כוונון טור מקוטע זרימה מקבילה והפעלת איתור Multiplexed

1School of Science and Health, University of Western Sydney
Published 12/15/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pravadali-Cekic, S., Kocic, D., Hua, S., Jones, A., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection. J. Vis. Exp. (106), e53448, doi:10.3791/53448 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

עמודות זרימת טכנולוגיה פעילה

עמודות כרומטוגרפיה טכנולוגית זרימה פעילה (AFT) פותחו לאחרונה להתגבר חוסר יעילות בהפרדות הקשורים זרימת ההטרוגניות 1-6 וגם כדי לאפשר זיהוי מרובב. בפירוט שתקשורת מסוים זה התהליך התפעולי של המקביל מפולח זרימת טור (PSF) עם זיהוי מרובב. היתרונות הפונקציונליים המפתח של טור כוחות הביטחון הפלסטיניים הם: (1) התזרים מאזור המרכז הרדיאלי של מיטת העמודה מבודד מאזור הפריפריה או קיר של זרימה, (2) הנפח של שלב נייד שחייבים להיות מעובד על ידי זיהוי מקור מצטמצם, וניתן multiplexed מקורות (3) זיהוי להרחיב מידע מדגם ללא הקניית עיכובי זיהוי פני כל תהליך זיהוי, או לאחר מכן מחייבים את הפיצול של זרימת זרם פוסט עמודת 7,8. התכונה המרכזית בעיצוב של עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים, המאפשרת לdvantage של זיהוי מרובב היא ההרכבה הראויה וfrit לשקע רומן. איור 1 הוא תצלום של טור AFT בהשוואה לטור קונבנציונלי. חשוב להבין כי תהליך הפיצול הושג באמצעות זרימה מפולחת עמודות מקבילות הוא לא אותו הדבר כמו פיצול זרימת הודעה טור זרם. בזרימה הודעה טור זרם לפצל את הלהקה כולה מדגם מהמוביל הקצה לגפיים של הזנב נדגם באותה מידה (כלומר, צירי), ובכך, כל תזרים זרם שווה ביחס ליעילות ורגישות; סדר הגודל של הרגישות ובכך הם מחולקים במספר הפיצולים. בכוחות הביטחון הפלסטיניים, לעומת זאת, דגימות תהליך פיצול הלהקה רדיאלית, לא צירי. ככזה, הדגימות המרכזיות נמל שיא השיא - האזור מרוכז ביותר של השיא. לפיכך, הרגישות כאן היא גבוהה ביותר כשיא אינו מדולל על ידי האזור המפוזר עוקב. מדגם משחררי מהנמלים ההיקפיים הוא לא יעיל כמו בCENTRAאזור l, אבל, מאז הלהקה נדגם רדיאלית, ולא צירי, הרוחב של השיא הוא צר יותר יהיה המקרה לתהליך דגימה שחלק השיא בכיוון הצירי, כלומר, פיצול הודעה עמודה. מכאן הרגישות עם גלאים תלויים ריכוז לא מצטמצמת.

בעמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים, ראוי לשקע כולל יציאות יציאה מרובות ועל החלק הפנימי של סוף זה מתאים לשם שוכן frit טבעתי. החלק הפנימי של ערוצי frit טבעתיים זה לזרום החוצה מהטור דרך יציאת השקע המרכזית רדיאלי, ואילו החלק החיצוני של רדיאלי ערוצי frit לשקע לזרום החוצה של העמודה באמצעות הזרימה לשקע יציאות היקפי או קיר אזור. החלקים הפנימיים וחיצוניים של frit לשקע מופרדים על ידי מחסום בלתי חדיר המונע זרימה צולבת בין זרימת האזורים אלה 2. כתוצאה מעיצוב זה זרימת רדיאלי הזרם המרכזי במיטת העמודה מופרד מזרימת תוספות קיר האזורהחביא את הטור. החלק היחסי של זרימה משני אזורים אלה יכול להיות מגוון כמעט לכל יחס רצוי באמצעות ניהול לחץ כדי לייעל את ההיבטים שונים פונקציונליים של טכנולוגית העמודה, כגון יעילות הפרדה או רגישות זיהוי. במהותה, העיצוב הזה ביעילות קובע במסגרת טור הפורמט הגדול עמודה "וירטואלית", שקוטר פנימי צר, ולכן פונקציות טור כעמודת קיר-פחות נכונה, להתגבר על ההטרוגניות מיטת טור וקיר ההשפעות 9,10.

היתרונות העיקריים של כוחות הביטחון הפלסטיניים עמודות שיפורים ביעילות טור, מזעור עיבוד הממס למקור זיהוי (ים) ומאפשר זיהוי מרובב. עם זאת, יתרון נוסף הוא שמאז tailing והאזורים בחזית של כל להקה יוסרו מelution הכולל פרופיל המומס בelution או זיהוי נמצא בריכוז גבוה יותר מאשר היה להיות שנצפה לאותו יםolute הזרקה ועומס ריכוז על עמודה קונבנציונלית, בהתאם ליחס הפילוח המועסק. כתוצאה מכך יש הוא נצפה לעתים קרובות רווח בעוצמת אות להפרדות שנערכו בטורי כוחות הביטחון הפלסטיניים 2. למעשה, אם יחס הפילוח מותאם כך שעל 25% מתזרים יציאות מכל אחת מארבע יציאות היציאה, עוצמת האות שנצפתה באמצעות זיהוי Ultra-סגולה (UV) מראה כמעט זהה עוצמת האות המדויקת כלכאורה באמצעות קונבנציונלי טור שבו כל (100%) של השלב הנייד מנותח 7. יתר על כן, כוונון עדין של היחס בין שקע זרימת האזורים המרכזיים וקיר מאפשר את יעילות הטור להיות מותאמת. הרווחים ביעילות טור נצפו באמצעות עמודות AFT לא ניתן לומר לערך יחיד, מאז רווחים יעילות אלה הם פונקציה של שלושה גורמים: (1) קצב הזרימה, (2) יחס הפילוח, ו- (3) גורם השימור המומס . עם זאת, עלייה ביעילות בהשוואה למרהעמודות entional כמעט תמיד הם נצפו, ולפעמים רווחים אלה במספר הצלחות התיאורטיות 1,2 יותר מ -100%. היכולת לכוון את יחס הפילוח מאפשר למטפל להתאים את הקוטר של הטור "הווירטואלי" ביעילות, ואת זה הוא גורם חשוב ביחס לתהליך זיהוי. לדוגמא, קוטר עמודה וירטואלית 2.1 מ"מ פנימית (ID) הוקמה מעמודת id 4.6 מ"מ פיזי כאשר יחס הפילוח הוא 21% משלב נייד משחררי מנמל היציאה המרכזי רדיאלי. בתנאים אלה, עמודת id 2.1 מ"מ הווירטואלי מבצעת עם יעילות שעשויה להיות יותר מ -70% יותר מעמודת id 2.1 מ"מ הקונבנציונלי, בהתאם לקצב זרימה, וגורם שימור מומס 10.

עיצוב עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים הנוכחי המשמש לגילוי ריבוב משלב 4 יציאות לשקע מתאימות, אבל הטור יכול להיות מצויד עם 2 יציאות מתאימות גם הסוף, עם זאת, זה לא מגביל את זיהויo רק שני גלאים. הפעולה הבסיסית של עמודות אלה, עם זאת, אותו, מלבד יכולים להיות יחד כי ארבעת גלאים במקביל לטור כוחות הביטחון הפלסטיניים שקע 4 יציאות הרחבת ההיקף לאיתור מרובב. מלבד צינורות חיבור טור לפני ואחרי, הדרישות נוספות רק לפעול עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא צינור שיכול להיות מחובר ליציאות לשקע ההיקפיים, ואמצעים שבם הסכום של שלב נייד עובר צינור אחד ניתן למדוד, בדרך כלל גם מדידת מסה או מדידת נפח. על מנת להקל על כוונון, הקוטר הפנימי של כל הזרימה לשקע צינורות צריך להיות זהה. זרימת היחס בין יציאות יציאה המרכזיות ההיקפית ורדיאלי אז מגוון באמצעות ניהול לחץ, פשוט על ידי שינוי האורך של הצינור ממוקם בשקע ההיקפי המתאים, או האורך של הודעה צינורות גלאי בפתח היציאה המרכזית רדיאלי.

מרובב איתור שימוש בעמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים

יתרון חשוב של עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא שכל אחד מנמלי יציאת השקע יכול להיות מחובר למקור איתור ישירות, ובכך לאפשר זיהוי מרובב. במערכת איתור מעוצבת היטב ניתוח יחיד עם זיהוי מרובב יכול לספק מידע משמעותי בכל הקשור לטבע של הרכיבים בתוך המדגם. חשוב לציין, ניתן לבצע בדיקות הרסניות ולא הרסניות בדיוק באותו הזמן, ללא דיחוי זיהוי. זה מאפשר הקצאה המוחלטת של, למשל, נוגדי חמצון באמצעות מגיב DPPH •, עם רכיבים שנצפו לelute עם UV ו / או תגובות זיהוי ספקטרוסקופיית מסות (MS) 7,11. לכן, יכולים להיות מופעלים על ארבעה גלאים עצמאיים בו זמנית עם חלקים מתאימים של זרימה מופנים לכל גלאי באמצעות כל אחת מארבע היציאות לשקע. מאז את הזרימה דרך יציאות אלה יכול להיות מותאמות כמות מומסת להגיע כל הגלאים בקלות יכולה להיות מותאם לחליפההרגישות של מקור הגלאי נתון. יש לציין, עם זאת, כי ההגירה מומסת היעילה ביותר שנצפתה דרך פתח היציאה המרכזית רדיאלי. כל אחד מהנמלים ההיקפיים מציע יעילות הפרדה שווה ערך, שכאשר נקבעו ל- 25% בכל יציאה, היא רק מעט פחות יעיל מאשר טור קונבנציונלי. ככזה, חשוב שהגלאים כמותיים להיות מוגדרים לנתח דגימה מנמל היציאה המרכזית רדיאלי.

בעת הגדרת עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים לצורך זיהוי ריבוב יש מספר השיקולים שצריכים להיעשות כדי להשיג תוצאות יעילה ואיכותיות; שממדי צינור לכל יציאה, בחירה של שיציאה לסוג של גלאי וזרימת התאמה.

מימדי צינור לכל יציאה

בכרומטוגרפיה האורך של צינורות הודעה עמודה ממלא תפקיד מכריע ביעילות וביצועים של ההפרדה. DEA הגדולד-נפח כתוצאה מצינורות id ארוכים או רחבים משקע עמודה לגלאים יגרום להפסד של יעילות, רזולוציה ורגישות. כך, ממדי צינורות מתאימים חייבים להיות מנוצלים בעת הגדרת עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים כדי להשיג את הפוטנציאל המרבי במתן הפרדה יעילה תוך מתן היתרונות של ריבוב.

נמל לגלאים

איור 2 הוא דוגמה להתקנת דוגמא של גילוי ריבוב (ויולט-גלוי Ultra (U-Vis), ספקטרומטר המסה (MS) ו2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) זיהוי). האיור מציג את הנמל המרכזי מחובר לגלאי MS, ואילו DPPH וגלאי UV-Vis מחוברים ליציאות ההיקפיים. מאז MS הוא הגלאי רגיש ביותר של שלוש, תזרום לגלאי זה הופנה מנמל היציאה המרכזי. כגילוי DPPH הוא סלקטיבית לpresencדואר של נוגדי חמצון, ורגיש לפחות וסובלני ביותר להרחבת להקה, תזרום לגלאי זה הופנה מנמל היקפי. UV-Vis היה גלאי 'גנריות "משניים, כך יזרום לגלאי זה הופנה מנמל היקפי שני.

זרימת התאמה

ברגע שהצינור המתאים כבר מחובר מיציאה לגלאי, זרימת יציאה מכל אחד מהגלאים יכולה להיות מותאמת לסכום הנדרש. דרך פשוטה למדוד את כמות זרימת יציאה מכל גלאי היא לשקול את הסכום של שלב נייד שelutes דרך כל יציאה על תקופת זמן נתונה. זרימת אחוז ובכך ניתן לקבוע, ויכולים להיות מותאם זרימת היחסים או על ידי קיצור או הארכת צינורות המחוברים לקו לשקע בגלאים בהתאם כדי שיתאים לדרישות של הגלאים של בחירה. יש גלאים שונים יש דרישות שונים של זרימה, למשל, תא הזרימה שלגלאי הקרינה (FLD) אינו קצב הזרימה מוגבל, אך יש להקפיד להימנע על-שמירת לחץ של תא הזרימה. מכאן השליטה של ​​זרימה דרך FLD בדרך כלל השיגה על ידי התאמת הירידה בלחץ על פני הגלאים האחרים ואת יתרת הזרימה אז עוברת דרך FLD. גלאי שרגיש לכמות הזרימה שמועברת הוא הטרשת הנפוצה. בדרך כלל, ספקטרומטרים המוניים סוף גבוה הנוכחיים יכולים בקלות לעבד סביב 1 עד 1.5 מיליליטר / דקה של שלב המימי בינוני נייד. מעל קצב זרימה זו, הצפה של המקור עלולה להפוך את MS שמיש. עם זאת, רגישות זיהוי ברוב ספקטרומטרים מסה נהנתה באמצעות ספיקות נמוכות יותר; ומכאן יכולות פיצול זרימת כוחות הביטחון הפלסטיניים הן מאוד שימושיות עבור יישומים הכוללים איתור טרשת נפוצה. יכולות להיות מנוצלת עמודה גבוהה ספיקות נפח, אבל עם המון נפח נמוך הועברו לגלאי MS. כוונון הזרימה לגלאי MS, לעומת זאת, חייבת להתבצע על ידי התאמת הירידה בלחץ לפניגלאי MS, MS ולא הודעה. כאן, השימוש בצינורות צרים נשא (id 0.1 מ"מ) הוא מאוד שימושי, כמו הלחץ יכול להיות מותאם בקלות מבלי להוסיף נפח מת שאינו הולם.

בהתאם לסוג של גלאי ההתאמה של יחס הפילוח ניתן לעשות גלאי או לפני או אחרי. אם גלאי אינו הרסני, כגון משמש UV-Vis, זרימת אחוז יהיה מדוד ומכוון פוסט גלאי. אם גלאי הרסני אחת משמש בקומפלקס להגדיר את זרימת אחוז נקבע על ידי החישוב לאחור ביחס לזרימת נמל האחוזים אחרים. אם גלאי מבוסס מגיב משמש כגון DPPH •, זרימת אחוז נמדד הודעה גלאי ללא התוספת של מגיב; ואם שניים או יותר הרסני גלאים משמשים, אז זרימת היחס נמדד מראש גלאי. איתור מערכות שעשויות לדרוש מכשור נוסף, DPPH כאמור, יהיה לחץ מערכת נוסף שעשויות לשנות את הזרימהאחוז מצורף פעם אחת למערכת האיתור. לכן, שיקול דעת צריכה להיות משולם על לחץ במערכת של גלאים הרסניים, מראש גלאי בעת כוונון זרימת אחוז. ללא קשר ליחס הזרימה שמוגדר דרך כל היציאות, יש לקבל מידע כמותי באמצעות תקינה מתאימה. ברגע שזרימת היחסים מוגדרים, לעומת זאת, הם חזקים, והם לא ישתנו גם בתנאי elution שיפוע 7,

פרוטוקול וידאו מפורט המלווה את כתב היד הזה נועד להראות כיצד להשתמש ומנגינת תפקוד עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים במצב ריבוב של זיהוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מכיל הוראות כיצד להשתמש בעמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים במערכת HPLC יחד עם גלאים מרובים לאיתור מרובב. הפרוטוקול נכתב בהנחת שהקורא יש לו ידע בסיסי וניסיון בכרומטוגרפיה ושיטות זיהוי HPLC שונים.

זהירות: עיין בגיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל החומרים וריאגנטים לפני השימוש (כלומר, MSDS למתנול). להבטיח את השימוש של כל נהלי הבטיחות המתאימים בעת טיפול בחומרים ממסים ונוזלית כרומטוגרפיה eluent ביצועים גבוהים (HPLC). להבטיח שימוש נכון של בקרות הנדסה של HPLC, מכשור איזון וגלאי אנליטיות, ולהבטיח את השימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלאים, ונעליים סגורות הבוהן).

1. הגדרה של HPLC Instrument

  1. הכן את מכשיר HPLC עם המים ultrapure (למשל, 100% מים מילי- Q) לליןהדואר ומתנול 100% לקו B כשלב הנייד ולטהר את המשאבות לפי דרישת יצרן. אם אחד מהגלאים משמשים הוא MS, כפי שהוא כאן, להוסיף 0.1% חומצה פורמית לשני שלבים הניידים A ו- B.
  2. הגדרת HPLC רכיבים וגלאים סייעו כפי שמודגם באיור 2. זה דורש מיקום נוח של גלאים ביחס לטור כדי למזער את הנפח המת בין הגלאי ועמודה. גמישות בתצורת מערכת HPLC רצויה.

2. התקנה של UV-Vis וגלאי MS

  1. הגדר את גלאי UV-Vis לאורך הגל הרצוי התלוי במדגם של עניין (למשל, ננומטר 280).
  2. הגדר את גלאי MS במצב חיובי לניתוח רוזן סה"כ יון (TIC) באמצעות שיטת זיהוי סריקה מלאה. גם להתאים את הפרמטרים הבאים MS בהתאם: הטמפרטורה מאדה 500 מעלות צלזיוס, טמפרטורת נימים 350 ° C, גז נדן, בשיעור של 60 יחידות, זרימת גז עזר40 ולטאטא זרימת גז ב 5 יחידות, ומתח תרסיס 3.5 קילו וולט. ניתן לכוונן את הגדרות אלה מאוחר יותר לדרישות משתמש ספציפיות תלויות במדגם להיות מנותח.

3. הכנת 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl הרדיקלי (DPPH •) מגיב התקנה של גלאי מערכת DPPH

  1. שוקל 25 מ"ג של DPPH ולפזר ב250 מיליליטר של מתנול בבקבוק נפח.
  2. הוסף 250 μl של חומצה פורמית למגיב DPPH •. מכסה את הבקבוק בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
  3. Sonicate הבקבוק המכיל מגיב DPPH במשך 10 דקות.
  4. לטהר את משאבת DPPH עם מגיב DPPH מוכן לפי הדרישה של היצרן.
  5. להגדיר את מערכת DPPH על פי איור 2 על ידי הצמדת קו המשאבה לכניסה של T-פיסה.
  6. צרף סליל תגובת μl 100 השקע דואר של T-החתיכה ולצרף את הקצה השני של סליל התגובה לגלאי.
  7. לשים בארגז סליל התגובה בתנור טור ולהגדיר את טמפרטורת תנור עמודה עד 60 ° C.
  8. הגדר את-Vis UV גלאי DPPH 520 ננומטר.

4. הגדרה של טור כוחות הביטחון הפלסטיניים

  1. חבר את הכניסה של כוחות הביטחון הפלסטיניים לעמודת מכשיר HPLC.
  2. חבר את היציאה המרכזית לגלאי MS, באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ"מ.
  3. חבר יציאה היקפית לגלאי UV-Vis באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ"מ.
  4. חבר אחר יציאה היקפית לT-פיסת מערכת איתור DPPH שימוש באורך 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ"מ.
  5. חסום את היציאה ההיקפית שאינו בשימוש באמצעות פקק טור.
  6. להביא את קצב הזרימה של משאבת HPLC לדקות 1 מיליליטר -1 ב 100% קו B - מתנול 100% (0.1% חומצה פורמית).
  7. לאזן את העמודה עם 100% ph הנייד מתנולASE עבור 20 דקות לx 250 מ"מ אורך טור 4.6 id מ"מ. הפעם ישתנה בהתאם לממדים של עמודות אחרות המשתמש יכול להעסיק.

5. כוונון טור כוחות הביטחון הפלסטיניים לאיתור Multiplexed

  1. למדוד את המסה של לפחות שני כלי אוסף ריקים (אחד ליציאה המחוברת לגלאי UV-Vis ואחד לגלאי DPPH •) באמצעות איזון אנליטיות.
  2. אסוף שלב נייד מUV-Vis ויציאות DPPH לשני כלים נפרדים,-שקל מראש אוסף (5.1). רשום את פרק זמן לאיסוף. לאסוף לפחות 500 מ"ג של ממס בכל כלי.
  3. לשקול את כלי האיסוף ולקבוע את המסה של שלב נייד. בהתחשב בצפיפות של מתנול הוא .791 מיליליטר ז -1, לקבוע את עוצמת הקול של שלב נייד שנאסף מכל יציאה.
  4. על ידי הבדל, כלומר, סט קצב זרימת משאבה נומינלית בניכוי קצב הזרימה דרך DPPH ו- UV-Vis detectoזרימת יציאות R, לקבוע את קצב הזרימה לגלאי MS. הגעה כל תזרים פרופורציה כאחוז מהסך כל הזרימה.
    הערה: באופן אידיאלי, זרימת האחוזים הם: לטרשת הנפוצה היא 18% מכלל קצב הזרימה, לUV-Vis 22%, לגלאי DPPH 60%.
  5. אם לא, להתאים את זרימת אחוזים על ידי שינוי הלחץ שוב על גלאי UV-Vis. לדוגמא, אם את הזרימה לUV-Vis היא גבוהה מדי, להפחית את השיעור על ידי הוספה להוסיף סעיף 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ"מ ליציאה של גלאי UV-Vis. אז לחזור על שלבי 5.1 עד 5.5.

6. תנאי התקנה סופיות

  1. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מגיב DPPH לאותו קצב זרימת יציאת היציאה לשקע מחוברת לגלאי DPPH •.
    הערה: טור כוחות הביטחון הפלסטיניים multiplexed עם UV-Vis, DPPH וMS מוכן לניתוח עכשיו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח HPLC מרובב בוצע באמצעות טור AFT במצב כוחות הביטחון הפלסטיניים (איור 1) ולהגדיר כפי שמודגם באיור 2. סוג זה של התקנה אפשר קפה מדגם להיות מנותח בו זמנית באמצעות UV-Vis, DPPH ו- MS בסך הכל רוזן יון מצב (TIC). התרכובות של קפה המדגם שהגיב לDPPH אז יכולות להיות מתאימות בקלות עד UV-Vis וMS - תגובות TIC מבוססות על היישור של זמן שמירה כפי שמודגמות באיור 3, מאז chromatograms נרשמו בו זמנית. איפה תגובה חיובית ראתה מגלאי MS-TIC, המסה המולקולרית של השיא נרשמה. טבלה 1 רשימות הפעמים השמירה של פסגות DPPH •, והתגובה של פסגות כאלה בUV-Vis ו / או MS גלאי, שבכך סיפק את המסה המולקולרית. הקלות בפסגות בין תהליכי זיהוי שונים התאמה אפשרה לAFטופס AST ויעיל יותר של הקרנה ואפיון למדגם מורכב, כגון קפה.

איור 1
איור 1. תמונה של טור זרימת טכנולוגיה פעיל בהשוואה לטור קונבנציונלי. טור AFT מצויד בשקע מתאים ארבעה נמל שבו שוכן frit טבעתי המאפשר דגימת שיא פני חתך רדיאלי של להקת מדגם. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. איור דוגמא להסדר HPLC מרובב, באמצעות טור כוחות הביטחון הפלסטיניים עם DPPH •, UV-Vis וגלאי MS. כל detecto R הוא מחובר ליציאה לשקע נפרדת. במקרה זה MS משמש לכימות ומוגדרת כדי לאסוף דגימה מנמל השקע המרכזי רדיאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. chromatograms של קפה מדגם ניתח באמצעות מערכת HPLC מרובבת, באמצעות טור כוחות הביטחון הפלסטיניים עם DPPH •, UV-Vis וגלאי MS: (א) DPPH 520 ננומטר, (ב) UV-Vis 280 ננומטר, ) MS - TIC. כל עקבות גלאי היא ביחד בצורה מושלמת בזמן, ולכן אין התאמה לקזז נדרש כדי לפצות על זמן מת בין כל גלאי.arget = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

">
קפה DPPH שיא תגובה והמוני
DPPH שיא שמירת זמן DPPH UV-Vis MS - TIC תגובה מַסָה
(דקות) תְגוּבָה תְגוּבָה
1 6.74 כֵּן כֵּן כֵּן 123.84
2 </ Td> 7.54 כֵּן כֵּן כֵּן 125.83
3 8.94 כֵּן לא לא -
4 10.05 כֵּן לא כֵּן 135.83
5 13.15 כֵּן לא לא -
6 16.22 כֵּן לא לא -
7 18.14 כֵּן כֵּן כֵּן 126.82
8 19.4 כֵּן כֵּן כֵּן 162.81
9 20.46 כֵּן כֵּן כֵּן 187.89
10 24.71 כֵּן כֵּן כֵּן 162.81
11 26.27 כֵּן כֵּן כֵּן 162.8
12 26.97 כֵּן כֵּן כֵּן 194.87
13 31.84 כֵּן כֵּן כֵּן 162.8
14 32.02 כֵּן כֵּן כֵּן 162.78
15 32.56 כֵּן כֵּן כֵּן 176.82
16 33.94 כֵּן כֵּן כֵּן 176.83
17 41.26 כֵּן כֵּן לא -
18 42.72 כֵּן לא כֵּן 284.93
19 46.07 כֵּן כֵּן כֵּן 190.83
20 49.21 כֵּן כֵּן כֵּן 162.75

שולחן 1. DPPH זוהה פסגות תגובה לקרינת UV-Vis וMS - TIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה כלל האפיון ואפיון של קפה באמצעות HPLC עם גילוי ריבוב העסקת עמודה מקבילה זרימה מפולחת (כוחות הביטחון הפלסטיניים). המרובב HPLC באמצעות עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים מאפשר אפיון וזיהוי של גורמים כימיים מפתח על ידי הפחתת מורכבות נתוני המדגם תוך קבלת מידה רבה יותר של מידע מולקולה ספציפית בתוך שבריר של הזמן שלוקח באמצעות תהליכים רב-גילוי קונבנציונליים. טור כוחות הביטחון הפלסטיניים לא רק מאפשר פלטפורמה לגילוי מרובב, אלא גם שילוב של שניהם גלאים הרסניים ולא הרסניים, ללא נפח מת נוסף וצינורות. DPPH •, UV-Vis ו- MS (TIC) היו multiplexed לניתוח קפה אספרסו.

טור כוחות הביטחון הפלסטיניים 4 יציאות נוצל לניתוח המרובב של קפה באמצעות שלושה הגלאים שונים. הנמל לשקע עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים המרכזי היה קשור לגלאי MS ושניים מthreיציאות היקפי הדואר היו קשורות לשתי מערכת איתור DPPH או גלאי UV-Vis. הנמל ההיקפי זמין השלישי לא היה בשימוש ולכן חסם עם פקק טור, אבל זה היה יכול לשמש לאיסוף הדגימה, או לגלאים אחר. תהליך הכוונון של סט עד מרובב זה היה ספציפי לגלאי, שבו מדידה של זרימת פילוח התרחש לאחר הגלאי לUV-Vis ומערכות גילוי DPPH •. מאז MS הוא גלאי הרסני, זרימת אחוז נקבע על ידי הבדל (זרימה נומינלית כוללת מינוס זרימה מהיציאות לשקע האחרות).

במחקר זה, קפה הניתוח עם מגיב DPPH הביא 20 פסגות גם נפתרו, 13 מהם גם הראו תגובה בגלאי UV-Vis והטרשת נפוץ. איור 3 משווה את chromatograms מתקבל על ידי כל גלאי. ישנם ארבעה אזורים שיש לו פרופיל chromatographic בתוך כלchromatogram, שצוין על ידי התיבות האדומות. בקופסות אלה, שבי UV-Vis וMS הראו תגובה קטנה לתרכובות אלה, היה תגובה חזקה מגלאי DPPH •. ארבעת מרכיבים שהגיבו למגיב DPPH היו גם לא זוהו על ידי גלאי UV-Vis או MS ושלושה המרכיבים שהגיבו למגיב DPPH לא נתנו שום תגובת UV-Vis או MS בכלל. המסה המולקולרית של הרכיבים שהגיבו לטרשת הנפוצה שנרשמה בטבלה 1. הרכיב שeluted ב 10 דקות הייתה תגובת DPPH חזקה, עם אין תגובה מגלאי UV-Vis ותגובה קטנה מאוד רק מגלאי MS .

הצימוד של טור AFT במצב כוחות הביטחון הפלסטיניים נתן את ההזדמנות כדי להפעיל גלאים מרובים במצב ריבוב, שבו כל הגלאים ללא קשר לדרישות HPLC-גלאם להפעיל בו זמנית בהזרקה והפרדת יחיד של SAMP המורכב זהle. יציאות מרובות בסופו של עיצוב הולם של טור AFT מציע יתרון הנוסף של מתן הזדמנויות לתהליכי גילוי ריבוב, מניב מידע מדגם מפורט ואמינות מוחלטת בהקצאה של רכיבים בין כל מצב זיהוי. זיהוי מרובב עם עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים סיפק כמות גדולה של מידע מדגם, שלושה גלאים מופעלים בו זמנית בתוך זמן הריצה הנדרש לגלאי בודד. המשחק של זמן שמירה של פסגות בתוך כל מצב זיהוי המדויק היה אפשרי. שניים מהגלאים השתמשו היו גלאים הרסניים.

יכולות הריבוב של טור כוחות הביטחון הפלסטיניים היא, עם זאת מוגבלות על ידי הרכיבים הזמינים HPLC אינסטרומנטלי ומכשור איתור. הטכניקה דורשת מספר שיטות איתור ותוספות הכרחיות לכל מצב ספציפי של גילוי, כלומר, משאבות, סלילי תגובה, תנורים וכו 'היתרון העיקרי של גילוי ריבוב באמצעות טור כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא הרדוקציהn בזמן ניתוח של עד ארבעה לקפל (אם 4 גלאים משמשים), אשר ממזערת השתנות מדגם בין מנתח לכל מצב יחיד של זיהוי. יתר על כן, הקצאת יחסי המרכיב בתוך המדגם זוהה מגלאי אחד למשנהו היא הרבה יותר פשוט, ונוטה פחות שגיאה מאשר אם כל גלאי הועסק בנפרד. זה ימנע אי-התאמה במשימות רכיב, אשר לעתים קרובות בעיה בניתוח של דגימות מורכבות.

חשוב לחזור ולהדגיש כי כימות צריך להתבצע על בסיס הגלאי הממוקם בפתח היציאה המרכזית רדיאלי מאז יעילות הפרדה כאן היא הגבוהה ביותר, ומכאן, תופעות עוקבות שיא הן מינימליות וכימות הוא כך המדויק ביותר. זרימת הפילוח הוכח להיות חזק באמצעות ניתוחים, אבל גם כך, זה תרגול מעבדה טוב כדי לשמור על סטנדרטיזציה הרגילה. מכאן בכל עבודת כמותיים חשוב להפעיל סטנדרטים כמתאימים. אם גלאי משמש טהורly כאמצעי להבנת מורכבות המדגם באמצעות תיאור חזותי של מרכיבי מדגם, לא ייתכן שתידרש כימות, כמו במקרה כאן לפרוטוקול זיהוי תגובה נוגד חמצון.

אנחנו הוכחנו כאן דוגמא של גילוי משולש, UV, טרשת נפוצה ואיתור תגובה נוגד חמצון. מערכות גילוי ריבוב באמצעות עמודות AFT ניתן להשתמש כמעט בכל מצב שבו אנליסטים דורש מידע רב ממדי מדגם וזה כרוך בפרוטוקולי זיהוי מרובים. שימוש בעמודות AFT מאוד לפשט ולהאיץ את התהליך של אפיון מדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column Thermo Fisher Scientific Not Defined Soon to be commercialized
Methanol Any brand HPLC Grade
PEEK tubing Any brand Various lengths and i.d.
Column stoppers Any brand For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter Any brand
Analytical Scale Balance Any brand
Stop watch Any brand
Eluent collection vessels Any brand 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136, (24), 5127-5130 (2011).
  2. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
  3. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35, (3), 410-415 (2012).
  4. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
  5. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
  6. Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
  7. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
  8. Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
  9. Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
  10. Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
  11. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats