Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center
Published 12/22/2015
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Bioengineering

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Summary

Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.

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Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

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Abstract

Um parâmetro importante que determina o sucesso de um procedimento de enxerto ósseo é vascularização da área circundante ao enxerto. Nossa hipótese é que a implantação de um enxerto ósseo induziria maior regeneração óssea por formação de vasos sanguíneos abundante. Para investigar o efeito do enxerto sobre a neovascularização no local do defeito, desenvolvemos uma tomografia (μCT) abordagem computadorizada de micro para caracterizar recém-formando vasos sanguíneos, o que envolve a perfusão sistêmica do animal com um agente de contraste de polimerização. Este método permite uma análise detalhada vascular de um órgão na sua totalidade. Além disso, a perfusão de sangue foi avaliado usando imagiologia de fluorescência (ILF) de um agente fluorescente transmitida pelo sangue. A formação óssea foi quantificada por FLI usando uma sonda segmentadas por hidroxiapatita e análise μCT. O recrutamento de células estaminais foi monitorizada por meio de imagem de bioluminescência (BLI) de ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina.Aqui descrevemos e demonstrar a preparação de aloenxerto, cirurgia defeito calvária, protocolos de digitalização μCT para o estudo neovascularização e análise da formação óssea (incluindo a perfusão in vivo de agente de contraste), e o protocolo para a análise de dados.

A análise de alta resolução da vasculatura 3D demonstraram significativamente maior a angiogénese em animais implantados com autoenxertos, especialmente no que diz respeito à formação das arteríolas. Assim, a perfusão de sangue foi significativamente maior no grupo de auto-enxerto pelo dia após a cirurgia. Observou-se a mineralização do osso superior e formação óssea maior medido em animais que receberam autoenxertos. Implantação autotransplante residente induzido recrutamento de células-tronco para a sutura do enxerto ósseo-hospedeiro, em que as células diferenciadas em células formadoras de osso entre o 7º e 10º dia pós-operatório. Esta descoberta significa que a formação óssea aumentada pode ser atribuída aa alimentação vascular aumentada, que caracteriza o implante auto-enxerto. Os métodos apresentados poderão servir como uma ferramenta ideal para estudar a regeneração óssea em termos de formação de osso bem delimitada e neovascularização.

Introduction

Perda óssea devido ao trauma craniofacial, a ressecção do tumor, craniotomia descompressiva, e defeito congênito raramente cura por si só e apresenta uma necessidade clínica não satisfeitas clara. Enxertos ósseos autólogos e alogênicos enxertos ósseos são amplamente utilizados para tratar estas condições 1.

É amplamente aceito que osteogênese é intimamente ligado com a angiogênese 2,3. Assim, o estudo completo de uma terapia proposta para regeneração óssea deve incluir uma investigação exaustiva da árvore vascular formando ao longo do sítio do defeito completo. Existem vários métodos disponíveis para caracterizar a vascularização em modelos de pesquisa. A árvore vascular pode ser investigado por análise histológica. Desde histologia depende de seccionamento de tecidos, existe uma alta probabilidade de que a imagem resultante será distorcida. Para resolver este problema, microscopia intravital pode ser realizada para vasos sanguíneos imagem intacta 4; No entanto, este método élimitado a um plano de imagem. μCT digitalização de espécimes provenientes de um animal perfusão com agente de contraste permite imagens em 3D da rede vascular que alimenta o local de regeneração 5. Esta abordagem permite uma demonstração altamente detalhada da vasculatura de um órgão como um todo, assim como uma análise minuciosa de distribuição dos vasos sanguíneos. Além disso, permite a diferenciação entre μCT diâmetros variados de vasos sanguíneos, que caracterizam os diferentes subtipos de vasos sanguíneos.

Nossa hipótese é que a implantação de um auto-enxerto calvarial irá induzir maior neovascularização do que a implantação de um aloenxerto, e este aumento da neovascularização levará, por sua vez, para o reforço da osso formation.To perseguir essa hipótese nós empregamos uma variedade de técnicas. Foram investigados os padrões da árvore vascular recém-formada através da realização de uma análise baseada em μCT. Medimos perfusão sanguínea utilizando uma sonda fluorescente sangue-piscina. Em seguida, nós burrosmineralização do tecido ósseo sed por FLI de uma sonda dirigida por hidroxiapatita e análise μCT. Finalmente, monitorizada recrutamento de células estaminais e diferenciação, realizando BLI em ratinhos transgénicos em que a luciferase é expressa em células de osteocalcina-positiva.

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Protocol

O protocolo segue as diretrizes do cuidado com os animais institucional e uso comissão (IACUC) da Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel, uma instalação AAALAC aprovado (Request MD-12-13524-4 No.), e pelos Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request No. 3770). Os animais foram tratados de adesão estrita às diretrizes do NIH.

1. Preparação de aloenxertos de osso

  1. Eutanásia de 7 a 8 semanas de idade, os ratinhos Balb / C, ou qualquer outra estirpe do receptor, utilizando o método padrão de CO 2 inalação ou injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confirmar a ausência de um piscar de olhos e executar deslocamento cervical. Como alternativa, colher os enxertos de cadáveres que foram mantidos em temperatura de -20 ° C e descongeladas antes da colheita.
  2. Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo, aplicando-o contra a direção do crescimento do cabelo. Desinfectar a cabeça da carcaça através da aplicação de 70% isopropanoeu. Corte a pele do couro cabeludo utilizando um bisturi nº 11 e remover o periósteo.
  3. Usando uma broca de dentista e uma trefina de diâmetro interno de 4,5 mm, retirar um fragmento circular do osso calvarial. Transferir o fragmento de osso a um prato de plástico de 100 mm contendo solução salina estéril. Neste ponto, observar sangue e do tecido macio ligado ao fragmento de osso (Figura 1A). Obter fragmentos de ossos deste modo a partir 22 dadores.
  4. Segure fragmento de um osso de cada vez, usando uma pinça curvas. Swab-lo cuidadosamente, com algodão aplicador derrubado e remover qualquer tecido cerebral, tecidos moles, e de sangue (Figura 1B). Suavemente cortar as lascas de osso que permanecem ligados ao enxerto utilizando uma tesoura fina de modo que o enxerto vai ter uma forma arredondada perfeito.
  5. Mergulhar uma vez cada enxerto em um tubo de 15 ml contendo 70% de etanol e duas vezes em tubos de 15 ml contendo solução salina tamponada com fosfato para lavar o etanol.
  6. Congelar os aloenxertos num -80 ° C em tubos criogénicos frigorífico durante pelomenos 1 semana. Neste ponto, certifique-se os enxertos parecem transparentes (Figura 1C).

Cirurgia 2. calvarial Defeito

  1. Para usar receptores ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina 6.
  2. Esterilizar as pontas dos instrumentos cirúrgicos usando um aquecedor de esferas de vidro durante 30 segundos. Transferir as ferramentas para um frasco contendo 70% de isopropanol para manter as condições estéreis. Use luvas estéreis.
  3. Anestesiar uma de 7 a 8 semanas de idade, fêmea de ratinho por injecção intraperitoneal de uma mistura ketamine- medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, respectivamente). Comprima o membro animal para se certificar de que está profundamente anestesiados. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
  4. Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo, aplicando-a contra a direção do crescimento do cabelo. Aplique o creme de depilação para remover quaisquer vestígios de pele e limpe-after não mais do que 2 minutos utilizando uma gaze seca seguido por solução salina gaze embebida. Cuidados devem ser tomados para evitar que ele nos olhos. Alternativamente, a pomada veterinário olho pode ser aplicado antes da remoção do cabelo como uma camada extra de proteção para os olhos. É imperativo que todos os vestígios do creme depilatório ser removida, a fim de evitar uma possível irritação da exposição excessiva ao agente químico. Desinfectar o couro cabeludo pela aplicação de 5% de clorexidina (Figura 1D).
  5. Injectar por via subcutânea de 5 mg / kg carprofeno diluída em 200 ul de solução salina. Aplicar veterinário pomada para evitar a secura e manter o animal sobre uma almofada térmica em todos os momentos. Posicione o animal sob os binóculos que operam.
  6. Faça um corte oval de 1 cm de comprimento na pele do couro cabeludo usando tesoura fina e pinças (Figura 1E). Segure o periósteo, usando uma pinça curvas e cortar com uma tesoura fina.
  7. Perfurar o calvarial defeito 2 milímetros anterior à sutura lambdoid usando uma broca dental umnd um trephine exterior diâmetro de 5 mm (Figura 1F e G). Para evitar a penetração da dura-máter, perfurar três quartos do caminho para o osso e retire o fragmento ósseo usando uma espátula.
  8. Para implantar um auto-enxerto, recuperar o fragmento ósseo e lavá-lo em uma placa de plástico 10 milímetros contendo 10 ml de solução salina estéril para remover detritos. Não remova os tecidos moles. Para implantar um aloenxerto, descongelar previamente um aloenxerto e normalizar para a TA, e, em seguida, lavá-lo.
  9. Coloque o enxerto ósseo no defeito, usando uma pinça curvas para que ele não toque nas margens do defeito (Figura 1H). Cole o enxerto ao osso hospedeiro, utilizando gel de fibrina (5 ul de 46 mg / ml de fibrinogénio misturados com 5 ul de 25 U / ml de trombina).
  10. Suturar a pele usando 4-0 vicryl sutura (Figura 1I). Aplicar iodopovidona para o corte cirúrgico. Cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação da sutura por pele. Marque a orelha de rato e injetar 0,25 mg / kg Antisedan to reverter o efeito anestésico da medetomidina.
  11. Se o animal não acordar de 10 min, verifique se ele está situado em uma almofada aquecida. Injectar 200 ul de soro fisiológico estéril, e, se necessário Injectar 0,1 mg / kg Antisedan. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que totalmente recuperado.
  12. Manter os animais em gaiolas separadas por uma semana, para evitar que as suturas de abertura. Coloque comida do mouse embebido em água em uma placa de Petri no chão da gaiola por alguns dias de pós-operatório. Injectar por via subcutânea de 200 ul / ml de solução de 1 mg carprofeno diluída em solução salina estéril, uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para tratar a dor pós-cirúrgica.

figura 1
Figura 1. Preparação de calvária aloenxerto e calvárias Defeito cirurgia. O fragmento de osso é isolado a partir da região de calvária (A). Tecido macio, Medula óssea, e sangue são esfregadas (B), e o enxerto é lavado em etanol a 70%, seguido de duas lavagens em salina tamponizada com fosfato (C, AG = aloenxerto). O mouse destinatário está preparado para a cirurgia pelo barbear e desinfecção da pele na região calvarial (D). Um corte de forma oval é criada na pele do couro cabeludo, e do periósteo é removido (E). Em seguida, o defeito de calvária é perfurado utilizando um trépano de 5 mm de diâmetro (F). O fragmento de osso é separada usando uma espátula em forma de colher, deixando o seio sagital superior intacta (L). O aloenxerto é então colocado no defeito e protegidas utilizando gel de fibrina (H). Finalmente, a pele é suturada (I). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Micro-Tomografia Computadorizada para Caracterização deÁrvore Vascular

  1. Preparar solução salina heparinizada. Peso 2.000 U de heparina sódica e coloque-o no tubo de 50ml de plástico. Adicionar 20 ml de solução salina e agite bem o tubo. Encha a 20 ml seringa Luer lock com 15 ml aquecido salina heparinizada e conecte a seringa a um conjunto veia do couro cabeludo 23-G. Apor a seringa a uma bomba de seringa, e configurá-lo para bombear 10 ml a 1 ml / min.
  2. Sedar um rato utilizando uma injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Comprima o membro do animal para se certificar de que está profundamente sedado. Prenda o mouse sobre a sua volta para uma placa de fixação envolvido com um revestimento de superfície absorvente (Figura 2A). Posicione o mouse fixado em um exaustor para evitar a exposição pessoal a fumaça.
  3. Cortar a pele do abdômen ao pescoço com uma tesoura fina e pinças (Figura 2B). Corte a parede abdominal até o apêndice xifóide (Figura 2C). Corte as costelas ao longo da sua face lateral. Evitar ferir os pulmões umcoração d, e certifique-se o coração está totalmente exposta. Utilize uma pinça hemostática para retrair o esterno (Figura 2D).
  4. Insira a agulha borboleta 3 mm para o ventrículo esquerdo (Figura 2E). Cole a agulha para o coração e da parede torácica, a utilização de cola 3-sec (Figura 2F).
  5. Ative a bomba imediatamente. Depois de um minuto, dissecar a veia cava inferior, a fim de aliviar a pressão do sistema vascular (Figura 2G). Incline a placa para que os líquidos fluam longe da cabeça. Perfusão bem sucedida irá resultar na limpeza dos vasos do fígado e do sangue.
  6. Quando a solução salina heparinizada de perfusão é completada, perfundir 10 ml de formaldeído a 4%. Evitar a penetração de bolhas de ar na vasculatura e evitar a exposição aos vapores de formaldeído. Perfusão formaldeído bem sucedido irá resultar no endurecimento da cauda. Lave o formaldeído com 10 ml heparinizados salina.
  7. Prepara-se o agente de contraste rádio-opaco de acordo com Manufactinstruções Urer. Tipicamente, isso irá exigir mistura do composto, diluente, e um agente de cura. Use pipetas serológicas e misturar a solução em um tubo de plástico de 15 ml.
  8. Perfundir o animal com a mistura de agente de contraste a uma taxa de 1 mL / min. Observe os vasos sanguíneos coronárias, hepáticas e intestinais e verifique se eles estão transformando amarelo depois de perfusão de 2 - 3 ml, indicando perfusão sucesso (Figura 2H). Após a conclusão da perfusão, cortar a tubulação da agulha borboleta, obter a carcaça sozinho e envolvê-lo com papel higiênico para evitar o vazamento da solução para a região calvarial. Permitir que a polimerização em 4 ° CO / N.
  9. Dissecar a região calvarial (Figura 2I); Primeiro usar um bisturi para cortar a pele como lateral, como possível, evitar danificar a região craniana de interesse. Localizar o enxerto de osso e, em seguida, utilizar tesouras finas para cortar o osso craniano 10 mm de distância a partir do enxerto.
  10. Digitalizar o vitelo isoladoamostra de osso arial usando um scanner μCT; campo de visão definido para 20,5 milímetros, a energia de raios-X de 55 kVp, Intensidade de 145 mA, usando projeções 1.000 por 360 ° e integração de tempo de 200 ms. Ajustar os parâmetros μCT 7 para a imagem outros modelos defeito ósseo.
  11. Observe as fatias 2D reconstruídos que foram geradas pelo software μCT. Certifique-se de fazer a varredura da região de interesse é adequada e, em seguida, localizar o defeito calvarial. Avaliar a qualidade da perfusão. Após a identificação bem sucedida dos vasos sanguíneos (Figura 2J), continuar e descalcificação o exemplo usando 6% de ácido tricloroacético (TCA) diluído em água bidestilada (DDW).
  12. Redigitalize a amostra usando os parâmetros indicados na Seção 3.10. Localize a sutura lambdóide nos cortes 2D reconstruídos. Definir um volume cilíndrico de interesse (VOI) de altura de 2 mm e 8 mm de diâmetro, que é tangente à sutura - este é o local anatômico de defeito.
  13. Th Segmentotecido ósseo e dos tecidos moles utilizando um procedimento de limiar global; definir o limiar inferior a 130, e aplicar um filtro gaussiano 3D constrangidos (Sigma [σ] = 2,0 e apoio = 2) para suprimir parcialmente ruído nos volumes. Gerar uma reconstrução 3D e certifique-se a VOI está posicionada corretamente (Figura 2K).
  14. Gerar um mapa de espessura utilizando o software IPL e da função "dt_object_param" (Figura 2L).
    NOTA: Esta função descreve o volume do reservatório para cada diâmetro do vaso.

Figura 2
Figura 2. perfusão com um agente radiopaco através da abordagem cardíaca. O rato é afixada à placa de fixação (A), e a pele é cortada ao longo do abdómen até ao pescoço (B). A parede abdominal é cortada ao longo da linha medial até à procedi xifóideSS (C), e a caixa torácica é cortada lateralmente (D). Uma agulha de borboleta é inserido no ventrículo esquerdo, evitando a inserção no ventrículo direito, que é nitidamente mais escuro (E, o ventrículo direito é indicado pela linha tracejada branco), e a agulha é fixada à parede do coração e do peito (F) . Solução salina heparinizada (2-3 ml) é bombeado para o coração e a veia cava inferior é dissecado (L, seta branca indica a veia cava inferior). Formaldeído (4%) é perfundido e lavado para fora; isto é seguido por uma perfusão do agente de contraste amarelo-tingido rádio-opaco. Perfusão sucesso será evidente pela depuração dos vasos sanguíneos, que mudam de cor para amarelo (H). Após a polimerização, a região de calvária é isolado (I, AG = aloenxerto) e visualizados utilizando um scanner μCT para confirmar perfusão adequada (J, o volume de interesse é marcado com laranja). oamostra é descalcificados e examinados novamente (K), seguido pela geração de um mapa de espessura colorida (L). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. imagens de fluorescência de mineralização óssea e sangue Perfusão

  1. Reconstituir sondas a uma concentração de 2 nmol / 100 ul de PBS num tubo de 1,5 ml (usar uma sonda fluorescente conjugada bisfosfonato para monitorar a mineralização óssea e um agente fluorescente à base de sangue para medir a perfusão de sangue). Pipeta suavemente várias vezes para garantir dissolução homogénea da sonda.
  2. 24 horas antes da sessão de imagem designado tomar imagem tempo de zero a; anestesiar 3 ratos utilizando 2 L / min a inalação de oxigênio a 100% de grau médico suplementado com 3% de isoflurano em uma câmara de indução. Depois de anestesia adequada tiver sido estabelecida, diminuir a concentração de isoflurano a 1,5% - 2%.
  3. Aplicar veterinário pomada para evitar a secura e certificar-se de almofada térmica é ligado em todos os momentos. Comprima o membro animal para se certificar de que está profundamente anestesiados. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
  4. Raspar a região calvarial usando uma máquina de cortar cabelo de aplicá-lo contra a direção do crescimento do cabelo. Remover restos de pele usando creme de depilação. Qualquer remanescente pele irá interferir com imagens ópticas. Remover suturas usando tesoura fina e pinças.
  5. Coloque três animais na fase IVIS aquecida a 37 ° C durante cada sessão de imagem. Definir o tempo de exposição ao auto, visualizar campo para C, e ajustar filtros. Por exemplo, por uma sonda fluorescente bisfosfonato conjugado caracterizado com excitação máxima no comprimento de onda de luz de 680 nm, use um filtro de excitação de 675 nm e um filtro de emissão de Cy5.5 . Da mesma forma, quando se utiliza um agente fluorescente transmitida pelo sangue, com pico de excitação a comprimentos de onda de luz 750 nmusar um filtro de excitação de 710 nm e um filtro de emissão de 780 nm.
  6. Imagem a ratos através Viver software imagem, premindo o botão "Acquire". Certifique-se a região calvarial é completamente visível (Figura 3B) Para uma abrangente guia de aconselhar Lim et al 2009 8.
  7. Permitir que os ratos para despertar a inalação de oxigênio a 100%.
  8. Injectar a sonda fluorescente 2-nmol através de uma injecção intravenosa cauda. Na sessão de imagem designado, realizar imagem tal como descrito acima.

5. Micro-Tomografia Computadorizada para regeneração óssea

  1. Para a quantificação da formação de osso, anestesiar o rato por inalação de isoflurano a 3%, como descrito no passo 4.2 - 4.3. Transferir o mouse para o scanner μCT, e colocá-lo no scanner.
  2. Definir tubo de raio-x de energia potencial do scanner μCT a 55 kVp e intensidade de 145 mA média resolução. Usando um campo de visão de 20,5 mm, executarum olheiro (raio-x simples) digitalizar e definir uma região de interesse que se estende desde os olhos do rato para a parte de trás do seu crânio. Realizar tomografia computadorizada, usando projeções 1.000 por 360 ° e integração de tempo de 200 ms.
  3. Reconstruir as fatias 2D utilizando uma resolução espacial nominal de 20 mm. Alinhe as margens do defeito para uma posição padronizada usando software μCT 9.
  4. Semelhante ao passo 3.20, definir um volume cilíndrico de interesse e aplicar o filtro Gaussian 3D restrita (σ = 0,8 e apoio = 1) para suprimir parcialmente ruído nos volumes. Segmento do tecido ósseo a partir de tecidos moles usando um procedimento de limiar global.
  5. Determinar o volume de tecido mineralizado do osso no volume de interesse.

6. A bioluminescência imagem de Recrutamento e Diferenciação de Células-Tronco

  1. Prepare o mouse para imagens como descrito nas secções 4,2-4,4 e despertar os ratos por inalação de oxigênio a 100%.
  2. Administrar 126 mg / kg de luciferina de escaravelho para cada ratinho através de injecção intraperitoneal, e retornar o animal à câmara de indução. Após 2 min, anestesiar o animal utilizando 3% de isoflurano. Coloque os ratos na IVIS aquecido palco.
  3. Via Viver software de imagem, definir o tempo de exposição a "auto", eo campo de visão para C. Imagem ratos 5 min após a administração luciferina. Imagem os animais como descrito no passo 4.6, utilizando a modalidade "bioluminescência" Definir as regiões de interesse, porque a expressão do transgene varia entre ratinhos. Normalizar o sinal calvarial à cauda.

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Representative Results

A neovascularização foi avaliada através da análise volumétrica μCT e por ILF, utilizando um agente fluorescente transmitida pelo sangue para quantificar a perfusão sanguínea. Sete dias após a cirurgia, μCT varrimento demonstrou um volume significativamente maior de vasos sanguíneos de pequeno e médio Diâmetro em ratos que tinham recebido autoenxertos do que em ratinhos que receberam aloenxertos colhidas a partir de ratinhos C57BL / 6 (Figura 3A). Interessantemente, no grupo de auto-enxerto da árvore vascular recém-formada apareceu para alcançar a área de defeito todo, enquanto que no grupo de aloenxertos vasos sanguíneos apareceu para penetrar no local do defeito a partir das bordas exteriores e estendido para dentro apenas de forma limitada. O FLI apoiaram esta observação, mostrando significativamente maior perfusão sanguínea em animais tratados com o auto-enxerto (Figura 3B). Ao 14 ° dia, no grupo de aloenxertos da árvore vascular alcançado todos proximidade do enxerto, mas o volume do reservatório foi significativamente inferior comparandopara o grupo de auto-enxerto na maioria dos diâmetros dos vasos que foram examinados (Figura 3C). Nota: as diferenças de volume do reservatório foram mais proeminente quando foram comparados os vasos com diâmetros 0.08- a 0,1 mm. Vinte e oito dias após a cirurgia, o volume vasculatura retornou ao normal (Figura 3D).

Sete dias após a cirurgia, ILF realizada utilizando a sonda dirigida-hidroxiapatita demonstraram significativamente maior mineralização óssea no grupo enxertos (Figura 4A). Por esse tempo, o osso havia se formado em toda a proximidade do enxerto nos animais implantados-auto-enxerto. Em contraste, osso nos camundongos implantados-allograft tinha formado apenas nas margens do defeito e foi marcado por uma forma de anel. Os volumes de formação de osso foram quantificadas 56 dias após a cirurgia, no ponto final do processo de regeneração, através da realização de análise μCT (Figura 4B). Volume ósseo foi significativamente maior (Figura 4C) e thi enxertockness significativamente maior nos animais que receberam autoenxertos (Figura 4D). O BLI foi usado em ratinhos transgénicos osteocalcina-luciferase para monitorar o recrutamento de células estaminais e de diferenciação para a linhagem osteoblástica (Figura 4E). Em ratinhos implantados com aloenxertos, o sinal de pico BLI 4 - 7 dias após a cirurgia, quando o sinal de medida na calvária foi 15 vezes maior do que a medida na cauda. Em camundongos implantados-auto-enxerto, o sinal BLI atingiu um pouco mais tarde, 7 - 10 dias após a cirurgia, e foi significativamente maior, chegando a 2 vezes maior calvaria-to-tail proporção (Figura 4F).

Figura 3
Figura 3. defeitos Autoenxerto Implantação Facilita angiogênese. Calvarial foram criados em camundongos. Metade dos animais receberam aloenxertos e a outra metade recebeu autoenxertos. oos murganhos foram perfundidos com um agente de contraste de polimerização 7 dias após a cirurgia. A região de calvária foi isolado, e as amostras foram descalcificadas e fotografada utilizando um scanner μCT. Um mapa espessura volumétrica foi gerado usando software IPL (A, n = 3, barras representam ± SE, e asteriscos indicam valor de P <0,05). Os ratinhos foram injectados com uma sonda proveniente do sangue fluorescente 6 dias após a cirurgia. 24 horas mais tarde os animais foram submetidos a ILF e uma análise quantitativa foi realizada (B, n = 5, barras representam ± SE, e asteriscos indicam valor de P <0,05). Uma análise vascular baseada em μCT foi realizada 14 (C) e 28 (D) dias após a cirurgia (C e D: n = 3, as barras representam ± SEs, e asteriscos indicam valor P <0,05). Por favor clique aqui para ver um maior version desta figura.

Figura 4
Figura 4. Implantação de um Autoenxerto Promove mais do que Osteogenesis Implantação de um Allograft. Os ratinhos receberam implantes de autotransplante calota craniana ou enxertos. Os ratinhos foram posteriormente injectados com uma sonda segmentadas por hidroxiapatite por injecção i.v. de 6 dias após a cirurgia. 24 horas mais tarde FLI e uma análise qualitativa foram realizadas (A, n = 5, barras representam ± SE, e asteriscos indicam valor de P <0,05). In vivo μCT análise foi realizada 56 dias após a cirurgia, e um volume cilíndrico de interesse marcado com laranja foi definida (B). Volume ósseo (C) e espessura do enxerto (D) foram quantificados (n = 8, as barras representam ± SEs, e asteriscos indicam P <0,05) ratos .Transgenic expressando luciferase driven pelo promotor de osteocalcina receberam aloenxertos ou autoenxertos. O BLI foi realizada 10 dias após a cirurgia (E), bem como nos pontos de tempo designados adicionais. O sinal medida na região calvarial foi normalizado porque o nível de expressão varia entre os ratos (F, n = 8, as barras representam ± SEs, e asteriscos indicam valor P <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O objectivo das abordagens de imagem multimodais aqui descritas é permitir meticulosa investigação do eixo angiogénese-osteogénese no contexto de enxerto de osso craniano. A neovascularização foi fotografada utilizando um protocolo μCT, o que permitiu uma alta-resolução demonstração 3D exacta da árvore vascular que alimenta todo o defeito craniano. μCT dados podem ser facilmente analisados ​​utilizando ferramentas avançadas como software IPL. Por exemplo, a análise de espessura mostrado na Figura 3C revelou que as principais diferenças entre o autoenxerto craniana e aloenxerto estão em vasos variando de 0,1 a 0,08 mm de diâmetro, o que caracteriza arteríolas de sangue 10. Este resultado é consistente com estudos realizados no modelo de osso longo 11. Deve notar-se que os navios mais estreitas detectáveis ​​de 0,02 milímetros de diâmetro não são completamente fundido devido à viscosidade do agente de rádio-opaco. A principal desvantagem deste método é o facto de que isso implicaeutanásia do animal, e, assim, imagiologia longitudinal é impossível. Várias sondas por rádio-opacos estão disponíveis para in vivo vascular μCT de imagem; No entanto, eles não são tão radiopaco como a sonda de polimerização densa, e a resolução de imagem que não satisfaz fornecida pelo método ex vivo descrito aqui 12. μCT resolução é limitada e não irá ser útil para estudar os capilares sanguíneos, por exemplo. Outras que, ajudado por uma mão hábil este método oferece uma técnica reprodutível para estudar vasculatura óssea em detalhe.

Um passo crítico nos protocolos descritos é a determinação da localização do defeito (passo 2.7). Prejuízo para a sutura lambdoid vai levar a sangramento maciço. Ao perfurar o defeito calvarial, deve ser tomado cuidado para não perturbar a dura-máter e subalterno o seio sagital superior. Por último, a inserção da agulha de borboleta para o ventrículo esquerdo é um procedimento delicado (passo 3.4). Se a agulha estiver inserçãoed para o ventrículo direito, o agente de contraste irá perfundir os pulmões e passar para as veias, levando à má perfusão da calvária. Se a agulha é inserida demasiado profunda, que vai perfurar a parede do coração posterior; e, se a agulha não foi inserida suficientemente longe, pode facilmente rasgar para fora do coração. Não tente voltar a ajustar a posição da agulha como você pode interferir com a perfusão. O método pode ser modificado utilizando um conjunto de sondas fluorescentes disponíveis; Integrina-α 3 β v -targeted sonda pode ser utilizada para reforçar os vasos sanguíneos formados de novo, enquanto sonda de catepsina-K-alvo pode ser utilizada para quantificar a actividade dos osteoclastos.

De acordo com nossa hipótese, observamos que autografts calota craniana têm um potencial osteogênico maior do que aloenxertos. Isto é verdade para os ossos longos bem como 13 e pode ser atribuído a diversos factores. Em primeiro lugar, o auto-enxerto contém células formadoras de osso, que produzem matriz óssea em todo o enxertosuperfície, como evidenciado na mineralização dirigida-FLI (Figura 4A); Considerando allografts induzir a formação de osso escassos apenas nas margens do defeito. Em segundo lugar, a BLI de osteocalcina de ratos-Luc revelou actividade osteogénica mais no grupo de auto-enxerto, o que pode ser explicado pela presença de factores de crescimento que são removidos no processo de preparação do enxerto (Figura 4F). Curiosamente, a mineralização óssea foi significativamente maior no Days 6 e 7, quando a sonda segmentadas por hidroxiapatita foi administrada, ea diferenciação celular representado pela atividade BLI foi evidente mais tarde, entre o dia 7 e dia 10. Podemos inferir a partir disso que o mais extenso mineralização óssea pode ser pelo menos parcialmente explicada pela vasculatura favorável que caracteriza enxerto ósseo autólogo.

Os nossos resultados indicam que o auto-enxerto tem a capacidade osteogénico superior; no entanto, deve-se levar em consideração que o enxerto ósseo autógeno tem vários drawbacks. Colheita óssea é limitado em volume e acarreta morbidade ao sítio doador 14-16. Além disso, a incidência de autoenxerto reabsorção óssea não é negligenciável 17-19. Os aloenxertos são altamente disponível e apresentar uma solução fora da prateleira para o clínico. Diversos trabalhos têm demonstrado como a osteo-integração de aloenxertos cranianos pode ser aumentada por meios diferentes, que vão desde o revestimento do aloenxerto com BMP-2-codificação vírus adeno-associado 20,21 para terapias adjuvantes, tais como terapia intermitente 22 paratiróide. No final, uma vez que a capacidade do aloenxerto de se fundir com o osso é aperfeiçoado, o aloenxerto vai tornar o material de enxerto preferido.

À luz destes resultados, um interesse particular encontra-se na questão como para modular a neovascularização no local da regeneração óssea. Abordagem directa de VEGF sobre-expressão foi encontrado ineficiente, como os vasos sanguíneos formam são gotejante e não formam um functional líquido 23,24. Curiosamente, verificou-se que a transdução do sinal de BMP leva à formação de vasos sanguíneos alvejado 25,26. Além disso, agentes farmacêuticos 11 e terapia com células 27 foram mostrados para alterar os padrões de angiogênese na proximidade enxerto ósseo; ambas as abordagens atuais estratégias promissoras para melhorar a cicatrização de defeitos ósseos do crânio.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

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References

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