Transformation af Probiotic Gær og deres Recovery fra Mave Immune væv efter oral sonde i mus

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Præsenteret her er en samlet beskrivelse af teknikker, der kan anvendes til at udvikle, transformere, administrere og teste heterologt protein ekspression af de probiotiske gæren Saccharomyces boulardii.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Probiotiske mikroorganismer er en spændende potentielt middel til effektivt og økonomisk at levere heterologe proteiner til mavetarmkanalen. Disse organismer er i stand til at overleve passage gennem mave-tarmkanalen endnu ikke kolonisere det 1, muliggør kontrolleret dosering og begrænse eksponering for lægemidlet udtrykkes. Endvidere mulighed for nemt at konstruere disse organismer til at producere heterologt protein i stor skala gør dem et økonomisk alternativ til syntetiske leveringstid partikler. Men udviklingen af en sådan fremgangsmåde, som for nylig demonstreret ved hjælp en auxotrof stamme af probiotiske gær Saccharomyces boulardii 2, kræver viden om laboratorieteknikker ikke traditionelt kombineret inden for en given undersøgelse, der spænder fra gær og molekylær biologi teknikker håndtering af dyr og immunologiske metoder. Således selv om de enkelte procedurer beskrevet heri, er ikke i sig selv hidtil ukendtlaboratorieprotokoller, målet med dette manuskript er at præsentere en samlet introduktion til teknikker, der er nødvendige for eksperimentel afprøvning af probiotiske gær som lægemiddeltilførselsvehikler til den murine mavetarmkanalen. Forudsat er en samling af væsentlige protokoller for: 1) generation af auxotrofiske mutant stammer af gær, der nemt kan genetisk manipulerede; 2) transformation af gær kulturer til at udtrykke heterolog protein; 3) indgivelse af rekombinant gær til tarmen via oral sondeernæring; og 4) genvinding af levedygtige rekombinant probiotiske gær fra murine tarmen og vurdering af deres heterolog proteinekspression.

Første, selv om der findes adskillige positive og negative udvælgelsesmetoder til manipulation af gærarter, negativ selektion såsom gennem anvendelse af auxotrofe markører øger både effektivitet og lethed med hvilken gær kan transformeres og selekteres. Positiv selektion af transformanter ved hjælp af antibiotika, i samarbejdentrast, øger omkostningerne ved gær manipulation betydeligt. Endvidere kan valget af gær på antibiotika-holdige faste medier muliggøre øget vækst af utransformerede baggrund kolonier i forhold til udvælgelse af auxotrof gær på syntetisk frafald faste medier (upublicerede observationer). Auxotrofe gær er stammer, som mangler enzymer kritiske for syntesen af ​​essentielle aminosyrer eller uracil. Sådan gær kan kun vokse hvis suppleret med de manglende metabolit eller metabolisk gen, således at negativ selektion, når gær udplades på syntetisk dropout medier, der mangler den væsentlige metabolit. Mange almindeligt anvendte Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammer er faktisk allerede auxotrofe mutanter 3. Industrial, klinisk, og probiotiske gærstammer, er imidlertid typisk prototrofisk med evnen til at syntetisere alle de nødvendige næringsstoffer. At muliggøre en mere effektiv genetisk manipulation af en sådan gær, kan auxotrofe gener selektivt målrettesat generere stammer, der kan vælges uden antibiotika. Specifik målretning af auxotrofe markørgener kan opnås gennem PCR-medieret genafbrydelse afhængige af homolog rekombination eller senere ved CRISPR / Cas9 målretning 4 - 6. Alternativt kan UV-mutagenese hurtigt at generere auxotrofe mutanter selv i gærstammer, for hvilke transformation med multiple plasmider teknisk er vanskeligt 7. Mens PCR målretning og CRISPR / Cas9 er blevet beskrevet udførligt andetsteds, præsenteret i første del af dette manuskript er en detaljeret protokol, der beskriver en UV mutagenese tilgang til at skabe auxotrofiske stammer, der vil give mulighed for negativ selektion snarere end positiv antibiotisk udvalg af gær transformanter.

Det næste nødvendigt skridt i anvendelsen af ​​sådanne auxotrofe stammer til oral afgivelse af heterologt protein er gær transformation med plasmid-DNA. Siden den første vellykkede transformation af yeast sfæroplaster rapporteret for Saccharomyces cerevisiae i 1978 8 har talrige modifikationer blevet karakteriseret at øge effektiviteten og lethed med hvilken gærart kan modificeres genetisk. Anvendelse af elektroporation for vellykket transformation af DNA i S. cerevisiae blev første gang beskrevet i 1985 9 og er siden blevet forbedret ved tilsætning af 1 M sorbitol inkubation til osmotisk støtteceller 10. Elektroporation effektivitet har endvidere vist sig at afhænge af gær art og stamme, celle nummer og vækstfase, elektroporation volumen, feltstyrke, og specifikke buffere 11. Lithiumacetat (LiOAc) transformation, oprindeligt beskrevet af Ito et al. 12, er blandt de mest almindeligt anvendte transformationsprotokoller da det kræver ikke særligt udstyr. Yderligere analyser viste, at effektiviteten af ​​LiOAc gær transformation øger når celler opsamles i midten af ​​log-faseaf vækst og for varmechok i nærvær af polyethylenglycol (PEG) og DNA ved 42 ° C 12. Inkubation af hele intakte gær med PEG er væsentlig for effektiv transformation, eventuelt ved at forbedre binding af DNA til cellemembranen samt via andre effekter på membranen 13. Lithium selv øger også permeabiliteten af intakte celler 14. Selv om de fleste laboratorium S. cerevisiae-stammer kan let transformeres under anvendelse LiOAc transformation 3, kan andre gærarter være mere effektivt omdannes ved hjælp af alternative protokoller. Pichia pastoris, for eksempel, er mest effektivt transformeret via elektroporation stedet LiOAc transformation 13. Det er afgørende, således at teste flere metoder til transformation og optimere inkubationsperioder og reagenskoncentrationer når de forsøger at gensplejse en karakteriseret gærstamme. Dette manuskript beskriver således både LiOAc transformation og elektroporation som teknikker til omdannelse af auxotrofe mutant og vildtype S. boulardii. Interesserede læsere er rettet til de seneste anmeldelser for grundige beskrivelser af udviklingen af gær transformation, alternative protokoller, og yderligere drøftelser af mulige virkningsmekanismer 13,15. Transformation af gær med plasmid koder for et let påviseligt protein er desuden afgørende for downstream test for at sikre korrekt udtryk og funktion af heterologt protein. Myriad forskellige proteiner kan vælges afhængigt af det endelige formål med den terapeutiske studier og antistofferne tilgængelige for protein detektion ved immunoblotting, ELISA og andre teknikker. Protokoller for disse teknikker er blevet grundigt beskrevet andetsteds 16,17, og kan anvendes til at bestemme niveauer af heterolog proteinproduktion fra transformeret gær ved sammenligning med standardkurver. Med henblik på demonstration og at visevellykket produktion af et meget almindeligt anvendt protein i gær biologi, dette håndskrift viser transformation med plasmid, der koder grønt fluorescerende protein (GFP), som giver mulighed for efterfølgende påvisning ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Lige så vigtigt for produktionen af ​​probiotiske organismer, som udtrykker heterologe protein er den korrekte administration og påvisning af disse mikroorganismer i gastrointestinale væv, som beskrevet i del tre og fire. Indgivelse af rekombinant gær via oral sondeernæring muliggør levering af styrede mængder af gær direkte i maven, hvorfra C57BL / 6-mus er naturligvis ude af stand opkastning 18. Forkert håndtering af dyr og sonde, kan imidlertid føre til esophageal skader og perforering, gastrisk perforation, tracheal administration, og aspiration lungebetændelse 19,20. Dårlig teknik og erfaring kan desuden øge variationen i murine immunrespons og eksperimenterende results, som er blevet tilskrevet dyr stress på oral sonde 21,22. Praksis i rette teknik kan således ikke blot svække dyret ubehag, men kan også øge præcisionen af ​​eksperimentelle resultater. Dette manuskript beskriver og demonstrerer håndtering af dyr og oral sonde til administration af kontrollerede doser af rekombinant gær.

Endelig er det vigtigt at fastslå, vellykket levering af rekombinant gær ved at analysere lymfoide væv for tilstedeværelse af gær og heterologt protein. De gastrointestinale immune væv, som kan lettest og forudsigeligt undersøges for tilstedeværelsen af ​​gær er de Peyerske plaques. Peyerske plaques er sekundære lymfoide organer langs tyndtarmen, der er vigtige steder for mucosal immunreaktion induktion 23. Antigener fra lumen overføres transcellularly gennem microfold (M) celler i epitel og frigives i Peyerske plaques, og derved udsatte vedlægged antigenpræsenterende celler til intestinal lumen indhold. Selvom partikel optagelse over tarmepitelet også kan opnås ved slimceller, er disse celler blevet vist at kun optager partikler mindre end 0,02 um i diameter 24. Transepitelial dendritter udvides fra CD103 + dendritiske celler (DC) også optager små partikler fra tarmlumen 25; men der er i øjeblikket ingen rapporter, som dokumenterer, at CD103 + DC'er tage op partikler end bakterier. Således intakt probiotiske gær, af gennemsnitlige størrelse mellem 3-6 um i diameter, er mest tilbøjelige til at blive taget op af M-celler og overføres til de Peyerske plaques. Beskrevet her er en protokol for indsamling og screening af Peyerske plaques for levedygtig rekombinant gær, selv om denne procedure også kan let tilpasses til evaluering optagelse af probiotiske bakterier.

Sammenfattende vurdering rekombinant probiotiske gær for levering afrapeutic proteiner til tarmen kræver færdigheder i laboratorieteknikker spænder molekylærbiologi til håndtering af dyr og immunologi. Præsenteret her er protokoller for 1) genereringen og screeningen af ​​auxotrofe gærstammer som let kan selekteres negativt uden antibiotika, 2) alternative protokoller til transformation gær og muliggøre ekspression af heterologt protein, 3) demonstrationer af korrekt håndtering af dyr teknikker og oral sondeernæring til intragastrisk levering af rekombinant gær, og 4) protokoller for Peyerske plak dissektion og screening for levedygtig rekombinant gær og funktionelt heterologt protein. Tilsammen vil disse protokoller muliggøre generering og testning af en probiotisk gærstamme kan levere heterologt terapeutisk protein til mavetarmkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. UV mutagenese for at generere Auxotrofe gærstammer

  1. Generere overlevelseskurver at bestemme nødvendige doser af UV-bestråling
    1. Forbered YPD (gærekstrakt pepton dextrose) medier og andre reagenser anført i tabel 1 ifølge standardprocedurer 26 og inokulere enkelte kolonier i 5-10 ml YPD medium. Inkuberes kulturer på en rulle tromle ved 30 ° CO / N til mætning i mindst 8 timer.
    2. Bestem cellekoncentration på O / N kulturer under anvendelse af et spektrofotometer ved at fortynde celler 1:10 i vand i en plast kuvette. Fortynd cellerne til en koncentration på 10 7 celler / ml i 20 ml sterilt destilleret vand.
    3. Hæld fortyndede celler i en steril plastik petriskål og, med låget fjernet, anbringes pladen 14 cm under en UV pære.
    4. Expose celler til seriel 5000 μJ og 10.000 μJ doser UV-bestråling, der udvinder 500 pi celler efter hver stigning, således at cellernesamples efter udsættelse for 0 μJ, 5000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ, og 50.000 μJ af UV-bestråling. Overfør udvundet celleprøver til sterile 1,5 ml rør og serielt fortyndet på 1:10 intervaller i sterilt vand.
    5. Pelleter celler i hver fortynding ved centrifugering i en mikrocentrifuge ved 16.000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten og resuspender i et 100 pi volumen sterilt vand egnet til udpladning gærceller. Pipettere det fulde volumen af ​​resuspenderede celler på plader indeholdende YPD faste medier og anvende en steril spreder at fordele celler på tværs af hver plade.
    6. Wrap pladekanter i Parafilm at forhindre udtørring af medier og dækplader i aluminiumfolie for at forhindre foto-reaktivering og reparation af UV-inducerede mutationer. Pladerne inkuberes på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage for at tillade vækst af levedygtige gær kolonier (figur 1).
    7. Tæl number fra kolonier, eventuelt med hjælp af en pen til at markere optalte kolonier, en håndholdt elektronisk tæller pen, eller en tæller stå med forstørrelse. Plot som en procentdel af det samlede udpladede celler ved hver μJ dosis UV-bestråling for at generere en overlevelseskurve for bestrålet gær (figur 2).
      BEMÆRK: haploide gærstammer kan forventes at kræve lavere doser af UV-bestråling i forhold til diploide stammer at nå den samme procent overlevelse. En stamme af gær, som mangler funktionelle DNA-reparationsenzymer, såsom rad1 S. cerevisiae-mutant, kan anvendes som en positiv kontrol for at indikere tilstedeværelsen af UV-bestråling ved meget lave doser.
    8. Bestemme den dosis af UV mutagenese, der skal anvendes til screening ved at henvise til overlevelse optegnes i 1.1.7. X-værdien for punktet langs overlevelseskurven hvor y er lig 50 er UV-bestråling dosis, ved hvilken 50% af gær overleve. Screening mutanter ved denne lave procent overlevelse kan resultere i enhøjere udbytte af korrekt muterede stammer, især for diploid gær. Overlevelsen dosis 50% for WT S. boulardii, som vist i figur 2, er ca. 18.000 μJ.
      BEMÆRK: Selv om sådanne høj UV doser øger risikoen for mutationer i gener for andre end den auxotrofe markør genet af interesse cellulære veje, skal denne ulempe opvejes mod behovet for at fremkalde mutationer i begge kopier af auxotrofe markørgen. For haploide stammer, hvor kun ét gen kopi skal muterede, screening ved en højere procent overlevelse, såsom ved 90%, mindsker risikoen for yderligere mutationer og stadig giver mulighed for tilstrækkelig dannelse af auxotrofe mutanter.
  2. UV mutagenese og screening for auxotrofiske gærstammer
    1. Forbered gær som beskrevet i trin 1.1.1-1.1.3.
    2. Udsætte gæren til dosen af ​​UV-bestråling, svarende til 50% overlevelse, som bestemt i 1.1.8. For WT S. boulardii, denne dosis was fast besluttet på at være ca. 18.000 μJ (figur 2).
    3. Indsamle 1 ml volumener af UV bestrålet gær og pellet ved centrifugering i en mikrocentrifuge ved 16.000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 100 pi sterilt vand.
      1. Udvælgelse af mutanter
        1. Hvis der anvendes selektion såsom med ura3 - auxotrofe mutanter, plade bestrålet gær på medier indeholdende 5-fluororotinsyre (5-FOA) at selektere for celler, der mangler et funktionelt Ura3 enzym.
          BEMÆRK: Enhver gær indeholder funktionelle kopier af Ura3 vil konvertere 5-FOA til toksinet 5-fluorouracil, hvilket fører til celledød og giver mulighed for nemt valg af ura3 - kolonier, som mangler et funktionelt Ura3 27. Analoge udvælgelse tilgange er muligt for LYS2 og LYS5, TRP1, og met2 og MET15 markører ved hjælp medier indeholdende α-aminoadipinsyre 28; 5-fluoranthranilsyre 29; og methyl-kviksølv 30,31 hhv.
        2. Pipette de 100 pi resuspenderede celler på minimal medium indeholdende 5-FOA og bruge en steril sprederen jævnt belægge pladen. Wrap plader i Parafilm og inkuber på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage for at tillade vækst af levedygtige gær kolonier.
        3. Bekræft URA3 - fænotype af enhver koloni optræder på 5-FOA-plader ved genudstrygning på YPD, uracil - og 5-FOA-plader (figur 3). Brug spidsen af en steril tandstik til at indsamle en del af en enkelt koloni og træk forsigtigt cellerne tværs frisk YPD, uracil - og 5-FOA-plader. Igen inkuberes indpakkede plader på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage.
          BEMÆRK: Levedygtige kolonier vil blive vist som hævet, omkring cirkulære vækster mens ikke levedygtige celler vises kun som en uigennemsigtig smear uden rejst vækster (Figur 3).
      2. Screening af mutanter
        1. Hvis generere en auxotrof mutant for hvilke udvælgelsesmetoder ikke er tilgængelige, forberede serielle 1:10 fortyndinger af UV bestrålet gærceller i sterilt vand og pipette fortyndingerne på YPD medie under anvendelse af en steril sprederen jævnt belægge pladen.
        2. Wrap plader i Parafilm og inkuber på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage. Bestem hvilken fortynding tilladt for vækst af individuelle kolonier, der nemt kan skelnes fra hinanden, normalt ikke mere end ca. 100 kolonier per plade.
        3. Gentag UV mutagenese af gær prøver som beskrevet i 1.2.1-1.2.3 og plade celler på denne beslutsom fortynding. Pipettere den fortyndede gær onto YPD medium, brug en steril spreder til at distribuere cellerne, og inkubér indpakkede plader på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage.
        4. Skærm for auxotrofe ved replikaudpladning onto selektive medier mangler metabolit af interesse. Først sikre en steril fløjl pad på en plade stativog vendes pladen med UV bestrålede kolonier på fløjl, markerer plade orientering.
        5. Dernæst vendes en frisk plade mangler metabolit af interesse på fløjl og let tryk ned for at overføre celler fra fløjl til pladen. Opbevar den originale plade ved 4 ° C. Wrap og inkuberes den nye plade på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage.
        6. Som et alternativ til replikaudpladning, skærm mutanter ved re-striber kolonier fra YPD på selektive medier. Brug spidsen af ​​en steril tandstik til indsamling af en enkelt koloni og forsigtigt cellerne trækkes på tværs af en frisk YPD-plade og en plade mangler metabolit af interesse. Igen inkuberes indpakkede plader på hovedet ved 30 ° C i 2-4 dage.
          Der skal drages omsorg for at vælge enkelte kolonier og streak ud kolonier flere gange for at bekræfte en homogen population af ægte auxotrofe celler: BEMÆRK.
    4. Bekræfter yderligere fænotypen af ​​bestrålede celler ved inoculating enkelte kolonier i 5-10 ml både YPD og medier, der mangler den relevante metabolit (f.eks, i uracil - medier til et ura3 - mutant). Inkuber på en rulle tromlen ved 30 ° CO / N for at bekræfte vækst af celler i YPD medium, men ikke i fravær af metabolitten.
      BEMÆRK: Selvom vækst mønstre på faste medier klart bør angive gær auxotrof status, er det muligt for nogle gær til at tolerere stress og danner små, langsomt voksende kolonier på faste medier, men endnu ikke tolerere de samme betingelser i flydende medier (upublicerede observationer). Podning i flydende kulturer bør således udføres for at grundigt bekræfte vækstmønstre af UV bestrålede mutanter.
    5. Til langtidsopbevaring af bekræftede auxotrofe mutanter, forberede glycerolstamopløsninger ved inokulering celler i 10 ml YPD og inkubering på en rulle tromle O / N ved 30 ° C. Udpelleter cellerne ved centrifugering i 3 minutter ved 2.500 xg opsuges medier. Resuspender celler i 50%sterilt filtreret glycerol, overførsel til en kryoglas, og opbevares ved -80 ° C.
      BEMÆRK: UV mutageniseret gær potentielt indeholder mutationer i andre end i auxotrof markør af interesse flere gener. Før du fortsætter med brug af verificerede auxotrofe mutanter, bør disse stammer analyseres nærmere gennem gen-sekventering og vurdering af resistens over for pH, galde syre understreger og andre karakteristika er relevante for probiotiske stammer, som beskrevet andetsteds 2. Derudover brug af PCR-homologi eller CRISPR / Cas9 målretning til mere selektivt mutere auxotrofe markører bør betragtes som et alternativ til UV mutagenese 4 - 6.

2. Yeast Transformation

  1. LiOAc Transformation af gær
    1. Podes enkelt gærkolonier i 5-10 ml YPD medier og inkuberes på en rulle tromle ved 30 ° CO / N.
    2. For at inducere den logaritmiske vækstfase og øge effektiviteten af ​​plasmid optagelse, determine cellekoncentrationen anvendelse af et spektrofotometer til at måle en 1:10 fortynding af celler i sterilt vand i en plast kuvette. Fortyndede o / N-kulturer til en OD 600 på 0,16-0,2 (ca. 2 x 10 6 - 2,5 x 10 6 celler / ml) i 50 ml frisk varm YPD og inkuberes celler på en orbital platform shaker sat til 200 rpm, indtil kulturen er ca. 1 x 10 7 celler / ml, normalt omkring 4 timer.
      BEMÆRK: Transformation effektivitet kan måles som en funktion af antallet af succes transformeres gær kolonidannende enheder (CFU) pr ug plasmid DNA. Øget resultater effektivitet i mere transformerede kolonier pr ug plasmid DNA. Subkultivering gærceller og indsamling under den logaritmiske vækstfase er en faktor, der øger transformationseffektivitet 12.
    3. Pelleter cellerne ved centrifugering ved 2500 x g i 3 min.
    4. Aspirere supernatanten og overføre cellerne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved at resuspendere hulteret i 1 ml sterilt vand.
    5. Pellet cellerne ved centrifugering ved 16.000 x g i 1 min i en mikrocentrifuge, aspireres supernatanten og vask cellerne ved resuspension i 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) puffer.
    6. Gentag centrifugering og resuspender cellerne i TE / LiOAc puffer til en koncentration på 2 x 10 9 celler / ml.
    7. Forbered transformation blandinger med hver af følgende: 50 pi tilberedt gær i TE / LiOAc buffer, 5 pi bærer-DNA (10 pg / pl), og 1 pi plasmid-DNA (1 ug). Mikrogram plasmid-DNA kan titreres som stigende mængder DNA kan eller kan ikke føre til øget transformation effektivitet 32
      BEMÆRK: For en mutant gærstamme mangler en auxotrof markør, kan kun en plasmid, der koder markøren transformeres per prøve. Endvidere anvendelse af et plasmid, der koder for et let påviseligt protein, såsom GFP, vil give mulighed for effektiv bestemmelse af korrekt foldning og ekspression af heterologe protein af gærstammen efter transformation.
    8. Til hvert præparat, tilsættes 300 pi PEG / LiOAc / TE og vortex grundigt. Inkubation af intakte celler med PEG er væsentlig for effektiv transformation 13.
    9. Inkuber præparater ved 30 ° C i 30 minutter under omrøring ved at anbringe mikrocentrifugerør i et bæger anbragt på en orbital platform-ryster ved 200 rpm.
    10. Tilsættes 35 pi DMSO til hver reaktion og varmechok-celler i 15 minutter i et 42 ° C vandbad. Selv om der er modstridende rapporter om den ekstra fordel af DMSO 33, har varme chok af intakte gærceller vist i høj grad at øge transformationseffektivitet 12.
    11. Vask cellerne ved pelletering via centrifugering som i 2.1.5, opsugning eller pipettering af supernatanten og resuspendering i 1 ml sterilt vand. Pipettér forsigtigt op og ned for at bryde op cellepelleten.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at grundigt at fjerne supernatanten, fordi brugen medierd ved generering kompetente celler kan inhibere gær vækst og kolonidannelse.
    12. Gentag celle pelletering som i 2.1.5, aspireres supernatanten, og cellerne resuspenderes i 100 pi sterilt vand. Pipettere det fulde volumen på en selektiv plade og bruge en steril sprederen jævnt overtrække pladen med transformeret gær.
    13. Wrap kanter af coatede plader i Parafilm at forhindre udtørring af medier og inkuberes på hovedet ved 30 ° C i 2 dage for at tillade vækst af transformerede gærceller. Vellykket, effektiv transformation og auxotrof udvalg af Saccharomyces cerevisiae giver et stort antal kolonier pr transformation forberedelse, selvom udbyttet kan være meget lavere for andre stammer (figur 4).
    14. Store gær plader til på kort sigt (generelt 1-3 uger) på hovedet og dækket ved 4 ° C. Forbered glycerol lagre af transformeret gær som beskrevet i 1.2.5 til langtidsopbevaring.
      BEMÆRK: Yderligere undersøgelser test forvandlet CFU er nødvendige for at bestemme plasmidstabilitet og vurdere korrekt ekspression af heterologt protein. Grundige beskrivelser af plasmidstabilitet 34, anvendelse af immunoblotting at detektere denaturerede proteiner udvundet fra celleprøver 17, enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til påvisning af korrekt foldet tredimensionelle proteiner 16, og anvendelsen af GFP i gær studier 35 er tilgængelige andre steder. Figur 6 viser et repræsentativt billede af vellykket GFP-ekspression i transformeret S. cerevisiae forhold til utransformerede celler. Anvendelse af en sådan fluorescerende protein er et middel til effektivt at bestemme vellykket heterolog proteinproduktion.
  2. Elektroporering af Gær
    1. Podes enkelt gærkolonier i 5-10 ml YPD medier og inkuberes på en rulle tromle ved 30 ° CO / N.
    2. Bestem cellekoncentrationen anvendelse af et spektrofotometer til at måle en 1:10 fortynding af celler i sterilt vand. Dilut O / N kulturer i 100 ml fersk varm YPD medier til en OD 600 ækvivalent på ca. 0,3. Inkuber subkulturer ved 30 ° C på en orbital platform shaker sat til 200 rpm, indtil det når en OD600 på ca. 1,6, sædvanligvis 4-5 timer. Hver 100 ml subkultur vil generere nok aircondition celler til to transformation reaktioner.
    3. Pelleter cellerne ved centrifugering ved 2500 x g i 3 min. Aspirer supernatanten og vask cellerne ved resuspendering i 50 ml iskoldt sterilt vand. Gentag vask ved pelletering celler, opsugning supernatanten og resuspension i 50 ml frisk iskoldt sterilt vand.
    4. Pelletere cellerne igen og resuspender i 50 ml iskold elektroporation puffer (1 M sorbitol, 1 mM CaCl2).
    5. Gentag centrifugering som i 2.2.3, aspireres supernatanten, og resuspender cellerne i 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Inkuber cellesuspensionen på en rulle tromlen ved 30 ° C i 30 minutter. Præinkubation af cellerne i LiOAc og DTT synergistisk forøgereffektivitet elektroporering 36.
    6. Pelletere celler som i 2.2.3, fjern supernatanten, og vask ved resuspendering i 50 ml iskold elektroporation buffer. Gentag centrifugering og resuspender cellerne i iskold elektroporering buffer til et endeligt volumen på 1 ml.
    7. Forbered på is: conditioned gærceller, sterile elektroporation kuvetter, og plasmid-DNA. Umiddelbart efter den endelige resuspension af konditioneret celler i 1 ml elektroporation puffer, kombinere 400 pi konditioneret gærceller med ca. 1 ug plasmid-DNA og tilsæt til en iskold 0,2 um elektroporation cuvette. Anvendelse af øgede mængder af DNA kan stige lidt transformationseffektivitet 11. Inkuber reaktion på is i 5 minutter, derefter elektroporere med elektroporator indstillet til 2,5 kV og 25 uF.
      BEMÆRK: Som beskrevet i 2.1.7, kan en mutant gærstamme mangler en auxotrof markør transformeres med kun én plasmid koder for det muterede markør per prøve. Også ved hjælp afet plasmid, som koder for en let detekterbar protein, såsom GFP muliggør effektiv bestemmelse af korrekt foldning og ekspression af heterologt protein efter transformation.
    8. Overførsel elektroporeret celler i 8 ml af en 1: 1 blanding af YPD: 1 M sorbitol og tillade celler at inkubere på en rulle tromlen ved 30 ° C i 60 minutter.
    9. Pellet celler som i 2.2.3 og resuspender i 100 pi 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Plate den fulde mængde på selektive medier indeholdende 1 M sorbitol, wrap kanter af pladerne i Parafilm, og inkuber plader på hovedet ved 30 ° C i 2-5 dage for at tillade vækst af transformerede gærceller.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at prøve transformeret gær at vurdere korrekt ekspression af heterologt protein, som beskrevet i 2.1.14 og 2.2.7.

3. oral gavage af mus med transformeret gær

  1. Udfør alle procedurer dyr pleje og håndtering i henhold til vejledning for pleje og brug af Laboratory Animals og Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendelse.
  2. Forbered O / N gærkulturer ved podning enkelte kolonier af transformerede auxotrof gær til 5-10 ml selektive medier. Inkuber kulturer O / N i mindst 8 timer på en rulle tromlen ved 30 ° C indtil mættet.
    Bemærk: Brug af plasmid koder testproteiner såsom GFP vil muliggøre nem proteinekspression test i tvangsfodret gær, som beskrevet i 4.7.
  3. For maksimal induktion af proteinekspression og at inducere den logaritmiske vækstfase, forberede subkulturer fra O / N kulturer ved fortynding til en OD600 ækvivalent på ca. 0,16 til 0,2 i 50 ml passende medier som beskrevet i 2.1.2.
  4. Bestemme koncentrationen af subkultiveret celler som i 1.1.2 og juster til 10 9 celler / ml. Forbered en 100 pi dosis for hver mus, med et par hundrede pi ekstra volumen pr gruppe til at forbedre nøjagtigheden og lethed af prøve lastning.
  5. Pellet cellerne ved centrifugering ved 2.500 x g i3 min eller i en mikrocentrifuge ved 16.000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne ved tilsætning af et lige volumen sterilt vand og forsigtigt at pipettere op og ned.
  6. Lave en passende gauge sonde nål (22 G for 15-20 g mus) på en 1 ml steril sprøjte og belastning gær prøve, og sørg for at fjerne eventuelle bobler og sæt stempel til en 100 pi tilvækst. Læg et ekstra sprøjte med sterilt vand til sondeernæring kontrol mus og kontrollere for tilstedeværelsen af ​​enhver forurenende gær.
  7. Saml musen skal tvangsfodret anvendelse af den ikke-dominerende hånd, med pegefingeren og tommelfingeren stramt fat i huden omkring halsen (figur 6A). Tuck halen under den lille finger for at forhindre bevægelse af det nedre legeme. Vær sikker på, at grebet er sikkert og forbyder musen fra at bevæge sit hoved for at undgå skader på indre væv under sondeernæring.
    BEMÆRK: vurdere, hvor langt den sonde Nålen stikkes ved at holde nålen mod musen, således atpæren er selv med formet som et sværd proces af brystbenet. Indsættelse denne længde af nålen vil typisk tillade gavagenål pære til at komme ind i maven.
  8. Brug af dominerende hånd, forsigtigt indsætte gavagenål i musen spiserøret ved at vinkle nålen langs ganen og bagsiden af ​​halsen, holder lidt til venstre for midten. Vent på musen til at sluge pæren af nålen og tillade nålen at synke lidt yderligere til det punkt estimeret i 3,7 (figur 6B). Hvis føles nogen modstand under indføring af sonde nål eller hvis musen på noget tidspunkt begynder at gisp, forsigtigt fjerne kanylen og igen prøve at finde spiserøret.
  9. Efter musen har slugt pæren af sonde nål, forsigtigt trykke sprøjtens stempel til at administrere 100 pi (10 8 CFU) af gær direkte i musen maven.
    BEMÆRK: Selvom mus er ikke i stand til at kaste op nogen af de tvangsfodret opløsning efter administration 18,19 21,37. Korrekt indsættelse af gavagenål, samt at justere lydstyrken og viskositeten af ​​opløsningen, kan bidrage til at begrænse reflux og sikre nøjagtig dosering.
  10. Fjern forsigtigt gavagenål fra muse maven og spiserøret og returnere musen til buret. Kontroller, at musen er vejrtrækning og bevæger sig normalt efter sondeernæring at sikre, at sonde nål blev indsat korrekt under hele proceduren, og at ingen løsning blev aspireret.

4. Høst af murine Peyerske plaques og isolering af levedygtige gær Kolonier

  1. På et passende tidspunkt efter sondeernæring, typisk 4 timer, offer mus ved hjælp IACUC godkendte metoder. Kontroller for manglende lydhørhed efter en tå knivspids, og bruge en sekundær foranstaltning som cervikal dislokation at ofre musen. Ekstra tidspunkter kan også testes, som talrige undersøgelser har vist, at effektiviteten og timingen af ​​optage over slimhinder er partikel afhængig 38,39.
  2. Læg mus med maven fuldt eksponeret og sterilisere det abdominale område ved sprøjtning med 70% EtOH. Lav en tværgående snit gennem pelsen og huden med en saks, og pas på ikke at beskadige de indvendige væv. Manuelt lirke snittet åbne yderligere for at eksponere bughinden, den tynde serøse foring dækker de abdominale organer. Løft forsigtigt peritoneum og lave en tværgående indsnit for at blotlægge tarmene.
  3. Brug forsigtigt stumpe pincet til at drille tyndtarmen væk fra de mesenteriske arterier, fedt og andre væv. Eksponere tyndtarmen fra maven, i øverste venstre kvadrant af musen maven, til coecum, den store lomme af tarmvæv ved starten af ​​tyktarmen.
  4. Isolere de Peyerske plaques ved at se efter 1-3 mm nogenlunde cirkulær pletter af uigennemsigtige væv langs tyndtarmen (figur 7). Brug buede dissektion LAFsorer, skåret væk kuplen i Peyerske plak, forlader margener for at sikre, at ingen af ​​den omgivende lamina propria opsamles.
    BEMÆRK: De fleste mus har mellem 4-8 let synlige Peyerske plaques. Udførelse af proceduren i et område med direkte ovenlys vil øge den lethed, hvormed Peyerske plaques kan visualiseres.
  5. Collect dissekeret Peyerske plaques i komplet Iscoves modificeret Dulbeccos medier (IMDM).
    BEMÆRK: Det er kritisk at anvende steril teknik og indbefatter antibiotika i samlingen medier for at forhindre gastrointestinale bakteriel kontaminering af gær plader.
  6. Stamme Peyerske plaques gennem en 40 um cellefilter at eliminere indsamlingen medier. Wash Peyerske plaques med frisk komplet IMDM over en 50 ml rør og bruge et stempel fra en 1 ml sprøjte til forsigtigt bryde op Peyerske plaques. Pelleter belastede celler ved centrifugering ved 1800 rpm i 7 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne iet endeligt volumen på ca. 100 pi.
  7. Påfør belastede celler på selektive gær medier og anvende en plade sprederen at fordele celler. Wrap pladekanter i Parafilm og inkuberes pladerne med bunden i vejret ved 30 ° C i 2 dage for at tillade vækst af enhver levedygtig gær udvundet fra murine Peyerske plaques.
    BEMÆRK: Det er nødvendigt at bekræfte, at stammerne er i stand til at levere korrekt foldet heterologt protein til disse immune væv Yderligere undersøgelser efter indsamling af gær fra Peyer 'patches. Som beskrevet i 2.1.14, kan sådanne metoder omfatter immunoblotting, ELISA eller fluorescens mikroskopi til påvisning fluorescerende proteiner, såsom GFP 2,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering af en overlevelseskurve efter UV-bestråling kræver udpladning af fortyndede gærceller, således at særskilte kolonidannende enheder (CFU) er i stand til at danne. Hver 500 pi prøve opsamles som ovenfor beskrevet indeholder ca. 5 x 10 6 celler; dog større end 100 kolonier per plade er vanskeligt præcist at skelne. Plating ufortyndede prøve samt serielle 1:10 fortyndinger af bestrålede celler sikrer således, at CFU kan opregnes ved hver UV-dosis, som vist i figur 1. The CFU tælle, multipliceret med fortyndingsfaktoren, derpå divideret med det samlede antal oprindelige bestrålede celler i hver 500 pi prøve for at bestemme procent overlevelse ved hver dosis. Figur 2 viser den beregnede procentdel af diploide vildtype S. boulardii celler i stand til at overleve 0 μJ, 5000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 22.500 μJ, 25.000μJ, 35.000 μJ, og 50.000 μJ. Disse data fastslår en klar kurve, der kan anvendes til at finde den dosis, der svarer til 50% overlevelse.

Efter selektion af UV-dosis og bestråling af gærceller, er det vigtigt at skærmen mutantkolonier at bekræfte fravær af et funktionelt auxotrof markør-gen. Anvendelse af en udvælgelsesmetode, som beskrevet i 1.2.3.1 og vist i figur 3, øger effektiviteten af fænotype bekræftelse. Vist er et eksempel på URA3 markering, der drager fordel af omdannelsen af 5-FOA til toksinet 5-FU ved intakt Ura3. Analoge tilgange er tilgængelige for LYS2 og LYS5, TRP1 og MET2 og MET15 og øge effektiviteten af selektion for disse mutationer. Der må drages omsorg for at vælge individuelle kolonier under screeningen. Den konsekvente vækst mutant kolonier på YPD og 5-FOA, men ikke uracil -, plader indicates auxotrof fænotype.

Figur 4 viser transformationseffektivitet for vildtype S. boulardii (Sb) i forhold til et almindeligt anvendt laboratorium S. cerevisiae stamme (Sc) ved hjælp af både LiOAc (LiOAc) og elektroporation (Electro) teknikker. Selvom LiOAc transformation er meget effektiv for S. cerevisiae, transformationseffektivitet for S. boulardii er væsentligt forbedret ved hjælp af elektroporation. Figur 5 viser anvendelse af fluorescensmikroskopi som et eksempel fremgangsmåde til analyse af korrekt protein ekspression fra transformeret gær. Lysfelt (A) og fluorescens (B) billeder er vist for S. cerevisiae transformeret med et URA3 plasmid koder for GFP, hvilket viser funktionel ekspression af heterologt protein fra den transformerede gær. Celler kan immobiliseres bedre visualisering under anvendelse dækglas overtrukket i concanavalin A (coat 5 pi af en 2mg / ml stamopløsning i vand på hver 22 x 22 um dækglas og lufttørres).

Figur 6A viser en C57BL / 6 mus holdt lige før oral sonde. Den hånd griber ryggen og halsen af ​​musen fast sådan at musen er ikke i stand til at bevæge hovedet i alle retninger. Denne tilbageholdelse tillader gavagenål skal placeres præcist og med nedsat risiko for vævsskader. Figur 6B viser den gavagenål afholdes efter musen sluger gavagenål. Efter inkubationsperioden bør tyndtarmen af aflivet mus omhyggeligt kradses fra de omgivende væv, som vist i figur 7. Denne manipulation muliggør let identifikation af Peyerske plaques og ren dissektion af plastrene uden at indsamle nogen af det omgivende lamina propria. Endelig viser figur 8 typiske genvinding af levedygtige gær CFU fra Peyerske plaques. Løsninger Gær Medier og Plader Transformation Reagenser Polyethylenglycol (PEG) 50%: YPD: TE / LiOAc: 250 g PEG 3350 20 g pepton 50 ml 10x TE 500 ml sterilt vand 20 g dextrose 50 ml 10x (1M) LiOAc Filtersteriliser 10 g gærekstrakt 400 ml sterilt vand 1 L vand Filtersteriliser autoklave TE 10x: YPD plader: PEG / TE / LiOAc: 100 mM Tris 20 g pepton 400 ml 50% PEG 10 mM EDTA 20 g dextrose 50 ml 10x TE pH til 7,5 og Filtersteriliser 20 g agar 50 ml 10x (1M) LiOAc 10 g gærekstrakt 1 L vand autoklave 20% glucose: Uracil - selektive medier Bærer-DNA (SS DNA): 200 g dextrose 2 g aminosyre mix uden uracil Opbevares ved -20 ° C og før anvendelse af varme i 1-2 minutter ved 100 ° C for at smelte strenge og gemme på is 1 L vand 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer Filtersteriliser 1 L vand <tr> Der steriliseres ved autoklavering eller steril filtrering Tilsæt 20% glucose 1:10 før brug 50% glycerol: Uracil - plader: Elektroporering buffer: 500 ml glycerol I en 250 ml kolbe: 1 M sorbitol 500 ml vand 2 g aminosyre mix uden uracil 1 mM CaCl2 autoklave 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer Fyld med destilleret vand 150 ml vand Autoklave og opbevares ved 4 ° C I en 2 liters kolbe: 20 g agar 750 ml vand Autoclave kolber separat, derefter blandes sammen med 100 ml 20% glucose Komplet IMDM 5-FOA + plader: LiOAc / DTT 500 ml Iscoves Modificeret Dulbeccos Media Autoklave i en 2 liters kolbe: 0,1 M LiOAc 5 ml penicillin streptomycin glutamin 100x 20 g agar 10 mM DTT 500 pi 2-mercaptoethanol 750 ml vand 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum Blande: 2,5 ml natriumpyruvat 100 mM 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer 2 g aminosyre mix uden uracil 150 ml varm vand Når køligt, tilføjer: 0,05 g uracil pulver 1 g 5-FOA Rør og filter sterilisere Tilføj til autoklaveret agar opløsning Bland med 100 ml 20% glucose

Tabel 1. Reagenser List. Beskrevet er de nødvendige reagenser til fremstilling hver af opløsningerne, gær medier og plader og transformation anvendte puffere for protokollerne i dette håndskrift.

Figur 1
Figur 1. Gær kolonier dyrket på YPD-medier. Eksempel YPD plade viser levedygtige kolonidannende enheder (CFU) probiotic gær efter UV-bestråling. Cellerne blev seriefortyndet sådan at de enkelte CFU kan skelnes og tælles. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Overlevelse kurven for diploid probiotiske gær. Antal levedygtige S. boulardii CFU som en procent af den samlede udpladede celler blev plottet for hver μJ dosis af UV-bestråling (optrukket linje). Den lodrette røde linje viser den μJ UV dosis svarende til 50% overlevelse af denne gærstamme. En rad1 S. cerevisiae mutant, som ikke kan reparere skader fra UV-mutagenese, er vist som en kontrol (stiplet linje). Klik her for at se en større version af dette tal. </ A>

Figur 3
Figur 3. Bekræftelse af ura3 - fænotype af UV bestrålet celler på YPD, uracil - og 5-FOA-plader Celler fra individuelle UV mutante kolonier blev opsamlet med spidsen af en steril tandstik og forsigtigt udstrøget på tværs YPD, uracil -., Og 5 -FOA plader. Celler blev først udstrøget i to vinkelrette krydsende linjer, så en ny tandstikker blev anvendt til at passere gennem den anden linje og fortsætte spredning celler indtil individuelle celler adskilt. En sand URA3 - mutant (mut) vokser på YPD medium og i nærvær af 5-FOA, men ikke i fravær af uracil. Kontrol ura3 - S. cerevisiae (ura3 -) og URA3 + sup> S. boulardii (URA3 +) er vist til sammenligning og bekræfte ordentlig forberedelse af gær medier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Transformation Effektivitet af Saccharomyces stammer. Vild typen S. boulardii (SB) og et laboratorium S. cerevisiae stamme (Sc) blev transformeret ved hjælp af den beskrevne LiOAc (LiOAc) og protokoller elektroporation (Electro). Resultater er afbildet som gennemsnit CFU opnået pr ug plasmid koder for en kanamycinresistens markør. Søjlerne viser middelværdien af ​​dobbeltforsøg med fejlsøjler afbilder standardfejlen på middelværdien.es / ftp_upload / 53.453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. funktionelt protein ekspression ved Transformeret gær. S. cerevisiae transformeret med tom plasmid (A) og plasmid koder for GFP (B) blev analyseret ved anvendelse af et fluorescerende mikroskop. Fluorescens i gærcellerne transformeret med GFP plasmid indikerer vellykket produktion af funktionel GFP. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Korrekt håndtering af en C57BL / 6 mus til oral sondeernæring. Musen er holdt tightly i den ikke-dominerende hånd med halen gemt under den lille finger, så at ingen bevægelse er mulig (A). Den sonde nål indsættes i svælget langs ganen. Musen er tilladt at sluge pære af sonde nål, lade opløsningen derefter ind i maven, da stemplet er trykket ned (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Forberedelse og dissektion af Peyerske plaques. Tyndtarmen er vist dissekeres væk fra de andre indre organer og væv, med pile peger på et par af de Peyerske plaques. Klik her for at se et større versipå denne figur.

Figur 8
Figur 8. Gær Recovery fra Peyerske plaques. Et eksempel på levedygtige CFU opdaget efter dissektion, homogenisering, og plettering af total Peyerske plak celler fra en mus tvangsfodret med S. boulardii. Celler blev udpladet på YPD gær medier og inkuberet ved 30 ° C i 2 dage. Typisk udbytte af CFU genvundet pr mus er mindre end 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammen protokollerne heri beskriver de væsentlige skridt, der er nødvendige for udvikling og afprøvning af auxotrofiske probiotiske gærstammer til levering af heterolog terapeutisk protein til tarmen. Denne manipulation og afprøvning af rekombinant probiotiske gær kræver teknikker og ressourcer, som enhver person laboratorium kan i øjeblikket ikke være bekendt. selvom mange tidligere undersøgelser har beskrevet ovenstående protokoller for flere gær og musestammer, disse metoder har således ikke til forfatternes viden blevet præsenteret i en detaljeret, samlet formular. Den foreliggende manuskript lægger særlig vægt på at tilpasse de nuværende standardiserede protokoller for genetisk manipulation af probiotiske gær, som er mindre godt karakteriseret end almindeligt anvendte laboratorie gærstammer. Mange trin for både mutagenese (omtalt i del 1) og transformation (del 2), skal være optimeret til manipulation af en sådan diploid, probiotiske gær isolates. Dette håndskrift diskuterer også potentielle faldgruber forbundet med håndtering af dyr (del 3) og dissektion af Peyerske plak immune væv i tyndtarmen (del 4).

Som mange industrielle og klinisk relevante gærstammer er ikke umiddelbart tilpasses til storstilet genetisk manipulation, er det først nødvendigt at generere stammer såsom auxotrofe mutanter, der kan dyrkes og udvælges uden dyre antibiotika. UV mutagenese er en sådan tilgang, der giver mulighed for hurtig uspecifik mutation af auxotrofe gener 7,41. Overlevelseskurver kan let genereres (figur 1 og 2) for at bestemme den passende dosis til screening mutanter. Men denne tilgang indebærer risiko for at inducere forbi mål mutationer, der kan påvirke vækstrate eller andre egenskaber af gærstammen. Målrettede knockouts kan i stedet frembringes under anvendelse af PCR-konstruktioner eller CRISPR / Cas9 system. Efterfølgende screening eller udvælgelse(Figur 3) af mutanter muliggør identifikation af auxotrof gær. Anvendelse af selektion ved udpladning på 5-FOA-medier, for eksempel, tillader hurtig fjernelse af enhver gær stadig indeholder en funktionel URA3 auxotrof gen. Når det er muligt, kan dette valg fremgangsmåde være at foretrække til en skærm, som kræver analyse af alle kolonier genereret. Med enten udvælgelse eller screening, er det imidlertid afgørende at udføre gentagne striber af individuelle gærkolonier på selektive medier for at bekræfte auxotrof status.

Transformation af de genererede mutanter kan opnås gennem forskellige protokoller. Selvom LiOAc transformation er effektiv i omdannelsen af mange gærstammer, især for de mest almindeligt anvendte laboratorium S. cerevisiae-stammer kan alternative protokoller såsom elektroporering omdanne andre gær-isolater med større effektivitet (figur 4). Hver ny stamme skal testes using flere protokoller til at bestemme de optimale betingelser for transformation. Varierende inkubationstider og koncentration af DNA, for eksempel, kan påvirke den samlede transformationseffektivitet og skal afprøves og optimeres for hvert stamme 33.

Oral sondeernæring muliggør levering af kontrollerede doser af disse rekombinante gær direkte til den murine mavetarmkanalen, hvis immune væv, kan derefter analyseres for gær og heterologt protein. Korrekt oral sondeernæring teknik (figur 6) er kritisk for at minimere dyr ubehag og forøge eksperimentel præcision. Desuden de Peyerske plaques er centrale sider for at vurdere optagelsen af ​​rekombinant gær fra tarmen. Disse klynger af immun væv er vigtige steder for antigen prøvetagning og induktion af slimhinder immunreaktioner. Store antigener, herunder gær 3-6 um i diameter, er mest tilbøjelige til at blive optaget af M-celler i Peyerske plaques for at krydse gastrointestinal epitel og interagere med immunceller. Der skal udvises forsigtighed, når dissekere de Peyerske plaques at sikre, at kun celler fra i plasteret snarere end tarmlumen eller lamina propria er indsamlet (figur 7). Skal også tages yderligere skridt efter dissektion for at vurdere korrekt udtryk og funktion af heterologt protein i den genvundne gær (figur 8). Fremstilling af totalt protein fra gær lysater og immunblotting er en standardmetode til vurdering af proteinekspression; Men denne fremgangsmåde ikke giver oplysninger om protein foldning og funktion. For at vurdere proteinfunktion, kan gær transformeres med et plasmid, der koder for GFP og analyseret under et fluorescensmikroskop efter helbredelse fra Peyerske plaques til at vurdere funktionel GFP-ekspression (figur 5).

I summen, dette manuskript præsenterer en samlet sæt detaljerede forsøgsprotokoller spænder skridt tilbagem generering af auxotrofe mutanter til inddrivelse af probiotiske gær fra murine tarmen. Ved at udarbejde protokoller, der ikke traditionelt falder inden for et enkelt område af ekspertise, vil disse beskrivelser lette yderligere undersøgelser test immunologiske reaktioner på probiotiske gær udformet som mundtlige drug delivery vektorer. Forfatterne håber, at dette studie vil tilskynde diskussion og fremme optimering af eksperimentelle metoder til hver gær testet stamme, baner vejen for de mest effektive metoder til udvikling af nye, probiotiske-baserede rekombinante behandlingsformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender finansiering gennem Børnenes Center for Immunologi og Vacciner og en NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) tildelt Tracey J. Lamb. Forfatterne også takke Natalya P. Degtyareva for den generøse bidrag rad1 S. cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73, (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9, (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41, (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32, (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5, (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23, (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153, (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1, (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30, (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8, (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49, (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34, (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38, (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197, (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118, (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14, (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67, (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13, (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1, (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71, (1), 312-319 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics