, T-fibroblastes transduits ne deviennent pas entièrement reprogrammés, ce qui rend difficile l'étude des mécanismes de reprogrammation. Nous avons récemment montré que la stoechiométrie de G, M, T est cruciale pour l'efficacité de reprogrammation ICM. Une stoechiométrie optimale de G, M, T avec relativement haut niveau de M et de faibles niveaux de G et T obtenus à l'aide de notre vecteur de MGT polycistronique (ci-après dénommé MGT) a augmenté de manière significative l'efficacité de la reprogrammation et amélioration de la qualité iCM in vitro. Ici nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour générer ICMS avec MGT construction à partir de fibroblastes cardiaques. Isolement des fibroblastes cardiaques, la génération du virus pour la reprogrammation et l'évaluation du processus de reprogrammation sont également inclus afin de fournir une plate-forme pour la production efficace et reproductible du SGCI.

Protocol

Le protocole décrit ici utilise des souris néonatales. Les soins et expériences sont réalisées en conformité avec les lignes directrices établies par la Division de médecine de laboratoire animale (DLAM) à l'Université de Caroline du Nord, Chapel Hill.

1. Préparation des tampons et des médias

  1. Préparer fibroblastes (FB) milieu: Supplément de 500 ml de milieu IMDM avec 100 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 6 ml de pénicilline / streptomycine.
  2. Préparer le milieu iCM: Complémentaires 400 ml du milieu DMEM avec 100 ml de milieu M199 et 50 ml de FBS.
  3. Préparer le milieu de B27: Supplément 490 ml RPMI1640 médias avec 10 ml B27 médias.
  4. Préparer Plat-E milieu de culture: 500 ml Supplément milieu DMEM avec du FBS à 50 ml, 5 ml de pénicilline / streptomycine et 5 ml d'acides aminés non-essentiels.
  5. Préparer Plat-E milieu de transfection: Supplément 500 ml du milieu DMEM avec du FBS à 50 ml et 5 ml d'acides aminés non-essentiels.
  6. Prepare gélatine revêtu plaque à 24 puits: Ajouter une solution de gélatine 0,5 ml à 0,1% à un puits de plaque à 24 puits, incuber à 37 ° C pendant au moins 10 min et aspirer juste avant l'utilisation.
  7. Préparer le tampon de marquage FACS: Supplément de 500 ml avec 10 ml de DPBS FBS et 2 ml d'EDTA (0,5 M) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Passer à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
  8. Préparer tampon MACS de tri: Supplément DPBS avec 500 ml 2,5 g de BSA et 2 ml d'EDTA (0,5 M) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Passer à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
  9. Préparer du tampon HBS 2x pour la transfection: compléter à 500 ml tampon HEPES (50 mM) de NaCl 280 mM (8,1816 g), 10 mM de KCl (0,37275 g), 1,5 mM de Na 2 HPO 4 (0,10647 g), mM de glucose 12 (1,08096 g ). Ajouter 650 ul d'environ 10 N de NaOH pour ajuster le pH à 7,05 à 7,12. Filtrer à travers un filtre de 0,22 um des pores et conserver à 4 ° C.
  10. Préparer 2,5 M solution de CaCl 2 pour la transfection: Ajouter 18,376 g CaCl 2 à 50 ml ddH 2 O. Filtrer à travers un filtre de 0,22 um des pores et conserver à 4 ° C.
  11. Préparer CPI (immunocytochimie) tampon de fixation: Ajouter 5 ml de paraformaldéhyde (PFA, 32%) à 35 ml DPBS pour atteindre une concentration finale de 4%.
  12. Préparer du tampon de perméabilisation ICC: Ajouter 0,1 ml de Triton 100 ml de DPBS pour atteindre une concentration finale de 0,1%.
  13. Préparer du tampon de blocage ICC: Ajouter 5 g d'albumine sérique bovine (BSA) à 100 ml de DPBS pour atteindre une concentration finale de 5%.
  14. Préparer du tampon de coloration ICC: Ajouter 1 g de BSA pour 100 ml de DPBS pour atteindre une concentration finale de 1%.

2. Génération de souris néonatales fibroblastes cardiaques

  1. Générer fibroblastes cardiaques de méthode de explant
    1. Clean néonatale αMHC-GFP souris transgénique (P1 à P2) avec 75% d'éthanol. Couper la tête avec des ciseaux stériles. Ensuite, faire une incision horizontale sous une aisselle à l'autre. Utilisez un stérilepince émoussée et pliés à disséquer le cœur et le placer dans un puits de la plaque de 24 puits contenant du tampon PBS glacé.
      1. Sinon, presser le coeur après l'incision horizontale.
    2. Vérifiez expression de la GFP dans le cœur par microscope à fluorescence. Étant donné que l'expression de la GFP est entraîné par le promoteur αMHC qui est un promoteur spécifique cardiaque, le cœur de souris transgénique doit être 15 en vert, alors que le cœur est faible négative dans toute fluorescence.
    3. Prendre 3-4 GFP coeurs positives dans une boîte de culture centre du puits de 60 mm et hachez-les en petits morceaux moins de 1 mm 3 dans la taille de ciseaux et des pinces stériles.
    4. Placez 3-4 coeurs hachées dans un plat de 10 cm avec 2 ml de milieu FB. Laissez les tissus installent pendant 3 heures.
    5. Lentement, ajouter 8 ml préchauffé médias FB pour les plats contenant des tissus cardiaques. Ne pas déranger les tissus pendant trois jours.
    6. Remplacer les médias tous les trois jours.
    7. Au jour 7, ASPIRmangé le milieu de culture et laver les cellules avec du DPBS. Ajouter 3 ml de trypsine à 0,05% à chaque plaque et à digérer à 37 ° C pendant 5 min.
    8. Ajouter 5 ml de milieu FB pour étancher la trypsine. Détacher les cellules doucement avec un grattoir à cellules. Introduire à la pipette les médias de haut en bas de dissocier outre mécaniquement le tissu.
    9. Recueillir des cellules et filtrer à travers 40 um crépines de cellules pour éviter la contamination des fragments de tissu cardiaque, puis sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min.
    10. Laver les cellules une fois avec MACS tampon et cellules sont prêtes pour le tri.
  2. Générer fibroblastes cardiaques de méthode de digestion enzymatique
    1. Récolte GFP Hearts positifs que 2.1.1. Transférez tous les cœurs dans un plat de 10 cm avec 10 ml DPBS glacées.
    2. Pressez ventricules avec des pinces stériles pour enlever le sang et rincer une fois avec DPBS glacées.
    3. Couper les cœurs d'être libre d'autres tissus et de matières grasses.
    4. Couper chaque cœur dans environ 4 morceaux qui sont encore vaguement reliés.
    5. Si moins de 20 coeurs, transférer le coeur dans un tube conique de 15 ml avec 8 ml chaud 0,05% de trypsine-EDTA, et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
      1. Si il y a 20-30 cœur, le cœur transférer dans un tube conique de 50 ml avec 10 ml chaud 0,05% de trypsine-EDTA, et on incube à 37 ° C pendant 15 min.
    6. Jeter la trypsine et ajoutez 5 ml (pour les moins de 20 coeurs) ou 10 ml (pour les 20-30 coeurs) chaude collagénase de type II (0,5 mg / ml) dans HBSS.
    7. Vortex tube sur vortex pendant 1 min à un niveau de vitesse d'environ 4 à 6 (si le liquide ne se lève pas pour le couvercle, puis la vitesse est très bien).
    8. Incuber le tube à 37 ° C bain d'eau pendant 3 à 5 min.
    9. Vortex le tube pendant 1 min.
    10. Les sédiments pendant 1 min par gravité jusqu'à ce que les morceaux de tissu se fixent, de recueillir le liquide dans un nouveau tube contenant 5 ml de milieu de FB froid.
    11. Répétez les étapes 2.2.6-2.2.10 3-5 fois.
    12. Combinez toutes les collections par filtration à travers 40 um tamis cellulairede faire suspension cellulaire unique.
    13. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
    14. Resuspendre les cellules dans 10 ml de tampon MACS, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
    15. Facultatif: Si il ya un grand nombre de cellules sanguines, remettre les cellules avec 1 ml RBC tampon de lyse (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 et 0,1 mM d'EDTA), garder sur la glace pendant 1 min, puis diluer avec 10 ml MACS tampon et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Laver une fois de plus avec un tampon MACS.
  3. Isolement de Thy1.2 + fibroblastes par MACS (magnétique tri cellulaire activé)
    1. Déterminer le nombre de cellules viables par coloration au bleu trypan.
      1. Prenez 10 cellules pi à partir de 10 ml de suspension cellulaire à l'étape 2.2.14. Mélangez-le avec une solution de bleu de 10 ul de 0,4% de trypan.
      2. Ajouter le mélange à un hémocytomètre. Laisser reposer pendant 3-5 min, puis examiner immédiatement sous un microscope. Les cellules mortes sont colorées dans les cellules bleues et viables sont sans tache.
      3. 4 x 10 (volume total de suspension cellulaire).
    2. Pour moins de 1 x 10 7 cellules, remettre les cellules avec 10 pi microbilles de Thy1.2 dans 90 ul refroidis tampon MACS. Ajouter plus de perles proportionnellement si il ya plus de 1 x 10 7 cellules. Mélanger bien et incuber dans un réfrigérateur (2-8 ° C) pendant 30 min.
    3. Ajouter 10 ml de tampon MACS et des échantillons de tourner à 200 g pendant 5 min; laver une fois avec 10 ml MACS tampon et centrifuger à nouveau.
    4. Amener le volume à 2 ml dans un tampon MACS.
    5. Mettre en place un séparateur MACS dans le capot. Insérer une colonne de LS pour le séparateur. Appliquer 3 ml de tampon MACS à la colonne pour équilibrer cela.
    6. Faire passer la suspension de cellules à travers la colonne de LS équilibrée.
    7. Lavez 3 fois avec 2 ml de tampon MACS à chaque fois.
    8. Prenez la colonne LS hors til séparateur et élue 3 fois avec 2 ml de tampon MACS dans un nouveau tube de 50 ml.
    9. Spin à 200 g pendant 5 min.
    10. Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu de FB, Compter les cellules et des semences dans des plaques à une densité adéquate. Pour les fibroblastes provenant méthode d'explant, la densité de cellules d'ensemencement peut être de l'ordre de 2 à 3 x 10 4 cellules / puits de plaque à 24 puits. Pour fibroblastes générés par la méthode de digestion enzymatique, la densité des cellules pourrait être autour de 4-5 x 10 4 cellules / puits de plaque à 24 puits.

3. Génération de rétrovirus pour ICM Reprogrammation

Remarque: Effectuez les étapes suivantes dans une enceinte de sécurité biologique BSL2 dans des conditions stériles. L'élimination appropriée des cellules transfectées, embouts de pipette et tubes est recommandé d'éviter tout risque de risques environnementaux et sanitaires.

  1. Maintenir des cellules Plat-E-E à Plat milieu supplémenté avec 1 ug / ml de puromycine et de 10 pg / ml de blasticidin à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Le jour 2, remplacer le milieu par Plat-E milieu de culture dépourvu puromycine et blasticidine.
  3. Au jour 0, diviser les cellules Plat-E en boîtes de 10 cm le jour avant la transfection 4-5 x 10 6 cellules par plaque à environ. Les cellules doivent être ~ 80-90% de confluence le jour de la transfection.
  4. Au jour 1, les médias changement de culture sur un support de transfection sur des cellules à moins de 1 heure avant la transfection. Procédure de transfection est la suivante:
    1. La transfection en utilisant des kits commerciaux
      1. Mélanger 20 ul réactif de transfection (par exemple Lipofectamine) et 500 pi médias sérique réduite (par exemple, Opti-MEM). Ajouter 10 pg du plasmide retroviral à un autre support 500 ul de sérum réduites. Incuber chaque mélange à la température ambiante (TA) pendant 5 min.
      2. Lentement, ajouter le mélange de plasmide au mélange de transfection. Cette étape peut prendre 15-30 sec. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante (solution peut paraître trouble). Ajouter chute de savant mélange aux cellules.
      3. Incuber pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C.
    2. Transfection en utilisant le phosphate de calcium.
      1. Mélanger 40 ul de 2,5 M CaCl 2 et 440 pi ddH 2 O, puis ajouter 20 pg du plasmide rétroviral (ajuster la quantité de ddH 2 O de sorte que le volume total est de 500 pi).
      2. Ajouter 500 pi 2x HBS à un tube de 15 ml conique.
      3. Vortex du HBS et en attendant, ajouter le mélange de calcium-ADN à la HBS goutte à goutte. Cette étape prend environ 30 secondes pour chaque échantillon. Donc au maximum faire 3-4 échantillons simultanément.
      4. Incuber à température ambiante pendant 3 minutes d'incubation pour plus de temps conduit à une plus grande précipité et moins de cellules prendra le précipité.
      5. Ajouter le mélange goutte à goutte à des cellules et observer sous microscope 20X. Précipités fins (un grand nombre de petits sont bons, mais quelques grands ne sont pas bonnes) doivent être considérés.
      6. Incuber pendant une nuit à 37 ° C incubateur.
    3. Le jour 2, changer de support sur les cellules avec 8 ml préchauffé milieux de culture. Incuber pendant 24 h.
    4. Au jour 3 et le jour 4, recueillir le surnageant de culture de la vaisselle à l'aide d'une seringue jetable de 10 ml stérile, en filtrant à travers un filtre de taille de cellulose de 0,45 um acétate de pores, et transférer dans un tube de 50 ml. Ajouter 2 ml de solution de précipitation rétrovirus à chaque surnageant contenant le virus 8 ml. Mélanger doucement et incuber une nuit à 4 ° C.
    5. Au jour 5, le mélange viral tourner à 1500 x g à 4 ° C pendant 30 min. Les particules virales doivent apparaître dans le culot blanc au fond du tube.
    6. Jeter le surnageant. Isoler solution résiduelle par centrifugation à 1500 xg pendant 5 min. Eliminer toute trace de liquide par aspiration, en prenant grand soin de ne pas perturber les particules rétrovirales précipités en tablettes.
    7. Reprendre pastilles rétroviraux avec 100 pi de tampon DPBS pour 8 ml de surnageant viral. Aliquotele virus sur de la glace. Utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C.

    4. La reprogrammation des fibroblastes cardiaques

    1. Ajouter 4 pi de 10 mg / ml solution de polybrène dans le milieu 10 ml iCM, et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. La concentration finale est de polybrène 4 ug / ml.
    2. Ajouter 500 ul médias iCM contenant polybrène à chaque puits de plaque à 24 puits ensemencées avec des fibroblastes.
    3. Ajouter 10 ul rétrovirus à chaque puits contenant soit 2-3 x 10 4 cellules de explant ou 4-5 x 10 4 cellules de la méthode de digestion enzymatique. La quantité de virus devrait être augmenté proportionnellement à l'augmentation du nombre de cellules dans des plaques de culture différentes ou des plats. Mettre la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 à 48 d'une heure pour permettre à l'infection virale. La ligne de temps pour la reprogrammation cardiaque est représenté sur la Figure 1.
    4. Après transduction virale, remplacer virus contenant les médias avec 500 ul médias régulière ICM.
    5. Changer de support tous les 2-3 jours. Pour la sélection positive des cellules transduites virales, ajouter médias iCM complétées avec la puromycine à 2 pg / ml aux cellules cibles. Gardez pendant trois jours. Après cela, maintenir la puromycine dans le milieu iCM à la concentration de 1 ug / ml.
    6. Trois jours après l'infection virale, prenez la plaque hors de l'incubateur et le placer sous un microscope à fluorescence inversé (20X) pour observer l'expression de la GFP.
      Remarque: Dix jours après l'infection virale, les cellules peuvent être récoltées pour analyse FACS analyse et ICC pour déterminer l'efficacité de reprogrammation (à l'étape 5 et 6).
    7. Quatorze jours après l'infection virale, remplacer iCM médias avec les médias de B27. Changer de support tous les trois jours. Battement spontané cellule loci peut apparaître à partir de cellules provenant de trois (procédé de digestion enzymatique) ou quatre (cellules de mode de explant) semaines après transduction virale.

    5. Immunocytochemical analyse de l'efficacité Reprogrammation

    1. Rincer les cellulesavec PBS glacé à trois reprises; éliminer l'excès de solution.
    2. Ajouter tampon de fixation 0,5 ml de la CPI à chaque puits de plaques à 24 puits. Fixer les cellules à la température ambiante pendant 15-20 min.
    3. Rincer les cellules avec PBS trois fois.
    4. Ajouter tampon de perméabilisation 0,5 ml de la CPI à chaque puits des plaques 24 puits. Perméabiliser les cellules à température ambiante pendant 15 min.
    5. Rincer les cellules avec PBS trois fois.
    6. Ajouter 0,5 ml CPI tampon de blocage dans chaque puits de plaque à 24 puits, incuber à température ambiante pendant 1 h.
    7. Anticorps primaire dilué avec le tampon CPI de coloration. Ajouter 200 pi solutions d'anticorps à chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C. Les facteurs de dilution anticorps sont répertoriés dans les Matériaux.
    8. Le lendemain, laver les cellules avec du PBS trois fois.
    9. Ajouter 200 d'anticorps secondaires solutions pi aux cellules et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.
    10. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
    11. Ajouter 150 ul solution contenant DAPI à chaque puits de montage. Laisser colorer les noyaux pendant 1 min. alorscouvrir chaque puits avec couvercle en verre ronde glissement et appuyez doucement sur le glissement contre la surface inférieure avec une pince pour enlever les bulles d'air.
    12. Aspirer la solution en excès et les échantillons sont prêts pour l'imagerie. Les images représentatives montrant les cellules reprogrammées qui expriment le marqueur cardiaque cTnT et αActinin à d14 sont présentées dans la figure 2B.

    6. Analyse FACS de la reprogrammation efficacité

    1. Laver soigneusement les cellules une fois avec du DPBS. Ajouter 0,3 ml de trypsine (0,05%) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
    2. Tapoter doucement la plaque pour faciliter la levée des cellules. Vérifiez le détachement des cellules au microscope. Ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque puits où la plupart des cellules sont dissociées. Pipette de haut en bas de dissocier outre mécaniquement les cellules.
    3. Transfert cellules dans la plaque de 24 puits à une plaque de puits puits profond de 96 puits en puits. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C pour recueillir les cellules.
    4. Laver les cellules une fois avecTampon FACS.
    5. Ajouter 100 solutions de fixation / perméabilisation pi pour remettre en suspension les cellules pendant 20 min à 4 ° C.
    6. Laver les cellules deux fois avec la solution de lavage de 1x, culot, et retirer le surnageant.
    7. Préparer une solution d'anticorps primaire contre la GFP et cTnT dans un tampon de lavage 1x. Bien remettre en suspension chaque échantillon avec une solution d'anticorps de 50 pi et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    8. Laver les cellules une fois dans la solution de lavage 1x, culot, et retirer le surnageant.
    9. Ajouter 50 une solution d'anticorps secondaire Alexa Fluor pi contenant 488 âne conjugué IgG anti-lapin Alexa Fluor 647 et âne conjugué IgG anti-souris de chaque échantillon. Incuber à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
    10. Laver les cellules une fois dans la solution de lavage 1x, culot, et retirer le surnageant.
    11. Resuspendre les cellules dans 400 ul tampon de fixation (des DPBS avec 1% PFA). Transfert cellule dans FACS tube avec bouchon de crépine de cellule. Les échantillons sont prêts pour la détection FACS. L'analyse FACS représentant de reprogrammation efficiencpMxs-y en utilisant la puromycine-MGT construire avec ou sans sélection à la puromycine est représenté sur la figure 2A.

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Representative Results

Les étapes de reprogrammation sont résumés par schématique sur la figure 1. Après MGT transduction, l'expression de GFP dans la reprogrammation des cellules peuvent être détectés dès le jour 3. sélection puromycine de cellules transduites commence au jour 3 et est mis à jour pendant les deux premières semaines si PMX-puro -MGT construction est utilisée. Le jour 10 au jour 14, l'expression des marqueurs cardiaques comme cTnT et αActinin pu être détecté à la fois par la CCI (figure 2B, à l'étape 5) et FACS (figure 2A, à l'étape 6), ce qui indique que les fibroblastes de départ sont en cours de reprogrammation vers une cellule cardiaque le sort.

Figure 1
Figure 1:. Représentation schématique du processus de reprogrammation cardiaque directe procédures à chaque point de temps sont décrits dans les boîtes noires. Les milieux de culture pour chaque étape sont présentés dans des boîtes colorées ci-dessous le tempsligne.

Figure 2
Figure 2: La reprogrammation de l'efficacité évaluée par FACS et CPI (A) analyse FACS sur ICMS générés à partir de fibroblastes fraîchement isolés au jour 10 après MGT transduction.. (B) coloration du SGCI à 2 semaines avec αMHC-GFP, TnTc cardiaque et αActinin avec DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole). Barre d'échelle: 200 um

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Discussion

Pour réussir une génération iCM lors de l'utilisation de ce protocole, il ya plusieurs facteurs importants qui ont une incidence sur l'efficacité globale. Notamment les conditions de fibroblastes de départ et la qualité de l'encodage de rétrovirus MGT peuvent grandement affecter l'efficacité de reprogrammation.

Il est important de générer des fibroblastes aussi frais et sain que possible. Pour la méthode de explant, les fibroblastes peuvent être utilisés avant les sept jours suivant les explants ont été étalées sur des plats. Pour la méthode de digestion enzymatique, les fibroblastes peuvent être utilisés dès le lendemain de l'isolement. Le gel ou repiquage les fibroblastes de reprogrammation est déconseillée. Ces traitements supplémentaires de fibroblastes vont diminuer de manière significative l'efficacité de reprogrammation. La densité de semis est un autre facteur important qui affecte l'efficacité de reprogrammation. Si les cellules sont faiblement tête de série, ils ont tendance à devenir malsaine avec la morphologie des cellules irrégulières et en grand format. Co RarementULD ces cellules être convertis en ICMS. Si les cellules sont ensemencées trop dense, la MOI (multiplicité d'infection) pour l'infection virale est diminuée. Prolifération de fibroblastes non infectées dilue considérablement les événements de reprogrammation conduisant ainsi à un faible pourcentage du SGCI. Nous remarquons aussi l'émergence de petites cellules dans pavée comme la morphologie si plusieurs cellules sont ensemencées pour la reprogrammation. Ils ne pouvaient guère être reprogrammées et ainsi aboutir à une efficacité réduite de reprogrammation. Lors de la modification du protocole pour différentes tailles de plaques de culture de tissu, il est recommandé que l'ensemencement du nombre de cellules est réglable proportionnellement à la surface de la boîte de culture.

La pureté des fibroblastes est essentielle pour la reprogrammation. La grande pureté des fibroblastes pourrait être atteint soit par tri FACS 15 ou à l'enrichissement MACS que nous avons décrit ici. Comparé à tri FACS, MACS tri est plus facile, plus douce et plus pratique. La pureté de cellule après MACS pourrait atteindre plus de 90% wpoule en suivant strictement le protocole. Faible pureté des fibroblastes peut diminuer l'efficacité de reprogrammation puisque les cellules contaminées sont plus difficiles à être reprogrammé de fibroblastes et qu'ils prolifèrent beaucoup plus rapidement que les cellules de reprogrammation. Il est également fortement recommandé de semer les cellules juste après MACS et effectuer infection virale nuit après l'ensemencement. Les fibroblastes trié peuvent devenir sénescentes partiellement après une croissance dans un plat pendant une longue période, ce qui diminue l'absorption des retrovirus qui infecte les cellules ne proliférant. Fibroblastes bout de la queue (FFF) et les fibroblastes embryonnaires (MEF) ont été signalés à être converti en ICMS avec quelques autres facteurs de transcription 10,12,19,26. Notre protocole se concentre ici uniquement sur des fibroblastes cardiaques. L'application de ce protocole à d'autres types de fibroblastes peut encore être optimisé en raison des variations inhérentes de signatures de fibroblastes telles que le statut de la prolifération, génétique et monuments épigénétiques.

Thqualité des rétrovirus pour la transduction de e est de la plus haute importance. Virus faible titre ne parviennent pas à convertir les fibroblastes dans le SGCI. Tandis que les virus à quantité excessive entraînera cytotoxicité qui mène directement à la mort cellulaire des fibroblastes. Il est nécessaire de déterminer le titre viral et d'optimiser la dose virale de reprogrammation sur la base laboratoire set-up et les conditions expérimentales. La méthode de titration virale a été décrit à fond avant le 23. En fait, nous avons constaté que l'état des cellules Plat-E est directement liée à la croissance virale qualité. Il est recommandé de décongeler les cellules Plat-E au passage inférieur (<30) à chaque fois. Les cellules obtenues à passage trois sont les meilleurs pour le virus de l'emballage à une densité environ 4-5 x 10 6 cellules par boîte de 10 cm de la culture. En outre, les virus fraîchement récoltées donnent une plus grande efficacité de reprogrammation que les virus gelés. S'il vous plaît noter que la co-infection du virus de la MGT avec un autre pMxs vecteur basé rétrovirus va diminuer la possib de l'efficacité de reprogrammationment en raison de la concurrence entre les deux virus du même type. Deux méthodes de transfection différents sont fournis ici. Les deux méthodes produisent des rétrovirus comparables. Alors que Lipofectamine commerciale est coûteux, mais stable, la transfection au phosphate de calcium est moins cher. Préparation du tampon HBS a besoin de prendre beaucoup de prudence parce que le pH de tampon HBS affecte de manière significative l'efficacité de la transfection.

Il ya quelques limitations de ce protocole qui doivent être abordées. Une des limitations réside dans l'utilisation de retrovirus, ce qui rend inévitablement à des problèmes de biosécurité. L'hétérogénéité des fibroblastes et le manque de marqueur spécifique des fibroblastes cardiaques pour l'isolement affectent également la pureté des cellules qui sont reprogrammables. Variation de l'efficacité de reprogrammation peut être observée en raison de la variabilité du lot inhérente à la condition des fibroblastes et la production de virus. En outre, bien que les cellules reprogrammées sarcomères expriment la structure des protéines telles que la troponine T cardiaqueet αActinin, ils ne sont pas encore matures cardiomyocytes caractérisés par des propriétés fonctionnelles telles que la contractilité et la propagation électrique.

En résumé, la méthodologie décrite ici permet la génération efficace de ICMS basées sur la livraison rétroviral de facteurs de transcription M, G, T en une seule construction. Notre protocole fournit une plate-forme reproductible et précieux pour la recherche iCM, et facilitera les efforts en cours sur le criblage à haut débit et des études mécanistes de l'ICM reprogrammation, et finalement déplacer champ de reprogrammation iCM plus près à des applications cliniques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

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References

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