Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

1Civil, Architectural, and Environmental Engineering, Drexel University, 2Chemical and Biomolecular Engineering, University of Pennsylvania
Published 12/25/2015
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Bioengineering

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Summary

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Price, J. R., Shieh, W. K., Sales, C. M. A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities. J. Vis. Exp. (106), e53443, doi:10.3791/53443 (2015).

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Abstract

Introduction

Les eaux usées municipales est généralement traitée avec des procédés à boues activées afin de réduire les matières en suspension (MES), la demande biologique en oxygène (DBO), de l'azote organique et inorganique, et la teneur en phosphore de 5,6. Le procédé de boues activées, un moyen de traitement secondaire des eaux usées, entraîne l'oxydation du carbone organique dans un bassin d'aération rempli d'une liqueur mixte des eaux usées entrant et micro-organisme hétérotrophe recyclé (communément appelé boues activées) 5-7. La liqueur mixte entre alors dans une relativement grande clarificateur (de bassin de décantation) où la boue se dépose pour la collecte plus facile, soit être éliminés ou recyclés dans le bassin d'aération, tandis que le, les eaux usées traitées clarifié peut continuer à un traitement tertiaire ou la désinfection avant d'être libéré en eaux réceptrices 5-7. La séparation efficace des eaux usées traitées et des solides (boues) dans le décanteur secondaire est essentiel pour le bon fonctionnement d'un étéSystème de traitement des tewater, tout comme la boue activée en continuant au-delà des clarificateurs augmentera la DBO et SS dans l'effluent 5-8.

Un certain nombre de processus biologiques alternatives existent pour le traitement secondaire des eaux usées, qui réduisent ou éliminent la nécessité pour les grands réservoirs de clarification, y compris la croissance jointe (biofilm) réacteurs, bioréacteurs à membranes (MBR) de, et les réacteurs de boues granulaires. Dans les réacteurs à film biologique, la formation de biofilms, dans lequel les micro-organismes naturellement ensemble et fixer comme une couche sur une surface solide, permet la rétention et l'accumulation de la biomasse sans la nécessité d'une cuve de clarification. Biofilm réacteurs peuvent être classés en trois types: les réacteurs à lit garni, réacteurs à lit fluidisé, et contacteurs biologiques rotatifs. Des réacteurs à lit paniers, comme un filtres bactériens et des tours biologiques, utilisent une surface de croissance solide fixe 5,6. Les réacteurs à lit fluidisé (FBR) dépendent de la fixation de micro-organismes à des particules,tel que du sable, du charbon actif granulaire (GAC), ou des billes de verre, qui sont maintenus en suspension par un courant ascendant de vitesse élevé 9,10. Rotation des réacteurs biologiques dépendent de biofilms formés sur des supports fixés à un arbre rotatif permettant le biofilm pour être alternativement exposées à l'air et le liquide à traiter de 5,6. MBR membrane utilisent des unités de filtration, soit dans le bioréacteur (configuration immergée) ou en externe via recirculation (configuration courant latéral) 5,11. Les membranes servent à obtenir une bonne séparation de la biomasse et de particules solides à partir du liquide traité 11,12. Réacteurs de boue granulaire sont des réacteurs à flux ascendant dans lequel la formation de granules extrêmement dense et bien-décantation de micro-organismes se produit quand ils sont exposés à courant ascendant d'air superficielle des vitesses élevées 13.

Dans une autre variante au procédé à boues activées, un système de réacteur à courant ascendant roman, maintenant appelé un bioréacteur à haute densité (HDBR), était designed et construit par des ventes et Shieh (2006) pour étudier la DCO par boues activées à partir de flux de déchets synthétiques dans des conditions de faible F / M qui sont connus pour provoquer la formation de mauvaise boues de décantation (c.-à-gonflement des boues) 1,7,14. Le système de HDBR utilisée à jour réacteurs à lit fluidisé qui se composent typiquement d'un réacteur ascendant et un réservoir de recyclage externe. Réacteurs à lit fluidisé sont généralement utilisés avec des débits de flux de recyclage suffisamment élevées pour maintenir le substrat de croissance du biofilm en suspension mais suffisamment basse de sorte que le substrat recouvert d'un biofilm est conservée. Contrairement réacteurs à lit fluidisé, l'HDBR décrit dans les ventes et Shieh (2006) a utilisé des débits des cours d'eau de recyclage relativement faibles qui, avec l'aération externe, ont empêché la rupture de la zone de biomasse formée dans le réacteur 1. Des études ultérieures ont démontré la capacité de cette conception du réacteur pour traiter avec succès une gamme de flux d'azote à l'aide de nitrification / dénitrification bactéries 3,4. Dans tous les studies la formation d'une zone dense de la biomasse stable dans la HDBR a éliminé la nécessité d'un processus / d'une sédimentation de floculation externe 1-4.

Comme nous rapportons ici, l'utilisation de la HDBR de cultiver des cultures denses a également été testé dans un photobioréacteur (PBR) pour la configuration de la culture d'algues. Nous discutons les avantages et les inconvénients de ce nouveau système de réacteur pour la culture d'algues et de son potentiel pour surmonter un grand obstacle à la commercialisation de biocarburants d'algues associés à la récolte de biomasse savoir, une bonne séparation solide-liquide 15,16). Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires à l'assemblage, au démarrage, à partir de l'échantillon, et de maintenir un HDBR avec des algues que la communauté microbienne d'intérêt. Variations dans le démarrage et le fonctionnement protocole de cultures hétérotrophes et nitrification / dénitrification seront également mentionnés. Enfin, les avantages, les inconvénients, générales et inconnues de cette nouvelle conception de réacteur seront mis en évidence.

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Protocol

1. Assemblée Réacteur

  1. Disposer les composants du réacteur selon le schéma de la figure 1.
    1. Placez le réacteur (R) sur une plaque de mélange, ajouter une barre d'agitation dans le réacteur. Placez le réservoir de recyclage (RT) à côté de la plaque d'agitation et le réacteur de telle sorte que l'orifice d'effluent (en haut) du réservoir est dirigée vers le bord de la table de laboratoire.
    2. Placer le récipient de déchets (W) au-dessous de l'orifice d'effluent (en haut) de la cuve de recyclage (RT). Placez le réservoir d'alimentation (FT) à côté du réservoir de recyclage (RT).
      Remarque: Le réservoir d'alimentation a une capacité totale de 5 L.
  2. Fixez le réacteur (R) contre le basculement avec un stand et le collier de taille appropriée. De même, fixer le réservoir de recyclage (RT) pour empêcher le mouvement.
  3. Insérez néoprène tubes de pompe péristaltique dans le recyclage (Pompe A) et nourrir têtes (Pompe B) de la pompe. Reportez-vous à la table des matières pour les spécifications de tubes supplémentaires. Installez les têtes de pompe sur les entraînements de pompe avec les vis dispoded avec les entraînements de pompe.
  4. Connectez le tuyau de la pompe A aux ports sur le réacteur et le réservoir de recyclage. Insérez l'extrémité de la tubulure de la pompe B dans le réservoir d'alimentation et le réservoir de recyclage. Connectez le port du réacteur haut vers le réservoir de recyclage avec des tubes. Appliquer brides à la tubulure au niveau des ports du réacteur.
    Remarque: les communautés photosynthétiques peuvent bénéficier de l'éclairage artificiel fourni par des lampes.

2. Préparation des solutions mères, Solutions Influent / d'alimentation, et les algues Inoculant

  1. Préparer la solution minérale de stock. Ajouter ce qui suit à un 1 L fiole jaugée de 500 ml d'eau déminéralisée: 200 g de bicarbonate de sodium, 40 g de phosphate monobasique de potassium, le sulfate de magnésium 4 g, 4 g de chlorure ferrique, 4 g de chlorure de calcium, 1 g de chlorure de cuivre, 1 g de cobalt chlorure hexahydraté, 1 g de chlorure de nickel hexahydraté, 1 g de sulfate de zinc heptahydraté. Ajouter un 400 ml supplémentaires d'eau déminéralisée. Agiter vigoureusement pour encourager la dissolution de sels. Diss suivantsolution de sels, ajouter de l'eau désionisée pour porter le volume total de solution à 1 L.
  2. Préparer la solution d'ammoniac stock. Dans une fiole jaugée de 1 litre, dissoudre 38.214 grammes de chlorure d'ammonium dans environ 900 ml d'eau désionisée. Après dissolution, ajouter de l'eau désionisée pour porter le volume total à 1000 ml.
    Note: 1 ml de solution d'achat d'actions dilué à 1 L donne un 10 mg L -1 NH 4 + -N solution.
  3. Préparer la solution de nitrate de stock. Dans une fiole jaugée de 1 litre, on dissout 72,413 g de nitrate de potassium dans environ 900 ml d'eau désionisée. Après dissolution, ajouter de l'eau désionisée pour porter le volume total à 1000 ml.
    Note: 1 ml de solution d'achat d'actions dilué à 1 L donne un 10 mg L -1 NO 3 - -N solution.
  4. Préparer la solution d'alimentation / affluent. Pour faire une solution d'alimentation contenant 20 mg L -1 NH 4 + -N et 20 mg L -1 NO 3 - -N, diluer 2 ml d'unemmonia solution de stock et 2 ml de solution de nitrate d'achat d'actions à 1 L volume total. Avant la dilution, ajouter 0,5 ml de solution minérale / L de solution réalisés. Préparer 5 litres d'affluent au total pour démarrer le réacteur.
  5. Préparer l'inoculant des algues.
    1. Recueillir un grand volume (au moins 10 L) d'eau à partir d'un corps de l'eau contenant des algues comme un ruisseau ou un étang. Laisser les algues à régler en laissant les échantillons d'eau au repos pendant 24 heures.
    2. Décanter et jeter le (non-algues contenant) l'eau claire au sommet des échantillons, laissant une suspension d'algues concentrée dans les bouteilles d'échantillon. Combinez la suspension d'algues de tous les échantillons dans un récipient et répéter la décantation et étapes de décantation.
    3. Mesurer la biomasse au sein de l'échantillon concentré.
      1. Séchez un filtre à vide de papier (filtre à vide de 0,45 um MCE) et d'aluminium peser bateau O / N dans un four qui a été réglé à 103 ° C Après refroidissement dans un dessiccateur pendant 30 min à température ambiante mesurer la combined masse du filtre et peser bateau.
      2. On filtre sous vide de 20 ml de concentré suspension d'algues et retourner le filtre et peser bateau au four pour sécher O / N.
      3. Mesurer la masse combinée du filtre et peser bateau. Calculer la densité de la biomasse à l'intérieur de l'échantillon concentré.
        Remarque: Le volume total d'échantillon d'eau que les enquêteurs devront recueillir dépendra de la masse d'eau de la source.

3. L'ensemencement et démarrage du réacteur

  1. Ajouter 750 ml de solution d'alimentation dans le réacteur. Remplir le réservoir de recyclage avec 500 ml de solution d'alimentation.
  2. Utiliser une pipette pour ajouter longue doucement inoculer une suspension contenant 1,5 g d'algues près du fond du réacteur. Laisser l'inoculum se déposer au fond du réacteur, assurer ce par observation visuelle, avant de passer à l'étape suivante.
  3. Une fois que les cellules se sont installés, retirez les colliers de serrage et tourner sur la pompe A à un débit lent (10 revolutions min -1/38 ml min -1). L'air emprisonné dans le tube sera expulsé dans le réacteur.
    Remarque: L'addition de 750 ml dans le réacteur permet d'éviter toute biomasse perturbé par la pompe à partir de la sortie du réacteur. Presser le tube pour assurer que tout l'air a été expulsé.
  4. Ajouter graduellement la solution d'alimentation vers le réservoir de recyclage en tant que la solution est pompée dans le réacteur. Continuer l'addition jusqu'à ce que à la fois le réacteur et le réservoir de recyclage sont à pleine capacité et commence effluents pour sortir de la cuve de recyclage via le port haut.
    Remarque: Le volume de la solution d'alimentation pour être ajouté à la cuve de recyclage varie avec le volume de l'inoculum ajouté dans le réacteur.
  5. Verser la solution d'alimentation restant dans le réservoir d'alimentation.
  6. Régler la pompe de recyclage (Pompe A) à 19 tours min -1, établissant un débit de recyclage de 72,5 ml min -1. Observer les algues grenier commencent à partir du fond du réacteur. En utilisant les graduations sur le réacteur, déterminer le bi d'alguesomass hauteur de la zone. Assurez-vous que la hauteur est constante avant de passer à l'étape suivante.
  7. Tournez sur la plaque de mélange à très basse vitesse; une valeur de 1 ou 2 est approprié de commencer. La barre de mélange aidera à lofting biomasse plus loin, mais mélange agressif provoquer des algues de quitter le réacteur, entrer dans le réservoir de recyclage, et laisser dans l'effluent. Réglez la vitesse de mélange à un réglage nécessaire d'établir une limite d'algues clairement l'intérieur du réacteur (figure 2A); la zone de biomasse d'algues doit être d'environ 10 à 15 cm de hauteur.
  8. Démarrer la pompe d'alimentation après avoir observé une frontière claire entre la prise d'algues et le fluide du réacteur. Régler la pompe à 25 tours min -1, en ​​établissant un débit de 1,5 ml min -1. Observer la sortie de fluide de l'orifice réacteur effluent due à la gravité et du déplacement provoqué par le courant d'arrivée entrant.

4. Collecte et analyse des échantillons

  1. Mener des activités de collecte de l'échantillon priou pour de la maintenance du système de réacteur. Recueillir 20 ml d'échantillons d'effluents et influents quotidienne. Prélever des échantillons d'effluents de l'intérieur du réservoir de recyclage. Prélever des échantillons de l'influent directement à partir du réservoir d'alimentation.
  2. Des échantillons de filtre sous vide pour éliminer les solides avant le stockage et l'analyse suspendus.
  3. Stocker l'affluent et les échantillons d'effluents à -20 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie. Limiter le nombre de cycles de gel-dégel échantillons sont soumis. Si nécessaire, des échantillons peuvent être divisés en aliquotes pour maintenir l'intégrité de l'échantillon.
  4. Procéder à une analyse de l'échantillon de nitrate, nitrite, l'ammoniac et utilisant des techniques standard 17.
    Remarque: Les auteurs utilisés chromatographie ionique (IC) pour produire les résultats présentés ici. Reportez-vous à la table des matières pour la spécification.

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Representative Results

Le HDBR a été utilisé pour cultiver des algues sur plusieurs rapports de concentrations d'ammoniaque et influent nitrate, tout en maintenant une teneur totale en azote dans la charge à 40 mg -NL -1. Influent et des échantillons d'effluents ont été prélevés quotidiennement; Des échantillons de densité de la biomasse ont été prélevés au début et à la fin de chaque état. Le réacteur a fallu en moyenne 3-5 jours pour atteindre l'état d'équilibre après conditions ont été modifiées. Sur une large gamme de conditions de influents une zone distincte de la biomasse a été établi, comme observé études antérieures (figure 2). La culture des algues dans le HDBR a été trouvé pour éliminer une moyenne de 18,4% des espèces de l'azote total dans l'alimentation (n = 44). Dans la zone de la biomasse, la densité de la biomasse totale et la biomasse algale étaient conformes au cours de cette étude.

L'élimination de NH 4 + et NO 3 - sont tracées contre le NH 4 + et NO 3 - feComposition ed dans la figure 3. Un modèle de régression linéaire simple a été utilisé pour évaluer l'importance des relations entre l'élimination des espèces N et la composition d'alimentation 18-20. L'élimination de l'ammoniac a été observée à toutes les gammes de NH 4 + et NO 3 - composition (figure 3A et la figure 3B, respectivement). Ni NH 4 +, ni NO 3 - composition de l'alimentation affectée l'élimination de NH 4 + sur les conditions testées (n = 44, p = 0,993 et n = 44, p = 0,610 respectivement). D'autre part, l'élimination du NO 3 - a été trouvé à être en corrélation négative avec NH composition 4 + d'alimentation (n = 44, p = 0,000) (figure 3C) et varié positivement avec NO 3 - Composition d'aliments pour animaux (n = 44, p = 0,000) (Figure 3D).

NO 3 - a été observée à accumuler (negatenlèvement ive) dans le réacteur pour la plupart des compositions de l'influent (échantillons 34 sur 44). NO 3 - enlèvement n'a été observée lorsque les concentrations 4 + NH d'alimentation étaient en dessous de 10 mg -NL -1 et NO 3 - concentrations d'alimentation étaient au-dessus de 15 mg -NL -1. L'oxygène, qui est introduit dans le réacteur par l'intermédiaire d'aération dans le réservoir de recyclage externe et par les algues, peut servir d'accepteur d'électrons pour les bactéries et ammoniacaux nitrite oxydant (AOB et NOB, respectivement). Si des conditions aérobies dominent dans le réacteur par des débits élevés de recyclage, les bactéries qui peuvent mener dissimilatoire (hétérotrophes) dénitrification préfèrent utiliser l'oxygène comme accepteur d'électrons 4. Si le taux de NO 3 - la production et l'entrée de l'alimentation dépasse la conversion d'assimilation de NO 3 - à l'azote organique ou dénitrification dissimilatoire, NO 3 - peut accumulate dans le réacteur. L'élimination de NH 4 + et de l'accumulation de NO 3 - suggère que AOB et NOB sont présents et actifs au sein de la communauté que les algues ne sont pas connues pour catalyser la conversion de NH 4 + NO 3 -. Ces résultats démontrent la capacité d'utiliser ce système de réacteur pour étudier la dynamique des flux d'azote et de la cinétique dans une communauté d'algues-bactérienne mixte.

Les auteurs ont réussi à maintenir les communautés d'algues saines dans ces HDBRs plus d'un an. Deux accidents de réacteurs, cependant, ont eu lieu depuis le début de ce projet, à la fois comme le résultat de changements sévères à la composition de l'affluent. Le premier était le résultat d'un changement de rapports d'espèces d'azote avec le flux d'azote total étant maintenue constante; NH 4 + a été éliminé de la charge d'alimentation et NO 3 - concentrations ont été augmentée pour compenser. Le deuxième accident est survenu à la suite de cutting le flux d'azote total de 75 pour cent, à partir de 40 mg -NL -1 à 10 mg -NL -1 (figure 4). Dans les deux cas, la limite de la zone de la biomasse distincte a été observée à se détériorer au cours des deux à trois jours coïncidant avec une forte augmentation des matières en suspension dans l'effluent (figure 4). Les effluents solides en suspension augmentée jusqu'à un maximum de 6 jours après le changement d'alimentation que le réacteur perdu biomasse (figure 4). Après le crash de solides en suspension dans l'effluent est resté élevé (environ 0,22 g SS L -1) et aucune nouvelle de la biomasse a été observée à accumuler l'intérieur du réacteur, empêchant la poursuite de l'expérience. La conception actuelle manque d'un mécanisme de sécurité pour retenir les cultures si elles ne restent pas bien floculés.

Figure 1
Figure 1. Schéma d'un bioréacteur à haute densité (HDBR) (non to échelle). Le réacteur (R) se compose d'un 1000 ml graduée avec des ports (de cannelés, diamètre extérieur de 3/8 ") installés dans les 100 ml et 1000 ml niveaux. fluide du réacteur est recyclé dans le réacteur en utilisant une pompe péristaltique A (PA), en entrant au bas du réacteur et circulant vers le haut à travers la zone de la biomasse (BZ) vers l'orifice supérieur. sorties de fluide dans le réacteur à l'orifice supérieur et est dirigé vers le réservoir de recyclage (RT) par gravité. La RT est composé d'un bêcher de 600 ml en verre;. Il dispose de deux ports installé, l'un situé au fond du bécher et l'autre au fluide 500 ml marque du réacteur est renvoyé dans le réacteur par l'orifice de fond (et PA) feuilles effluents. le réacteur par l'orifice supérieur de la RT et est recueillie dans un conteneur de déchets (W). aération par diffusion est prévue dans la RT avec l'utilisation d'un aérateur (A). Le processus d'aération entraîne également le mélange à l'intérieur de la MV. Pompe péristaltique B (PB) délivre influent partir d'un réservoir d'alimentation contenant / influent (FT) dans la RT.

Figure 2
Figure 2. Des exemples de séparation de la biomasse liquide / de réacteur à l'intérieur d'un bioréacteur à haute densité (HDBR). Le panneau A montre une communauté d'algues à haute densité (2,83 g SS L -1) étant cultivée dans un HDBR. Une limite distincte se produit lorsque la vitesse de sédimentation de la communauté microbienne photosynthétique est supérieure à celle du fluide du réacteur. Groupe B affiche la matrice microbienne formé par boues activées dans les conditions de recyclage discutés dans les ventes et Shieh (2006) 1. Le panneau C montre levure cultivée sur un affluent composé de glucose pour la production d'éthanol par fermentation (résultats non publiés). Dans chacun de ces trois configurations de réacteur la nouvelle conception du réacteur a éliminaed la nécessité d'une clarification séparé ou processus de décantation dans le système de réacteur. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
. Figure 3 Illustration de NH 4 + et NO 3 -. Taux d'enlèvement par rapport à la composition de l'affluent totale concentration influente de N a été maintenue à 40 mg -NL -1 sur la durée de l'étude. (A) NH 4 + concentration d'alimentation est tracée contre la suppression de NH 4 +; il n'y avait pas d'effet significatif (n = 44, p = 0,993). (B) NO 3 - concentration d'alimentation est tracée contre la suppression de NH 4 +; il n'y avait pas d'effet significatif (n = 44, p = 0,610).(C) NO 3 - l'enlèvement a été jugée significativement et négativement liés à NH 4 + concentrations d'alimentation (n = 44, p = 0,000). (D) NO 3 - l'enlèvement a été significativement et positivement liée à NO 3 -. Concentrations d'alimentation (n = 44, p = 0,000). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L'augmentation des solides en suspension dans l'effluent de réaction diminuant de manière significative le flux d'azote à travers le réacteur. Influent teneur en azote a été diminué de 40 mg à -1 -NL . 10 -NL mg -1 (au temps 0 dans cette figure, également désigné par la ligne verticale) Détérioration de la zone de la biomasse distincte a été observée après 2 jours; après 3 jours perte de biomasse était facilement observable. Une augmentation significative de la SS effluents a été observée après jours après le changement a été promulguée et SS maximale effluents a eu lieu après 6 jours. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. micrographs soulignant structure de floc poreux et de verrouillage des bactéries filamenteuses. Deux micrographies présentant la structure poreuse formée par les bactéries hétérotrophes (boues activées). Bactéries filamenteuses combler l'espace entre les flocs, verrouillage flocs pour la zone de la biomasse stabilisée.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53443/53443fig5large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Cette section commence par une discussion des variations de protocole nécessaires pour régler des problèmes opérationnels possibles ainsi que l'aide de différentes communautés microbiennes. Les points forts de ce modèle de réacteur seront discutés, y compris la capacité de gouverner le contrôle des flux d'oxygène et la formation de flocs de haute densité dans le réacteur. Les défis actuels et les possibilités d'investigation seront également mentionnés.

Nuances de protocole et variations
Le fonctionnement de HDBRs pour la culture de différents types de cultures nécessite de légers changements de protocole opérationnel, selon les espèces visées par l'enquête. Un mélange suffisant et l'expansion de la zone de la biomasse algale est nécessaire d'augmenter l'exposition de tous les flocs à la lumière et permettre la photosynthèse. Suspension de la biomasse algale l'intérieur du réacteur est entraîné par une combinaison du taux de recyclage du réacteur de mélange et la vitesse à barres. Il faut prendre soin dans le choix des caractéristiques de fonctionnementà la fois, de sorte que il y a une distance suffisante entre la zone d'algues de la biomasse biologiquement active et l'orifice dans la partie supérieure du réacteur, comme toute la biomasse qui quitte la cuve de réacteur peut être perdu dans l'effluent à travers l'orifice supérieur du réservoir de recyclage. Si la biomasse est observé dans l'effluent sortant, un filtre peut être monté sur l'orifice partie supérieure du réservoir de recyclage. Un tampon de laine de verre peut être utilisé comme un filtre. Comme le filtre accumule la biomasse, il devra être changé. Si on utilise un filtre, des échantillons de solides en suspension doivent être prélevés en aval du filtre, en plus du liquide de réacteur à l'intérieur de la cuve de recyclage afin d'obtenir le bilan de masse correct; biomasse accumulée dans le filtre doit également être pris en compte. Dans certaines conditions d'exploitation avec les algues et les levures de la zone de la biomasse ne conduit pas toujours à liquide clarifié, même lorsque la communauté est en bonne santé. Dans ces cas, il existe une suspension diluée de cellules visibles au-dessus de la zone de la biomasse et l'intérieur du réservoir de recyclage. Nous hypothesize que dans les communautés d'algues et de levure qui ont été cultivées dans le HDBR jusqu'ici ne contient pas les bactéries filamenteuses à la zone de la biomasse stable, verrouillage comme vu dans hétérotrophe et la nitrification / cultures bactériennes de dénitrification (Figure 5). Par conséquent, si le but est d'empêcher les cellules de se échapper dans l'effluent, par exemple comme dans le cas d'algues et de la levure, il peut être nécessaire d'utiliser un dispositif de filtration à membrane ou à l'orifice d'effluent.

Une source inattendue de la biomasse perturbation, ce qui pourrait nuire à la séparation solide-liquide de l'HDBR, est l'accumulation de bulles dans les lignes de la pompe de recyclage. Ces bulles sont un produit de l'aération dans le réservoir de recyclage. Il faut prendre soin de purger régulièrement toute accumulation de gaz à l'intérieur de la tubulure. Le serrage du tube dans la direction d'écoulement du fluide va accélérer ce processus et sert également pour déloger toute la biomasse qui est devenu fixe à l'intérieur du tube. Comme les cellules de ces cultures ont tendance à se regrouper en flocs, ils ont aussi tendance lorsqu'il est libéré à partir de la zone de biomasse à adhérer et à coloniser les parois de la HDBR. Ainsi, si les enquêteurs remarquent l'adhésion de la biomasse pour les murs à l'intérieur du réacteur et recyclage réservoir, ils doivent utiliser une pipette ou une brosse de la verrerie aseptisé de perturber et de prévenir la croissance excessive du biofilm sur les parois du réacteur.

Le protocole décrit ci-dessus doit être modifiée quand les micro-organismes hétérotrophes ou nitrification / dénitrification sont les bactéries communauté d'intérêts. Par exemple, on a utilisé 4 g de micro-organismes hétérotrophes (mesurée comme VSS) pour ensemencer le réacteur, tel que décrit par la vente et une Shieh. Lors de l'étude de l'ammoniac et de bactéries oxydant le nitrite, a été utilisé 2 g de enrichi AOB / NOB comme décrit dans Nootong et Shieh 2 et Ramanathan et al. 4, et élargi à l'annexe de ce manuscrit 21. Le montant exact de l'inoculumpour démarrer le réacteur peut varier et dépend de la véritable quantité de source d'inoculum disponible et le volume réel du réacteur utilisé. Pour éviter la perturbation de la biomasse, l'utilisation d'une barre d'agitation est déconseillée lors de l'utilisation de ces cultures de formation de mat.

La manipulation des caractéristiques hydrauliques
Un avantage principal de la conception de HDBR est la capacité de contrôler les taux indépendamment les uns des aliments pour animaux et d'écoulement de recyclage. Les enquêteurs peuvent cibler des taux de chargement spécifiques, recycler taux ou taux de recyclage. Par exemple, tout en étudiant la performance du réacteur en utilisant des boues pour éliminer la DCO des eaux usées synthétiques activé, le taux de recyclage varie de 3,5 à 21,5 1. Les premières études du réacteur utilisant nitrification autotrophe / bactéries dénitrifiantes ont indiqué que les zones de la biomasse stables pourraient être maintenues dans des ratios de 2,5 à 24,3 3 de recyclage. Ces estimations se sont révélées être prudente, car aucun problème n'a été rencontré lors de l'augmentation recyclage ratios jusqu'à 43 dans une étude de suivi à 21. La capacité de fonctionner à des taux de recyclage élevés, et donc des taux de recyclage élevés, est utile pour étudier les effets de cisaillement de fluide sur la stabilité et les caractéristiques de la zone de biomasse. Dans certains cas, tels que la culture d'algues, l'établissement et le maintien d'une matrice de la biomasse ne sont pas une exigence et taux de recyclage élevés et les ratios sont nécessaires pour aider à la suspension de la colonne d'algues. Cette conception du réacteur est en mesure de faciliter la suspension assistée par des taux de recyclage élevés (49,3 dans cette étude), à ​​condition que les enquêteurs sont en mesure de maintenir une interface biomasse / des effluents distincte au sein du réacteur. Dans les cas où le taux de recyclage est élevé, les caractéristiques hydrauliques du réacteur du système de HDBR ensemble se comportent plus de manière similaire à complètement réacteurs mixtes (CMFR) que un réacteur à écoulement piston (PFR), et permet ainsi à l'enquêteur d'examiner les cultures sur un spectre d'hydraulique caractéristiques de mixage dans un seul système Le recyclage débit unLSO joue un rôle dans le flux, le transfert de masse et la distribution des espèces gazeuses dissoutes dans tout le réacteur, tel que décrit ci-dessous.

Le contrôle de flux à partir de O 2 et de dégazage dans le réservoir de recyclage
Bien que l'étude des processus combinés de nitrification / dénitrification, concentrations d'oxygène dissous ont été observés à être rapidement appauvri dans les parties les plus basses de la zone de la biomasse active nitrification a été menée 2-4, parallèlement à des études antérieures de la DCO 1; Ceci peut suggérer que le régime d'écoulement dans l'écoulement de la biomasse ressemble à celle d'un PFR 1. Avec la zone supérieure de la biomasse devenir anoxique de dénitrification a été effectuée, ce qui entraîne l'élimination de l'azote dissous à partir de l'effluent de réacteur 2,3. Ces observations ont démontré que la combinaison d'aération extérieure dans le réservoir de recyclage, combinée avec la capacité de contrôler le flux d'oxygène dans la cuve à courant ascendant, par l'intermédiaire de la manipulation de recyclagetaux, permet de gradients d'oxygène se développer au sein des flocs et le long de la longueur de la zone de la biomasse, ce qui permet aérobies, anaérobies et anoxiques réactions de se produire dans un seul réservoir. Comme pour de nombreuses réactions dépendent de traitement biologique ou sont inhibées par l'oxygène, ce réacteur permet un moyen plus facile de contrôler les taux d'oxygène dans les bioréacteurs de masse; permettant éventuellement pratiques d'aération plus efficaces. Comme l'aération est l'un des coûts les plus élevés de l'énergie dans le traitement des eaux usées, ce qui peut servir à réduire les coûts d'exploitation pour les municipalités 22,23.

Le contrôle de flux d'oxygène à travers un réacteur est non seulement une préoccupation pour les bactéries hétérotrophes et chimiotrophes. L'énergie excédentaire d'excitation (EEE) est le algues d'énergie lumineuse excédentaire cellules sont exposées à, et les résultats de l'oxygène (O 2) étant réduit à superoxyde (O 2 -) avec un excès d'électrons détourné des photosystème I ou II (PSI et PSII) 24. Anions superoxydes peuvent causer significant dommages physiologiques dans les systèmes d'algues. Un cadre existe cellulaire pour détecter et neutraliser O 2 - avant que des dommages peut se produire à des composants cellulaires, mais dans les cellules fortement sollicitées espèces réactives de l'oxygène (ROS) peut encore former 24-28. En contrôlant le taux de recyclage et de l'aération dans le réservoir de recyclage, les enquêteurs peuvent être en mesure de régler les problèmes découlant de l'excès d'oxygène et la toxicité il peut induire dans les cultures d'algues, et peuvent en outre améliorer la croissance des algues dans des cultures très denses, en particulier dans les cas où la lumière supplémentaire est assurée par l'utilisation de lampes.

Formation des flocs et / ou zone de biomasse conduit à macro- diversifiée et micro-environnements
Une des caractéristiques les plus uniques de cette conception du réacteur est l'élimination d'un bassin de clarification. Nous émettons l'hypothèse que la bonne séparation solide-liquide qui est atteint dans HDBRs peut être attribuée soit à la formation de flocs très denses savoir, lacas avec les algues), ou la formation d'une matrice poreuse de verrouillage stable de flocs et des microorganismes filamenteux long (à savoir, avec le hétérotrophe et nitrification / dénitrification cultures) 1-4,7,16 (Figure 5). La formation et la stabilité des flocs est tributaire d'un certain nombre de caractéristiques physiques, chimiques et biologiques 7,13,29-31 facteurs. En fait, la formation de flocs est l'objectif principal de start-up et dépend de mélange suffisant (des gradients de force de cisaillement) pour augmenter les collisions entre l'inoculant 13,30 suspendu, mais aussi de la présence de micro-organismes bien floculants qui produisent des composés (floculants ) qui permettent aux cellules de se rassemblent 31,32. Dans ces réacteurs à l'échelle du laboratoire, on a trouvé que pour un mélange suffisant floculation peut être réalisée soit par le profil de vitesse de l'écoulement ascendant ou un dispositif de mélange, tel qu'une barre d'agitation, situé au fond du réacteur. Pour les cultures qui ont besoin d'oxygène, le réservoir de recyclage externe peut be utilisé comme réservoir de transfert de gaz externe (que ce soit pour l'aération ou d'extraction des gaz, par exemple pour éliminer l'oxygène produit par les réactions de photosynthèse). L'avantage d'aération externe est-il empêche l'excès de mélange ainsi que les bulles d'air entrant en contact avec des flocs et de les briser. Dans certains cas, avec les cultures hétérotrophes et nitrification / dénitrification qui se sont formées, une matrice poreuse stable, lorsque les bulles de gaz ont été trouvés pour entrer dans le réacteur, ils pourraient être trouvées briser parties de la matrice ou deviennent entraînées à l'intérieur de sections de la matrice en les faisant flotter à la partie supérieure du réacteur. Par conséquent, le fonctionnement de la cuve de transfert de gaz externe pour empêcher les bulles entrant dans le réacteur via la conduite de recyclage est essentielle pour maintenir une bonne séparation solide-liquide du système.

Directions HDBR potentiels
Études de réacteur de paillasse, en particulier ceux qui sont axés sur les droits des phytogénéticiens, sont souvent axées vers la collecte de données cinétiques pour un micro particulierBial espèces ou communauté 1,3,4,33,34. Historiquement de nombreuses études sont faites sur les cultures d'algues traitées axéniques ou antibactériens en dépit des preuves croissantes de l'importance de interspécifiques interactions entre les algues et les communautés bactériennes 35,36. Les études de cultures mixtes promettent de donner des conclusions nouvelles et pertinentes sur la façon dont ces relations interspécifiques travaillent 35-38. Des études récentes de cultures mixtes a été élargi pour inclure l'analyse des échantillons avec des outils de biologie moléculaire telles que quantitative réaction en chaîne de la polymérase (qPCR) pour quantifier les algues et la croissance bactérienne taux 33,34. Analyse métagénomique et metatranscriptomic a été utilisé pour élucider plus d'informations sur la façon dont algues et les bactéries interagissent dans les écosystèmes naturels et d'ingénierie 39,40. En plus des études moléculaires des cultures microbiennes dans HDBRs, des études de microscopie examen de la taille, la structure et l'organisation des flocs et la matrice poreuse de la biologiquezone de biomasse fournira des informations précieuses sur la capacité HDBRs à promouvoir la bonne séparation solide-liquide.

Jusqu'à présent, seul un petit nombre de volumes de réacteur et rapports de recyclage ont été étudiés en utilisant la conception de HDBR. En tant que tel, le rendement du réacteur dans des applications mises à l'échelle en place est actuellement inconnue. Chacun des systèmes de réacteurs testés sont moins de 2 L en volume et composé de verre. Comme ces réacteurs ne sont pas hors les composants du plateau et doivent être construits par un spécialiste de laboratoire en verre augmente la taille des réacteurs en verre peut être difficile, car les pièces de départ doivent être choisis avec soin pour une épaisseur appropriée de la paroi (correspondance privée: K. Carraro, 2014). Grand verrerie gère également un risque plus élevé d'être cassé ou endommagé par rapport à un métal, en plastique ou en béton réacteur. Construire des réacteurs plus grands avec métal ou en plastique pour des expériences de paillasse peut être une option, mais la viabilité de cette option n'a pas encore été étudié. En outre til utilise des matériaux opaques ou translucides peuvent entraver l'observation visuelle des réacteurs visés par l'enquête et ne ferait que compliquer le fonctionnement de ces réacteurs dans une configuration de PBR.

Ce manuscrit a souligné l'Assemblée, démarrage, et des procédures opérationnelles pour faire fonctionner un bioréacteur haute densité (HDBR). Des travaux antérieurs ont établi HDBRs capacité à supprimer à la fois la DCO et les espèces d'azote à l'aide de bactéries hétérotrophes et chimiotrophes 1-4. Ici, les auteurs démontrent la capacité des HDBRs pour la culture des communautés d'algues de haute densité et de la suppression des espèces de l'azote d'un flux de déchets synthétiques. Suite aux observations précédentes, une zone de la biomasse stable a été formée par les algues, et de bon fonctionnement du réacteur sans un processus clarification a été atteint tout en retirant les 18,4% du total d'espèces d'azote provenant de l'affluent. La conversion entre les espèces d'azote (NH 4 NO 3 + à -) a été observée, ce qui permetles auteurs suggèrent la présence et l'activité des AOB et NOB. Les résultats présentés dans ce manuscrit de la manifestation en cours avec des algues et des études antérieures utilisant le support du système utilisation ultérieure HDBR, ainsi que la recherche et le développement, de cette conception du réacteur pour la culture à haute densité de micro-organismes pour une variété d'applications environnementales et industrielles.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aeration stone Alita AS-3015C
Aerator Top Fin Air-1000
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434
Anion analysis column Shodex IC SI-52 4E
Beaker (600 ml) Corning Pyrex 1000-600 Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 ml levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670
Cation analysis column Shodex IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 222011
Ferric chloride Sigma Aldrich 157740
Filter (vacuum) Fisherbrand 09-719-2E 0.45 μm membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1,000 ml) Corning Pyrex 3025-1L Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 ml, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC Shimadzu Prominence
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M2643
Masterflex L/S variable speed drive Masterflex 07553-50 Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate Sigma Aldrich N6136
Potassium nitrate Sigma Aldrich P8291
(Monobasic) Potassium phosphate Sigma Aldrich P5655
Pump head Masterflex 07018-20 Recycle pump head
Pump head Masterflex 07013-20 Feed pump head
Pump tubing Masterflex 6404-18 Recycle pump tubing
Pump tubing Masterflex 6404-13 Feed pump tubing
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z0251

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References

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