コンピュータ断層撮影法と頭蓋骨自家移植と同種移植片の統合を評価するために、骨形成、血管新生のカップリングの光イメージング

1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center
Published 12/22/2015
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Bioengineering

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Summary

自家および同種骨移植片の移植は、主要な頭蓋顔面骨損失を治療するための受け入れられたアプローチを構成します。まだ血管新生、細胞分化及び骨形成の間で相互にグラフト組成物の効果は不明です。我々は、移植片近傍での血管新生骨形成の相互依存を解明することを目的としたマルチモーダルイメージングのプロトコルを提示します。

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Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

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Abstract

骨移植手順の成功を決定する主要なパラメータは、移植片の周囲の血管新生です。我々は、骨自家移植片の移植が豊富な血管形成によってより大きな骨再生を誘導するという仮説を立てました。欠損部位での血管新生に対する移植片の効果を調べるために、我々は、新たに重合し、造影剤を用いた動物の全身潅流を伴う血管形成特徴付けるマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)アプローチを開発しました。この方法は、その全体の臓器の詳細な血管解析を可能にします。加えて、血液灌流は、血液由来の蛍光剤の蛍光イメージング(FLI)を用いて評価しました。骨形成は、ヒドロキシアパタイト標的化プローブおよびμCT分析を用いてFLIにより定量しました。幹細胞の動員は、オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスの生物発光イメージング(BLI)によりモニターしました。ここでは、説明し、同種移植片の準備、頭蓋冠の欠陥手術、血管新生の研究と骨(造影剤 in vivo灌流を含む)の形成分析、およびデータ分析のためのプロトコルのμCTスキャンプロトコルを示しています。

血管系の3次元高分解能分析は、特に細動脈の形成に関して、移植された自家移植片を有する動物において有意に高い血管形成を示しました。したがって、血液灌流は、手術後7 日目により自家群で有意に高かったです。私たちは優れた骨の石灰化を観察し、自家移植を受けた動物においてより大きな骨形成を測定しました。自家移植は、細胞が7 番目と10 番目の術後日の骨形成細胞に分化し、移植片-宿主骨の縫合糸に常駐幹細胞の動員を誘導しました。この知見は、強化された骨形成は、に起因し得ることを意味自家移植を特徴付ける増強血管給。図示の方法はしっかり有界骨形成及び新血管形成の点で骨再生を研究するための最適なツールとして機能することができます。

Introduction

外傷、腫瘍切除、減圧性開頭、先天性欠損に頭蓋顔面骨損失はほとんど自身で癒していないと明らかに満たされていない臨床上の必要性を提示します。自家骨移植片及び同種骨移植は、広くこれらの条件1を治療するために使用されます

それは広く、骨形成がしっかりと血管新生2,3に連結されていることが認められています。このように、骨再生のための提案された治療法の完全な研究は、全体の欠陥サイト全体に形成する血管樹の総合的な調査を含むべきです。研究モデルで血管新生を特徴づけるいくつかの利用可能な方法があります。血管樹は、組織学的分析によって調べることができます。組織学は、組織を切片に依存するので、結果として得られる画像は歪められる可能性が高いです。この問題に対処するために、生体内顕微鏡画像無傷血管4に対して行うことができます。しかしながら、この方法は一面の画像に限定されます。造影剤で灌流された動物から得た試料のμCTスキャンは、再生部位5を供給する血管網の3Dイメージングを可能にします。このアプローチは、全体として、臓器の血管系の非常に詳細なデモンストレーションのほか、血管分布の綿密な分析を可能にします。さらに、μCTは、血管の異なるサブタイプを特徴付ける血管の様々な直径との間の区別を可能にします。

私たちは、頭蓋冠自家移植片の移植は、同種移植片の移植よりも大きな血管新生を誘導し、この増加した血管新生は、我々は、様々な技術を採用し、この仮説を追求formation.To強化骨に、順番に、つながるという仮説を立てました。我々は、μCTベースの分析を実行することによって、新たに形成された血管樹のパターンを調べました。我々は、血液プールの蛍光プローブを用いて、血液灌流を測定しました。次に、ロバハイドロキシアパタイト指向プローブとμCT分析のFLIにより骨組織の石灰化をsedの。最後に、我々はルシフェラーゼオステオカルシン陽性細胞中で発現させたトランスジェニックマウスにおいてBLIを行い、幹細胞の動員および分化をモニターしました。

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Protocol

プロトコルは、エルサレムのヘブライ大学、イスラエル(リクエスト番号MD-12-13524-4)の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って、AAALAC承認施設、シーダーズ・サイナイ医療センターによってIACUC(リクエスト番号3770)。動物はNIHガイドラインを厳守で処理しました。

骨同種移植片の調製

  1. CO 2吸入または50μlのフェノバルビタール(65 mg / mlの.;を100mg / kg)を腹腔内注射の標準的な方法を用いて、レシピエントと異なる7〜8週齢のBALB / cマウス、または任意の株を安楽死させます。ハートビートが存在しないことを確認し、頚椎脱臼を行います。また、-20℃に保持し、収穫前に解凍された死体からの同種移植片を採取します。
  2. 髪の成長の方向に対してそれを適用し、バリカンを使用して頭蓋冠地域を剃ります。 70%を適用することにより、カーカス頭を駆除isopropanoリットル。第11号メスを用いて頭皮をカットし、骨膜を削除します。
  3. 歯科用ドリルおよび4.5 mmの内径トレフィンを使用して、頭蓋冠骨の円形断片を切り離します。滅菌生理食塩水を含む100 mmのプラスチック皿に骨片を転送します。この時点で、血液や骨の断片( 図1A)に接続されている軟組織を観察します。 22ドナーから、このように骨片を入手します。
  4. 曲がったピンセットを使用して、一度に1つの骨の断片を保持します。それは徹底的に綿を使用した綿棒は、アプリケーターをひっくり返し、任意の脳組織、軟組織、および血液( 図1B)を削除します。静かに移植片が完全な丸みを帯びた形状を有するように、細かいハサミを使用して移植片に付着したまま任意の骨片を切り取ります。
  5. エタノールを洗浄するリン酸緩衝生理食塩水を含む15 mlチューブに一回、70%エタノールを含む15 mlチューブ中で二回、各移植片を浸します。
  6. ためのクリオチューブに、-80℃の冷蔵庫で同種移植片を凍結少なくとも1週間。この時点で、同種移植片は、( 図1C)透明に見えることを確認してください。

2.頭蓋冠の欠陥手術

  1. 受信者のためにオステオカルシンプロモーター6の制御下でルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスを使用しています。
  2. 30秒間、ガラスビーズヒーターを用い手術器具の先端を滅菌します。無菌状態を維持するために、70%のイソプロパノールを含む瓶にツールを転送します。滅菌手袋を使用してください。
  3. (それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg)、ケタミンメデトミジン混合物の腹腔内注射により7〜8​​週齢の雌マウスを麻酔。それが深く麻酔されていることを確認するために、動物の四肢をピンチ。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻し無人まで動物を放置しないでください。
  4. 毛髪成長の方向に対してそれを適用することによって、バリカンを使用して頭蓋冠領域を剃ります。任意の毛皮の残骸を削除し、AFTEそれを拭くために脱毛クリームを適用しますR生理食塩水に浸したガーゼが続くドライガーゼを使用して、もはやより2分。ケアは、目にそれを避けるために注意すべきです。代替的に、獣医の眼軟膏、眼の保護の追加の層のような従来の脱毛にも適用することができます。これは、脱毛クリームのすべてのトレースは、化学物質への過度の露出から可能な刺激を避けるために削除されることが不可欠です。 5%のクロルヘキシジン( 図1D)を適用することによって頭皮の殺菌。
  5. 皮下に5 mgの/ kgのカルプロフェン200μlの生理食塩水で希釈した注入します。乾燥を防ぎ、常に熱パッドの上に動物を維持するために獣医の眼軟膏を適用します。オペレーティング双眼鏡の下で動物を置きます。
  6. 細かいハサミやピンセット( 図1E)を使用して、頭皮で1センチの長楕円形のカットを行います。曲がったピンセットを使用して骨膜を持ち、細かいハサミを使用して切り取ら。
  7. 歯科用ドリルaを使用してラムダ縫合の頭蓋冠の欠陥2mmの前方にドリルND 5 mmの外径のトレパン( 図1F及びG)。硬膜の浸透を回避するために、骨の中に道の四分の三をドリルし、スパチュラを用いて骨片を切り離します。
  8. 自家移植片を移植するために、骨の断片を取得し、破片を除去するために10ミリリットルに滅菌生理食塩水を含む10ミリメートルプラスチック板でそれを洗います。軟組織を削除しないでください。 、同種移植片を移植事前に同種移植片を解凍し、RTにそれを正規化し、それを洗浄します。
  9. それは欠陥マージン( 図1H)には触れないように曲がったピンセットを用いた欠陥に骨移植片を配置します。フィブリンゲル(25 U / mlのトロンビンを5μlと混合し46 mg / mlのフィブリノーゲンの5μl)を使用して、ホスト骨に移植片を接着。
  10. 4-0ビクリル縫合糸( 図1I)を用いて皮膚を縫合。外科的なカットにポビドンヨードを適用します。ケアは毛皮によって縫合糸の汚染を防止するために取られるべきです。マークマウスの耳と0.25ミリグラム/キログラムAntisedanトンを注入すると、Oメデトミジンの麻酔効果を逆転させます。
  11. 動物が10分で目を覚ますない場合、それは温めパッドの上に位置していることを確認してください。滅菌生理食塩水200μLを注入し、および0.1mg / kgのAntisedan注入必要に応じて。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
  12. 縫合糸を開くのを防ぐために、週ごとに分離ケージの動物を保管してください。数日後にオペアンプのためのケージの床の上にシャーレに水に浸したマウス飼料を置きます。皮下に外科手術後の痛みを治療するための手術後3日間一日一回、滅菌生理食塩水で希釈した1mgの/ mlのカルプロフェン溶液200μlを注入します。

図1
図1頭蓋冠同種移植片の調製および頭蓋冠欠損は外科。骨片は、頭蓋冠の領域(A)から単離されます。軟組織、骨髄、及び血液が(B)消毒され、移植片は、リン酸緩衝生理食塩水(C、AG =同種移植片)で2回洗浄し、続いて70%エタノールで洗浄します。レシピエントマウスは、頭蓋冠領域(D)にシェービング及び皮膚を消毒することにより手術のために準備されます。楕円形のカットは、頭皮に作成され、骨膜の(E)を除去します。次いで、頭蓋冠欠陥が5 mmの直径のトレフィン(F)を使用して穿孔されます。骨片は、インタクト上矢状静脈洞(G)を残して、スプーン状のへらを用いて取り外されます。同種移植片は、その後、欠陥に入れ、フィブリンゲル(H)を使用して固定されています。最後に、皮膚は(I)縫合される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

の特性3.マイクロコンピューター断層撮影血管樹

  1. ヘパリン添加生理食塩水を準備します。重量2,000 Uのヘパリンナトリウム及び50mlのプラスチックチューブに入れてください。 20ミリリットルの生理食塩水を加え、よくチューブを振ります。 15mlで20 mlのルアーロックシリンジを記入し、ヘパリン化生理食塩水を温め、23-Gの頭皮静脈セットに注射器を接続します。シリンジポンプにシリンジを貼付し、1ml /分で10ミリリットルをポンプに設定します。
  2. 50μlのフェノバルビタール(65 mg / mlの.;を100mg / kg)を腹腔内注射を用いて落ち着いたマウス。それは深く鎮静されていることを確認する動物の四肢をピンチ。吸収性の表面ライナー( 図2A)で包まれた固定板にその背中の上でマウスを固定します。ヒュームする職員の暴露を防止するために、ドラフト内で固定されたマウスを置きます。
  3. 細かいハサミやピンセット( 図2B)を使用して、首に腹部から皮膚をカットします。剣状突起( 図2C)まで腹壁をカットします。その外側面に沿って肋骨をカットします。肺負傷は避けてくださいDの心、と心が完全に露出していることを確認します。胸骨( 図2D)を後退させるように止血剤を使用してください。
  4. 翼状針を左心室( 図2E)に3ミリメートルを挿入します。 3秒の接着剤( 図2F)を用いて心臓や胸壁に針を接着。
  5. すぐにポンプを起動します。分後、血管系( 図2G)を減圧するために、下大静脈を解剖。液体が離れて頭から流れるようにボードを傾けます。成功した灌流は、肝臓や血管をクリアすることになります。
  6. ヘパリン化生理食塩水潅流が完了すると、4%のホルムアルデヒドを10mlの灌流。血管系に気泡の侵入を避け、ホルムアルデヒド煙への暴露を避けます。成功ホルムアルデヒド灌流は、尾の硬化になります。 10ミリリットルのヘパリン化生理食塩水でホルムアルデヒドを洗い流します。
  7. manufactに係る電波不透明な造影剤を準備しますurer命令。典型的には、化合物の混合、希釈剤、及び硬化剤を必要とします。血清学的ピペットを使用し、15ミリリットルのプラスチックチューブ内の溶液を混ぜます。
  8. 1ml /分の速度での造影剤の混合物を用いて動物を灌流。 冠状動脈、腸と肝臓の血管を観察し、彼らは2の灌流後に黄変していることを確認します-成功した灌流( 図2H)を示す 、3ミリリットル。潅流が完了すると、バタフライ針のチューブを切断し、単独でカーカスを取得し、頭蓋冠の領域への溶液の漏出を防止するために、トイレットペーパーでそれを包みます。 4°のCO / Nで重合を許可します。
  9. 頭蓋冠地域( 図2I)を解剖。まず関心の頭蓋領域に損傷を避け、できるだけ横の皮膚をカットするメスを使用しています。骨移植を見つけて、10ミリメートル離れてグラフトから頭蓋骨をカットする細かいハサミを使用しています。
  10. 孤立calvをスキャンμCTスキャナーを使用して、MS Pゴシック、骨のサンプル。 200ミリ秒の360°と統合時間1,000投影を使用して、20.5ミリメートル、55のkVpのX線エネルギー、145μAの強度に視野を設定します。画像他の骨欠損モデルにμCTパラメータ7を調整します。
  11. μCTソフトウェアによって生成された2次元再構成されたスライスを観察します。関心領域が適切でスキャンし、頭蓋冠の欠陥を見つけていることを確認してください。灌流の品質を評価します。血管の同定に成功し (図2J)した後、蒸留水(DDW)中に希釈し、6%トリクロロ酢酸(TCA)を用いて、サンプルを継続し、脱灰。
  12. 3.10に示したパラメータを使用してサンプルを再スキャンします。再構成された2次元スライスでラムダ縫合の位置を確認します。 2ミリメートルと直径8mmの高さに関心の円筒ボリューム(VOI)を定義し、それは、縫合糸に接する - これは、欠陥の解剖学的部位です。
  13. セグメント番目グローバルしきい値の手順を使用して、軟組織からの電子の骨組織。部分的にボリュームのノイズを抑制するために130に低いしきい値を設定し、制約3Dガウスフィルタを適用します(シグマ[σ] = = 2 2.0およびサポート)。 ( 図2K)の3D再構成を生成し、VOIが適切に配置されていることを確認します。
  14. IPLソフトウェアと「dt_object_param」機能( 図2L)を使用して、厚さマップを生成します。
    注:この機能は、各血管径のための容器容積について説明します。

図2
心臓のアプローチを介して、放射線不透過剤を用いて、図2は、灌流マウスは、固定板(A)に固定され、そして皮膚を首(B)の腹部までに沿って切断されます。腹壁は、剣状突起proceに内側のラインアップに沿って切断されますSS(C)、および胸郭の横方向(D)に切断されます。バタフライ針(Eは 、右心室を白い点線で示されている)は著しく暗くなる右 ​​心室への挿入を回避し、左心室に挿入され、針が心臓と胸部壁に固定されている(F) 。ヘパリン化生理食塩水(2-3 ml)を心に圧送され、下大静脈を切開し(G、白い矢印は、下大静脈を示します)。ホルムアルデヒド(4%)を灌流し、洗い流されています。この黄色染色放射線不透過性造影剤の灌流が続きま​​す。成功した灌流は、(H)色を黄色に変更する血管のクリアランスにより明らかであろう。重合後、頭蓋冠領域が( 、AGは=同種移植片)を単離して、(Jは 、目的のボリュームがオレンジ色でマークされた)適切な灌流を確認するためにμCTスキャナーを用いて画像化されます。ザ・サンプルは色の厚さマップ(L)の生成に続いて、脱灰と再スキャン(K)である。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

骨石灰化と血液灌流の4蛍光イメージング

  1. 1.5mlチューブ中で2ナノモル/100μlのPBSの濃度(血液灌流を測定するために、骨の石灰化と血液由来蛍光剤を監視するために、ビスホスホネート抱合蛍光プローブを使用)にプローブを再構成します。プローブの均一な溶解を確実にするために静かに数回ピペット。
  2. 指定されたイメージングセッションの24時間前には時間がゼロの画像を撮ります。誘導室中3%イソフルランで補充100%医療グレードの酸素の2リットル/分の吸入を使用して3匹のマウスを麻酔。 2 - 適切な麻酔は、確立された後、1.5%のイソフルラン濃度を下げます%。
  3. 獣医の眼軟膏は乾燥を防止し、サーマルパッドを常時オンにされていることを確認するために適用します。それが深く麻酔されていることを確認するために、動物の四肢をピンチ。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻し無人まで動物を放置しないでください。
  4. 髪の成長の方向に対してそれを適用するバリカンを使用して頭蓋冠地域を剃ります。脱毛クリームを使用して、毛皮の残りを削除します。任意の毛皮の残骸は、光学イメージングを妨害します。細かいハサミとピンセットを使用して縫合糸を取り外します。
  5. IVISステージに3匹の動物を置き、各イメージングセッションのために37℃に温めました。 、autoに露光時間を設定し、Cにフィールドを表示したり、フィルタを調整します。 例えば、680ナノメートルの光の波長で最大の励起で特徴付けビスホスホネート抱合蛍光プローブのために、675 nmでの励起フィルターとのCy5.5の発光フィルターを使用します。同様に、光の波長でピーク励起で750nmでの血液由来蛍光剤を使用した場合710 nmでの励起フィルターおよび780nmでの発光フィルターを使用しています。
  6. 画像「取得」ボタンを押して、Imageソフトウェアリビングを通じてマウス。頭蓋冠の領域は、総合的なガイドアドバイスリム 2009年の場合( 図3B)完全に表示されていることを確認します。
  7. マウスは、100%の酸素を吸入目覚めを許可します。
  8. 静脈尾の注射を介して、2 nmolの蛍光プローブを注入します。上記のように指定されたイメージングセッションでは、撮影を行います。

骨再生のための5マイクロコンピュータ断層撮影法

  1. 4.3 - 骨形成の定量化のために、ステップ4.2に示すように、3%のイソフルランの吸入によりマウスを麻酔。 μCTスキャナーベッドにマウスを転送し、スキャナに配置します。
  2. 145μA中解像度の55のkVpと強度にμCTスキャナのX線管ポテンシャルエネルギーを設定します。 20.5ミリメートルの視野を使用して、実行しますスカウト(単一のX線)は、頭蓋骨の背面にマウスの目から延びる関心領域をスキャンして定義します。千360°ごとの予測と200ミリ秒の積分時間を使用して、CTスキャンを実行します。
  3. 20ミクロンの名目空間分解能を用いて、2次元スライスを再構築。 μCTソフトウェア9を使用して標準化された位置に欠陥マージンを合わせます。
  4. 同様に、3.20ステップ興味のある円筒形のボリュームを定義し、制約3Dガウスフィルタを適用する(σ= 0.8とサポート= 1)が部分的にボリュームのノイズを抑制します。セグメントグローバルしきい値処理手順を使用して、軟組織の骨組織。
  5. 関心体積における石灰化した骨組織の量を決定します。

幹細胞動員と分化の6生物発光イメージング

  1. セクション4.2から4.4に示すように、撮像のためにマウスを準備し、100%酸素の吸入によってマウスに目を覚まし。
  2. 1の管理26ミリグラム/腹腔内注射を介して各マウスにキロカブトムシルシフェリン、および誘導室に動物を返します。 2分後、3%イソフルランを用いて動物を麻酔。 IVIS温めステージ上でマウスを置きます。
  3. Imageソフトウェアリビングを経由して、露光時間を「オート」とC.イメージに視野ルシフェリン投与後のマウス5分に設定してください。導入遺伝子の発現は、マウスとの間で変化するので、画像の「生物発光」のモダリティを用いて、ステップ4.6に示されるように、動物は、関心領域を定義します。末尾に頭蓋冠信号を正規化します。

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Representative Results

血管新生は、血液灌流を定量化するために、蛍光血液由来物質を用いたμCT容量分析によって、およびFLIにより評価しました。七日手術後、μCTスキャンは、C57BL / 6( 図3A)から採取した同種移植を受けたマウスに比べて自家移植を受けたマウスにおける中小口径血管の有意に高い容量を示しました。興味深いことに、自家移植片グループに新たに形成された血管樹は、同種移植群におい​​て血管が外縁から欠陥部位を貫通するように見え、限られた程度まで内向きに延び、一方、全体の欠陥領域に達するように見えました。 FLIは自家処理動物において有意に高い血液灌流( 図3B)を示す 、この観察を支持しました。 14 日目では、同種移植群では血管樹は、グラフトの近接性のすべてに達し、まだ容器容積は、比較有意に低かったです我々が調べたほとんどの血管径の自家グループ( 図3C)へ。注:0.08- 0.1 mmの直径を有する血管を比較したときに容器容積の差が最も顕著でした。 28日手術後血管系のボリュームは、ベースライン( 図3D)に戻りました。

七日手術後、FLIは、ヒドロキシアパタイト指向プローブを使用して行う自家グループ( 図4A)で有意に高い骨の石灰化を実証しました。その時までに、骨は、自家移植動物における移植片近接を通じて形成されました。これとは対照的に、同種移植片移植マウスにおける骨が欠陥のみマージンで形成されたリング形状によって示されました。骨形成のボリュームは、μCT分析( 図4B)を行うことにより 、再生プロセスの終点で、56日目、手術後に定量しました。骨量は、( 図4C)が有意に高かったとグラフトTHI自家移植片( 図4D)を受けた動物において有意に大きくckness。 BLIは、骨芽細胞系統( 図4E)に向かって幹細胞の動員および分化を監視するためのオステオカルシンルシフェラーゼトランスジェニックマウスを使用しました。頭頂骨で測定された信号は、末尾に測定されたものよりも15倍高かったときに、手術後7日 - 同種移植片を移植したマウスでは、BLI信号が4をピークに達しました。 10日手術後、および2倍高い頭蓋冠-尾比( 図4F)に達する 、有意に高かった-自家移植マウスでは、BLI信号が7、少し後ピークに達しました。

図3
図3.自家移植片の移植が容易血管新生。頭蓋冠の欠陥は、マウスで作成されました。動物の半分は、同種移植を受け、残りの半分は自家を受けました。ザ・マウスを7日目、手術後重合造影剤で灌流しました。頭蓋冠の領域を単離し、そしてサンプルを脱灰し、そしてμCTスキャナを用いて画像化しました。体積厚みマップはIPLソフトウェア使用して生成された(A、N = 3を、バーは±SEを表し、アスタリスクは、P <0.05を示します)。マウスは、6日目、手術後の蛍光血液由来プローブを注射しました。 24時間後、動物はFLIに供し、定量分析を行った(B、N = 5、バーは±SEを表し、アスタリスクは、P <0.05を示す)。れましたμCTベースの血管解析を実施した14(C)及び28(D)日手術後。:(CとDのn = 3、バーは±のSE表し、アスタリスクは、P <0.05を示す) 拡大表示するにはここをクリックしてくださいVEのこの図のrsion。

図4
自家移植片の図4.移植は同種移植のより骨形成より注入を促進する。マウスは、頭蓋冠自家または同種移植片の移植を受けました。マウスを、6日後、手術後のIV注入によってヒドロキシアパタイト標的プローブを注射しました。 FLIおよび定性分析を行った24時間後(A、N = 5、バーは±SEを表し、アスタリスクは、P <0.05を示す)。 インビボ μCT分析は、56日目、手術後に行われ、関心のある円筒状の容積を用いてマークしましたオレンジ(B)としました。 DRIルシフェラーゼを発現する骨量(C)及びグラフト厚さ(D)を定量した(N = 8、バーは±SEを表し、アスタリスクは、P <0.05を示す).TransgenicマウスオステオカルシンプロモーターによってVEN同種移植片または自家与えました。 BLIは、10日手術(E)の後に、ならびに追加の指定された時点で行いました。頭蓋冠の領域に測定された信号は、発現レベルがマウスの間で変化するので(F、N = 8、バーは±SEを表し、アスタリスクは、P値<0.05を示す)標準化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明したマルチモーダルイメージングのアプローチの目的は、頭蓋骨移植の文脈における血管新生骨形成軸の細心の調査を可能にすることです。血管新生は、全体の頭蓋欠損を供給する血管樹の正確な高解像度の3Dデモを許可μCTプロトコルを用いて画像化しました。 μCTデータは容易にそのようなIPLソフトウェアなどの高度なツールを用いて分析することができます。例えば、 図3(c)に示す厚さ分析が頭蓋自家および同種移植片との間の主な違いは、0.1から血液動脈10を特徴付ける直径0.08ミリメートルの範囲の血管内にあることが明らかになりました。この結果は、長骨モデル11で行われた研究と一致しています。これは、0.02ミリメートル直径の狭い検出可能な血管が完全に起因放射線不透過剤の粘度にキャストされていないことに留意すべきです。この方法の主な欠点は、それが伴うという事実であります動物の安楽死、ひいては縦撮影が不可能です。いくつかの放射線不透過性プローブは、in vivoでの血管μCTイメージングのためにご利用いただけます。しかしながら、それらは、放射線不透過性の緻密な重合プローブとしてとしてではなく、画像の解像度は、ここで示されている12 エクスビボの方法によって提供されることを満たしていません。 μCT解像度が制限され、例えば、毛細血管を研究するのに有用ではないだろう。巧みな手で助けられ、それ以外は、この方法を具体的に骨の血管系を研究するための再現可能な技術を提供しています。

描かれたプロトコルで1つの重要なステップは、欠陥位置(ステップ2.7)の決意です。ラムダ縫合の損傷は大量出血につながります。頭蓋冠の欠陥を掘削する場合、注意が下っ端硬膜と上矢状静脈洞を破壊しないように注意すべきです。最後に、左心室に翼状針の挿入は、繊細な手順(ステップ3.4)です。針が挿入される場合edは、右心室に、造影剤は、肺を灌流し、頭蓋冠の貧しい灌流につながる静脈に移動します。針が過度に深く挿入されている場合には、後心臓壁を穿孔します。針が十分挿入されていない場合、それは容易に心臓から引き裂くことができます。あなたが潅流を妨げる可能性針位置を再調整しようとしないでください。この方法は、利用可能な蛍光プローブのセットを使用して変更することができます。カテプシンK標的プローブは、破骨細胞活性を定量するために使用することができるが、インテグリンα3βV -targetedプローブは、新たに形成された血管を強調するために使用することができます。

我々の仮説に従って、我々は、頭蓋冠の自家移植は同種移植片よりも高い骨形成能を有していることを観察しました。これは、同様に長骨13真実であり、いくつかの要因に起因し得ます。まず、自家移植片は、移植片全体の骨基質を生産する骨形成細胞を含み、表面、鉱化指向FLI( 図4A)に証明されるように、同種移植片のに対し、欠陥のみマージンで希少な骨形成を誘導します。第二に、オステオカルシン-LUCマウスのBLIは、同種移植片準備処理( 図4F)において除去される成長因子の存在によって説明することができる自家移植片グループで多くの骨形成活性を示しました。興味深いことに、骨の石灰化は、ヒドロキシアパタイト標的プローブを投与した日6,7、で有意に高かった、とBLIの活動に代表される細胞の分化は、後に明らかになった、より広範なことを7日目と10日目の間に我々は、このことから推測することができます骨の石灰化は、少なくとも部分的に自家骨移植を特徴付ける良好な脈管構造によって説明することができます。

我々の結果は、自家移植片は、優れた骨形成能を有することを示します。しかし、一つは自家骨移植は、いくつかのDRAを持っていることを考慮に入れる必要がありますwbacks。骨収穫量で制限され、ドナー部位14-16に罹患率を伴います。また、骨自家移植片の再吸収の発生率は17-19無視できません。同種移植は非常に利用可能であり、臨床医のための既製のソリューションを提示します。いくつかの作品は、頭蓋同種移植片の骨統合はBMP2をコードするアデノ随伴ウイルス20,21と同種移植片をコーティングするから、このような断続的な副甲状腺治療22と補助療法に至るまで、様々な手段によって高めることができる方法を実証しました。骨とマージする同種移植片の能力が完成したら終わりでは、同種移植片は、好ましい移植材料となります。

これらの結果に照らして、特定の関心は、骨再生の部位で血管新生を調節する方法の問題にあります。形成血管が漏出性であり、functiを形成しないよう過剰発現VEGFの直接的なアプローチは、非効率的な発見されましたonalネット23,24。興味深いことに、それは、BMPシグナル伝達は、血管25,26の目標形成をもたらすことが見出されました。また、薬剤11及び細胞療法27は、骨移植片近傍における血管形成パターンを変化させることが示されました。両方の頭蓋骨欠損治癒を向上させるために現在の有望な戦略に近づきます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

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