Author Produced

وحديثي الولادة ماوس الحبل الشوكي ضغط إصابة نموذج

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. L. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) وعادة ما يسبب العجز العصبية المدمرة، لا سيما من خلال الأضرار التي لحقت الألياف تنازلي من الدماغ إلى الحبل الشوكي. وتركز المساحة الحالية الرئيسية للبحث في آليات المرونة التكيفية التي تكمن وراء الانتعاش وظيفية عفوية أو بفعل التالية اصابات النخاع الشوكي. وتفيد التقارير الانتعاش وظيفية عفوية أن يكون أكبر في وقت مبكر من الحياة، مما يثير تساؤلات مثيرة للاهتمام حول كيفية تأثير التغيرات اللدونة التكيف مع تطور الحبل الشوكي. لتسهيل التحقيق في هذه الدينامية، وقد وضعنا نموذجا اصابات النخاع الشوكي في الماوس حديثي الولادة. نموذج له أهمية للأطفال اصابات النخاع الشوكي، التي تدرس القليل جدا. بسبب اللدونة العصبية في البالغين تتضمن بعض الآليات نفسها كما اللدونة العصبية في وقت مبكر من الحياة وهذا النموذج من المحتمل أن يكون بعض الأهمية أيضا لتعليم الكبار اصابات النخاع الشوكي. نحن هنا وصف الإجراء بأكمله لتوليد اصابة في استنساخه انضغاط الحبل الشوكي (SCC) في الماوس حديثي الولادةفي وقت مبكر بعد الولادة (P) اليوم يتحقق 1. SCC عن طريق إجراء الثقب على مستوى العمود الفقري معين (هو موضح هنا في مستويات الصدرية 9-11) ثم استخدام تعديل Yasargil تمدد الأوعية الدموية المصغرة كليب لضغط بسرعة وضغط على الحبل الشوكي . كما هو موضح سابقا، والفئران حديثي الولادة المصابين يمكن اختبار لعجز السلوكية أو التضحية لخارج الجسم الحي تحليل الفسيولوجي للاتصال متشابك باستخدام تقنيات التسجيل البصري الكهربية والإنتاجية العالية 1. وقد أظهرت في وقت سابق والمستمرة الدراسات باستخدام تقييم السلوكية والنفسية لذلك، انخفاض دراماتيكي حاد في الحركة hindlimb يتبعه انتعاش وظيفي كامل في غضون 2 أسابيع، وأول دليل على التغيرات في الدوائر الوظيفية على مستوى حددت تنازلي الاتصالات المشبكية 1.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول التجريبي من قبل الهيئة العامة للبحوث الحيوان الوطنية في النرويج (Forsøksdyrutvalget، المحلي التجريبية موافقة عدد 12.4591) في الامتثال للوائح رعاية الحيوانات الاتحاد الأوروبي (مختبر الاتحاد الأوروبي جمعية علم الحيوان). وقد بذلت جهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة ومعاناتهم. في هذه المقالة وصف الإجراءات المستخدمة على بعد الولادة (P) يوم 1-النوع البري مجلس النواب (يطبع منطقة التحكم) الفئران (جاكسون، الولايات المتحدة الأمريكية)، ولكن يمكن أيضا نفس النهج أن تستخدم في مراحل لاحقة.

1. بناء نظام التخدير الغاز الفئران حديثي الولادة (الشكل 1)

  1. بناء الأنف قناع من غيض من حقنة. ربط هذا إلى 3 في اتجاه ومحبس مع أنابيب البلاستيك (الشكل 1 - أنابيب الأحمر والشكل 2A1).
  2. حفر ثقب صغير في جانب من قناع الأنف وربط هذا إلى أنابيب بلاستيكية لإزالة الفائض من الغاز منقناع. إنهاء الأنابيب إما في مضخة فراغ المحددة لضغط سلبي طفيف، أو في غطاء الدخان (الشكل 1 - أنابيب الأخضر الساطع).
  3. جعل غرفة التخدير من 150 مم × 25 مم البلاستيك طبق بيتري (الشكل 2A2).
    1. على جانب واحد، وجعل حفرة كبيرة بما يكفي لاستيعاب الرأس من الفأرة وقناع الأنف.
    2. على الجانب الآخر، وجعل اثنين من الثقوب الصغيرة التي يمكن من خلالها إدخال أنابيب البلاستيك من وإلى قناع الأنف (الشكل 1 - أحمر ومشرق أنابيب الأخضر، على التوالي).
    3. جعل ثقب الثالث على الجزء العلوي من الغطاء ونعلق على هذا أنبوب بلاستيكي الثالث الذي ينتهي في مضخة فراغ (الشكل 1 - أنابيب الأخضر الداكن). والغرض من هذا الأنبوب الثالث هو التأكد من أن أي زيادة الغازات التي لم يتم التقاطها بواسطة منفذ من قناع الأنف وإزالتها.
  4. بناء غرفة النوم عن طريق إحداث ثقب في الجزء السفلي من أي نوع من طبق المختبر الذي هو كبير بما يكفي لجontain الماوس، ولها حافة ناعمة وحتى (افتتاح الطبق يجب أن تكمن دافق مع الجدول لمنع تسرب الغاز). توصيل ثقب في غرفة إلى 3 في اتجاه ومحبس مع أنابيب البلاستيك (الشكل 1 - أنابيب البني). وضع غرفة النوم تحت غطاء الدخان.
  5. توصيل 3 في اتجاه ومحبس إلى أنبوب مخرج من المرذاذ (الشكل 1 - أنابيب الأصفر والشكل 2A3).
  6. ربط مدخل المرذاذ إلى الأوكسجين (الشكل 1 - أنابيب الأزرق).

2. تعديل لYasargil المؤقتة تمدد الأوعية الدموية البسيطة كليب لإنشاء أداة ضغط (الشكل 2 والجدول 1)

  1. يلصق مقطع بحزم الى وقفة مع المشبك. باستخدام العدسة مجهر لمراقبة بصرية، تقديم أسفل السطح الخارجي من طرف كل شفرة مقطع لسمك النهائي من حوالي 150 ميكرون باستخدام حجر شحذ التي شنت على الحفر (الشكل 2B و C). جعل سدادة لمقطع بقطع مسافة قصيرة من البولي ايثلين الشعرية أنابيب (الجدول 1) تحت مجهر تشريحي باستخدام سكين الصغير (الجدول 1)، ووضع هذا على واحد من ريش (الشكل 2A4 وأرقام 2B وجيم). هذا يمنع اغلاق تام من مقطع ويخلق أبعادا ضغط موحدة. عند إغلاق مقطع المسافة interblade حوالي 230 ميكرون. جعل سدادة جديدة لكل تجربة كمادة البولي ايثيلين قد ضغط أثناء الاستخدام، والذي من شأنه أن يغير من الفضاء interblade.
    ملاحظة: التوتر في الربيع مقطع يقلل بمرور الوقت بحيث بعد حوالي 80 الضغط على مقطع لم تعد يغلق تماما على سدادة ويحتاج إلى استبداله.

3. إعداد قبل الجراحة

  1. ضع الماوس في غرفة النوم (الشكل 1) والشروع في التخدير مع 4٪ الأيزوفلورين (الشكل 2A5 (الشكل 2A3 والجدول 1).
  2. اختبار رد الفعل سحب الماوس عن طريق معسر بلطف على شبكة الإنترنت من الجلد بين أصابع القدم مع ملقط رقيقة من البلاستيك. هل هذا بعناية كما هي الفئران الوليدة أصيب بسهولة. معسر نتائج من الصعب جدا في كدمات على الفور. أداء هذا الاختبار في بداية التخدير يتسبب في رد الفعل، ويوفر مؤشرا جيدا لمقدار القوة اللازمة.
  3. مرة واحدة يتم إلغاء منعكس، وإزالة الماوس من غرفة النوم ووضعه في وضعية الرقود على طاولة العمليات مع خطم إدراجها في قناع الأنف أن يوفر امدادات مستمرة من 4٪ الأيزوفلورين مختلطة في الأكسجين النقي (الشكل 1). تأكد من أن لوحة الاحترار في وضع التشغيل وتعيين إلى 37-38 درجة مئوية كما انخفاض حرارة الجسم أثناء الجراحة يمكن أن تكون قاتلة.
  4. لتحقيق التسكين الكامل، حقن تحت الجلد 50 ميكرولتر من مخدر موضعي بوبيفاكايين (2.5 ملغ / مل، الشكل 2A7 والجدول 1) لإجراء الحقن.
  5. والحد من تركيز الأيزوفلورين تسليمها إلى قناع الأنف إلى 1-2٪.

4. ظهري استئصال الصفيحه

  1. إجراء عمليات جراحية تحت السيطرة المجهرية.
  2. بعد تنظيف منطقة الجراحة مع غلوكونات الكلورهيكسيدين (الجدول 1 رقم 19) لمدة 30 ثانية على الأقل، وجعل 1-2 ملم عرضية شق الجلد في T9-T11 باستخدام microknife (الشكل 2A8).
    ملاحظة: في مجلس النواب الفئران حديثي الولادة الجزء منقاري من المعدة، وضوحا عندما يحتوي الحليب، والتي تواجه مستويات الفقري T12-T13 (الشكل 3). معلم آخر هو جزء منقاري من تحت الجلد مجموع الأنسجة الدهنية الصدري الذي ينتهي في حوالي T8-9. هذا المعلم مرئيا إلا بعد شق الجلد.
  3. (الشكل 2A9 وA10) لتوسيع فتحة الجلد في الاتجاه العرضي إلى 8-9 مم عن طريق سحب الجلد بلطف rostrally وcaudally (الجلد الدموع بسهولة، وخلق الجرح على نحو سلس ومستقيم). هذا يوفر وصولا الجانبي كافية في العمود الفقري.
  4. التراجع عن حواف شق الجلد من الهياكل الأساسية عن طريق إدخال قطعة معقمة من الإسفنج الجيلاتين لوقف نزيف الدم (الشكل 2A11 والجدول 1) منقاري تحت الجلد والذيلية إلى الشق. هذا يوسع افتتاح ويمنع البشرة من التراجع والتعتيم على المنطقة خلال عملية جراحية. لا تحتاج إلى أن تكون غارقة في المياه المالحة قبل استخدامها الاسفنج الجيلاتين لوقف نزيف الدم.
  5. لفضح العمود الفقري، تشريح عضلات مجاورة للفقرة باستخدام مقص رقيقة (الشكل 2A12، والجدول 1). قطع المرفقات من العضلات إلى العمود الفقري وفضح الصفيحة (الشكل 4A). ليسه أيضا أنه في هذه المرحلة عملية في العمود الفقري متخلفة.
  6. التعرف على خط الوسط وقطع مستعرض بين الصفائح اثنين (الذي في هذه المرحلة هو غضروفي) مع مقص رقيقة (الشكل 4B). بعناية وضع شفرة واحدة من ملقط رقيقة بين الصفيحة والجافية (الشكل 4C)، فهم الصفيحة مع ملقط ورفعه بعناية حتى قطعة يكسر بعيدا، وترك الجافية سليمة (الشكل 4D). كرر هذه 2-3 مرات للحصول على الثقب 1-2 شريحة طويلة.
  7. باستخدام ملقط رقيقة كما رينجرز، وإزالة أجزاء من مفاصل ثنائيا لكسب مساحة كافية لوضع مقطع داخل قناة العمود الفقري. تنظيف المنطقة الجراحية والسيطرة على النزيف مع قطع صغيرة من الإسفنج الجيلاتين لوقف نزيف الدم.

5. الحبل الشوكي ضغط الإصابات

  1. فتح تعديل تمدد الأوعية الدموية المصغرة في مقطع حامل كليب (الشكل 2A13 والشكل 2B) والمركز الرابعشفرات الإلكترونية على جانبي الحبل الشوكي في الفراغات بين الوجه ينضم والنخاع. تأكد من أن يتم إدراج ريش يكفي عميق يؤثر على الجزء البطني من الحبل الشوكي. إذا لم يكن ذلك ممكنا، وإزالة أكثر من مفاصل.
  2. الافراج عن ميني كليب بسرعة، عقد في مكانه مع حامل كليب لمنعها من الانزلاق. الحفاظ على ضغط لمدة 15 ثانية.
  3. فتح مصغرة كليب بسرعة وإزالته. لتحقيق ضغط متناظرة، عكس اتجاه ميني كليب، واستخدام علامة ينظر اليه بسهولة أدلى بها ذمة النزفية من ضغط الأول كدليل، إعادة مقطع في الاتجاه العكسي لالثاني ضغط 15 ثانية (قبل وأظهرت التجربة أن هذا يولد العجز النسيجية والفسيولوجية متناظرة، في حين الضغط على واحدة لا 1). لا ينبغي أن يكون معطوبا الجافية من الضغط.
  4. تنظيف المنطقة والحفاظ على الارقاء مع قطعة من الإسفنج الجيلاتين لوقف نزيف الدم.
  5. إزالة قطعة من الإسفنج الجيلاتين لوقف نزيف الدم التي تم وضعها تحت حواف شق الجلد في بداية عملية جراحية وإغلاق شق الجلد مع معقمة 6.0 خياطة وحامل إبرة (الشكل 2A14 و 15).
  6. حقن تحت الجلد 0.75 ملغم / كغم من وزن الجسم البوبرينورفين (الشكل 2A16) المخفف في برنامج تلفزيوني العقيمة باستخدام حقنة الأنسولين (300 ميكرولتر، 30 G).

6. العناية بعد العملية الجراحية

  1. إزالة الماوس من قناع الأنف ووضعه في مجموعة غرفة التحكم في درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية حتى ترتدي التخدير وإيقاف الماوس يصبح في حالة تأهب (1-3 ساعة عادة كافية).
  2. حقن الديازيبام (الشكل 2B17) البريتونى إلى الأم (8 جم / كجم من وزن الجسم). وهذا يخلق سبات أن يقلل من مخاطر أكل لحوم البشر خلال الليلة الأولى، عندما يكون هذا الخطر هو أعلى.
  3. عودة الماوس تعمل على القمامة.
  4. إذا القمامة هي لالدو (> 12 الجراء)، وإزالة بعض الجراء unoperated، تفضيلي الحيوانات الكبيرة إذا كانت تختلف في الحجم، للحد من المنافسة على الحليب. رعاية الأمومة من الجراء تشغيلها هو أفضل في خط النواب إذا كان حجم القمامة حوالي 9 الجراء.
  5. لإدارة الألم، وإدارة البوبرينورفين (0.75 ملغ / كغ من وزن الجسم) تحت الجلد مرة واحدة يوميا خلال أيام بعد العملية الجراحية الأولى، وذلك باستخدام حقنة الأنسولين (300 ميكرولتر، 30 G). حجم مناسب للحقن تحت الجلد هو 30-50 ميكرولتر. في النطق الفئران حديثي الولادة والتحريض مؤشرات جيدة من الألم.
  6. إجراء الفحص اليومي من الفئران المصابين باستخدام ورقة نتيجة لتقييم التغذية، ووزن الجسم، والجفاف، والألم، التئام الجروح، واحتباس البول وحالة عدوى. وفقا لدرجة حصل عليها، وتوفير رعاية خاصة، مثل حقن محلول معقم للأطفال التغذية (الجدول 1 رقم 18) في حالة التغذية غير طبيعية. لائحة الهدافين أيضا0؛ يحدد معايير نقطة النهاية إنسانية. أم أن لا يرفض الجراء أصيب هو أفضل الرعاية.
  7. في حالة غير عادية من ضعف المثانة، نفذ التدليك المثانة مرتين في اليوم حتى يتم استعادة وظيفة. ويتم ذلك عن طريق وضع الماوس في موقف ضعيف في يد واحدة وتدليك أسفل البطن برفق في اتجاه rostro الذيلية باستخدام الإصبع.

Representative Results

العمود الفقري إصابة انضغاط الحبل وفقدان وظيفة

كما هو موضح سابقا، عن طريق تحسين الإجراءات قبل الجراحة والجراحة وبعد العملية الجراحية، وهذا نموذج ضغط اصابات النخاع الشوكي يمكن استنساخه في الماوس حديثي الولادة ويمكن الحصول على 1. سدادة البولي ايثيلين وضعت على شفرة واحدة من كليب (الشكل 2B و C) يمنع اغلاق تام من مقطع ويحافظ على المسافة بين شفرة باستمرار في حوالي 230 ميكرون. عكس اتجاه مقطع في الضغط بين النتيجتين في الإصابة متناظرة، كما تقرره عقابيل النسيجي (الشكل 5A و 1). مباشرة بعد إزالة ميني كليب، ونسيج الحبل الشوكي المضغوطة يصبح أكثر قتامة بسبب كدمة النزفية وذمة. مراقبة أقسام المسلسل من الحبل الشوكي المصاب الملون ليوزين والهيماتوكسيلين بالفعل يوم واحدإصابة fter يكشف تدهور تدريجي في الأنسجة عند الاقتراب من مركز الآفة (الشكل 5A). وجود تجاويف داخل النخاع أو الدم في الآفة ليس من غير المألوف.

التقييم السلوكي، على سبيل المثال من خلال تتبع مسارات hindlimb تحت غير الوزن الظروف تحمل بضع ساعات بعد الجراحة، ويظهر انخفاض الكبير في الحركة hindlimb في SCC المصابين الفئران بالمقارنة مع الفئران التي تحكم الزائفة التي يتم تنفيذ سوى الثقب (الشكل 5B و 1) . هذا الاختبار يمكن أن تتكرر حتى الفأر هو قادرة على أداء الاختبارات السلوكية الأخرى التي تتطلب تحمل الوزن الخاص بها 1.

وفيات والتعافي بعد الجراحة

هي وفيات أثناء العملية ويرجع ذلك أساسا إلى توقف التنفس وتوقف القلب الناجم عن ارتفاع تركيز الأيزوفلورين اللازمة لتحقيق anesthesi كافيةا. إدخال مخدر بوبيفاكايين المحلي في بروتوكول الجراحي يسمح الحد من تركيز الأيزوفلورين وبالتالي يقلل بشكل كبير من معدل الوفيات. في سلسلة التجارب الأخيرة بما في ذلك أكثر من 20 حيوانا، وكان معدل الوفيات أثناء العملية معدومة. في المقابل، أثرت البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة بشكل رئيسي عن طريق قبول من الفئران التي تديرها والدتهما. حدث تحسن كبير عندما تم تخفيض القلق والعدوانية من خلال توفير حقنة واحدة من الديازيبام (IP 8 جم / كجم من وزن الجسم) للأم قبل أن تعود الفئران تعمل لالقمامة 1. يمكن رصدها القبول والتعافي بعد العملية الجراحية من الفئران التي تديرها وجود الحليب في المعدة. المعدة من الماوس P1-P7 الذي يحتوي الحليب في حالة سكر بيضاء بشكل واضح وضوحا من خلال الجلد في منطقة البطن (الشكل 3). مقارنة التغذية في تشغيلها، ومراقبة صورية والفئران unoperated مفيدة لتقييم الحالة التغذوية للاصاباتالفئران د. تقييم نمو تعمل مقابل الفئران unoperated يدل على أنه على الرغم من فقدان الوزن قليلا خلال اليوم الأول بعد الجراحة، ومنحنى نمو الفئران تعمل طبيعتها بسرعة بعد ذلك (الشكل 6). لم يكن لوحظ الوفيات المتعلقة اضطرابات المثانة أو العدوى حتى في الفئران درس لطالما 7 أسابيع.

<td> 10
عدد في الشكل. 2 اسم المصنع / مزود مرجع # صلة التعليق
1 حقنة بلاستيكية (30 أو 50 مل)
2 البلاستيك طبق بيتري (150 × 25 مم)
3 المرذاذ الأيزوفلورين FORTEC Cypraشمال شرق http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ نحن نستخدم والجهاز القديم من الإنتاج، والتحقق من الرابط لجهاز أحدث
4 ا Yasargil تمدد الأوعية الدموية مؤقتة مصغرة كليب أيسكولاب FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4B تتحمل غرامة البولي ايثيلين الشعرية معرف أنابيب 0.58 ملم، OD 0.96 ملم الحدادون الطبية 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 الأيزوفلورين (Forene) أبوت GMBH & Co. KG ل http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (بوبيفاكايين) استرا زينيكا http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 أنسولين حقنة 0.3 مل 30 G العاشر 8MM VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp؟product_id=4646138
8 الترا مايكرو الجميلة سكين 5 ملم المتطورة أدوات العلوم الجميلة 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp؟Suchtyp=
كات وsuchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 الملقط الجميلة غريف إضافية - 0.5 ملم تلميح أدوات العلوم الجميلة 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp؟Suchtyp=
كات وsuchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1
ليس من الضروري حقا، في كثير من الأحيان الأسنان كبيرة جدا
ملقط SuperGrip مستقيم أدوات العلوم الجميلة 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp؟Suchtyp=
كات وsuchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1
ضرورية اثنين ملقط
11 Spongostan الخاصة 70 × 50 × 1 مم FERROSAN
12 Vannas الربيع مقص - 2 شفرات ملم على التوالي أدوات العلوم الجميلة 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp؟Suchtyp=
كات وsuchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 فاريو كليب تطبيق الملقط أيسكولاب FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-؛ 0 ([إثيكن) جونسون وجونسون J105G
15 Diethrich حامل الإبرة الصغيرة 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (البوبرينورفين) شيرينغ بلاو
17 Stesolid (ديازيبام) ACTAVIS المعروف أيضا باسم الفاليوم
18 Pedamix فريزينيوس كابي http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (غلوكونات الكلورهيكسيدين) Fresenالناهية الكعبي D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

الجدول 1. قائمة الأدوات والمعدات اللازمة لتوليد اصابة في العمود الفقري انضغاط الحبل يحركها كليب في الماوس حديثي الولادة.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي من الإعداد التخدير. ويقدم هذا التخطيطي الإعداد التخدير تصميم الماوس حديثي الولادة، مع غرفة النوم للتخدير الأولي وجهاز قناع الأنف لاستمرار التخدير أثناء الجراحة.

الشكل 2
الشكل 2. الأدوات الرئيسية وكليب الضغط. (أ) الأدوات المستخدمة أثناء العملية. الأرقام تتوافق مع الشرح المستخدمة في الجدول 1. (B و C) وYasargil تمدد الأوعية الدموية مؤقتة مصغرة كليب مع غيض من كل شفرة قطع يدويا إلى حوالي 150 ميكرون سمك. يتم وضع سدادة مصنوعة من شريحة من البولي ايثلين أنابيب (الجدول 1) على واحد من شفرات لمنع إغلاق كامل للمقطع. شريط النطاق: 2 مم. التطبيق: قضيب كليب (رقم 12 في ألف)؛ القديس: سدادة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. لاندمارك للتقييم قبل الجراحة من مستوى العمود الفقري في الماوس النواب حديثي الولادة. (A) عرض الوحشي على فأرة الحاسوب P1 مجلس النواب مع الحليب الأبيض في الصورة tomach. الجزء منقاري من المعدة يتوافق مع مستوى العمود الفقري T12-T13. (ب) P1 مجلس النواب الماوس تحت التخدير في وضعية الرقود. وعلى الرغم من صعوبة تصور من في الفقرة (أ)، والمعدة مليئة الحليب هو متعارف عليها. الجزء منقاري من المعدة يشير T12-T13 مستوى العمود الفقري. الحانات الحجم: 0.5 سم.

الشكل (4)
الشكل 4. ظهري الثقب. (A) تشريح عضلات مجاورة للفقرة. لاحظ أنه في هذا العصر عملية في العمود الفقري متخلفة. (ب) باجتزاء متقاطع من الصفيحة مع مقص رقيقة. (C) مقدمة من شفرة واحدة من ملقط رقيقة بين الصفيحة والجافية. يظهر نقطة الدخول بحلول رأس السهم. (D) إزالة الصفيحة. شريط النطاق: 2 مم.

ملفات / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
الرقم 5. التركيب النسيجي وسلوكه بعد إصابة ضغط الحبل الشوكي في P1. (A) يوزين والهيماتوكسيلين تلطيخ في أقسام الحبل الشوكي من الفأرة المصاب (1 يوما بعد الإصابة) على مسافة مختلفة من مركز الزلزال الاصابة. (ب) لاحظت آثار التمثيلية للforelimb وhindlimb مسارات 6 ساعات بعد الإصابة أو بعد استئصال الصفيحة الفقرية سيطرة صورية. آثار على رأس تمثل مسارات ينظر إليها من وجهة نظر الجانبي للحيوان. آثار في أسفل تمثل مسارات ينظر اليها من الجانب البطني للحيوان. انظر أيضا 1. شريط مقياس: 250 ميكرون. DH: القرن الظهري. L، غادر. R: اليمنى. SCC: انضغاط الحبل الشوكي. VH: القرن البطني الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6. منحنيات النمو مقارنة. الرسم البياني يبين زيادة الوزن من unoperated وSCC الفئران المصابين من يوم ما بعد الولادة 1 إلى يوم بعد الولادة 9.

Discussion

في هذه المقالة وصفت إجراءات لإصابة SCC ولدت في مقطع P1 الفئران. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ نفس الإجراءات في مراحل لاحقة. أجريت الإصابات ضغط بنجاح في P5، P7، P9 و P12 (Züchner، وآخرون، مخطوطة في الإعداد). في جميع مراحل ما بعد الولادة، ويتم الحصول على التخدير العام مع isoflurane تبخيرها في الأكسجين النقي، ولكن النتيجة التخدير يعتمد إلى حد كبير على العمر. في المحاولات الأولية لP1-P4، قبل عرضه التخدير الموضعي في البروتوكول، كان من الصعب الحصول على تخدير عميق وممتد بسبب نافذة جرعة تأثير ضيق بين عدم كفاية تخدير وجرعة زائدة. وبالإضافة إلى ذلك، فقد أثيرت المخاوف المتعلقة أثر أعصاب من الأيزوفلورين في الحيوانات حديثة الولادة 27-30. مزيج من الأيزوفلورين ونتائج مخدر بوبيفاكايين المحلية في التخدير أعمق وأكثر استقرارا في حين تسمح تخفيض جرعة الأيزوفلورين بعامل 2-3. أنواع مختلفة من anestheوقد وصفت سيا للقوارض حديثي الولادة، بما في ذلك تخدير بالبرد 31،32، ولكن واحدة إزعاج محتمل للتخدير بالبرد هو تأثيره الأعصاب (التي استعرضتها 33،34)، والتي يمكن أن تعقد الجيل اصابة فعالة وقابلة للتكرار. يعتبر التخدير القائم على الباربيتورات أن يكون أقل كفاءة في الفئران حديثي الولادة بسبب انخفاض مستويات الزلال في الدم والدهون في الجسم من البالغين 35،36.

على الرغم من الغازية تماما وصدمة، مرة واحدة يتم تأسيس إجراء معدل الوفيات أثناء الجراحة منخفضة. ومع ذلك، هناك خطوات حاسمة أثناء العملية التي تتطلب اهتماما خاصا لتحسين الانتعاش وبقاء الفئران تشغيلها. قضية واحدة مهمة هي لتحديد الجراء التي سيكون لها أفضل فرصة البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية. عندما القمامة كبيرة في الحالة التغذوية للالجراء الفردية تختلف. بالإضافة إلى نزيف لا مفر منه أن يحدث أثناء الجراحة، الجراء تعمل تنفق ساعةق بعيدا عن الأم، وغالبا ما لا تشرب الحليب قبل صباح اليوم التالي. ومن ثم ميزة لتحديد الجراء التي لديها بالفعل كمية معينة من الحليب في المعدة. هذا هو مرئية بسهولة من خلال الجلد في منطقة البطن من P0 إلى P7.

خلال الليلة الأولى الجرو تعمل في خطر كبير من أن نهبها من قبل الأم. خلال التطوير الأولي من هذا النموذج أكثر من نصف الفئران تعمل في عداد المفقودين في صباح اليوم التالي، مع وجود علامات واضحة من الدم في القفص. وقد تم دراسة Necrophagy، أكل لحوم البشر وقتل الأطفال في القوارض لعقود 37-40. في هذه الدراسة، تم شهد أكل لحوم البشر مرة واحدة فقط، ولكن كان يعتبر تفسيرا أكثر عرضة من necrophagy لأن الجراء التي أعيدت إلى القفص كانت عادة في مثل هذا الشكل الجيد أن الموت لأسباب طبيعية أثناء الليل يبدو غير محتمل. وهذا ما دفع فكرة استخدام وكيل الدوائية عكسها مثل الديازيبام للحد من القلق والعدوانية طن الأم (التي استعرضتها 41). حقن داخل الصفاق من الديازيبام إلى تحسن كبير في الوضع، واسقاط وفيات خلال الليلة الأولى من أكثر من 60٪ إلى أقل من 20٪.

تقليل حجم القمامة التي كتبها اعدام وتعكير القمامة أقل قدر ممكن بعد عودة بعد العملية الجراحية عناصر الإضافية التي يمكن أن تستفيد منها الحيوانات تشغيلها. ومع ذلك، وترك الجراء فقط تعمل مع الأم ليست مفيدة. قد تختلف أفضل توازن من تشغيلها / الجراء unoperated وفقا للخط، ولكن لمجلس النواب وSCID-مجلس النواب الفئران ترك 4-5 الجراء تعمل (الإصابة أو صورية) جنبا إلى جنب مع 3-4 الجراء unoperated أعطى أفضل النتائج.

في الشعور العام، والقيد الرئيسي من هذا النموذج اصابات النخاع الشوكي حديثي الولادة هو أن الحبل الشوكي حديثي الولادة يختلف في كثير من النواحي من الحبل الشوكي الكبار، وبالتالي قد لا توفر النتائج التجريبية التي هي مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من نماذج اصابات النخاع الشوكي الكبار. وتشمل هذه الخلافات الحجم الكلي و حجم النخاع الشوكي، عدد الخلايا، في تمثيل أنواع معينة من الخلايا مثل الخلايا قليلة التغصن، الاستجابات المناعية غير ناضجة ودوائر العصبية غير ناضجة. ولذلك يجب أن الاستنتاجات المستخلصة من التجارب في هذا النموذج أن تدرس بعناية. من ناحية أخرى، وهذا النموذج هو ذات الصلة لسيناريو أقل التحقيق نسبيا من الأطفال اصابات النخاع الشوكي. وعلاوة على ذلك، فإن ضعف واضح فيما يتعلق نماذج اصابات النخاع الشوكي الكبار هو أيضا قوة محتملة لأنها قد تؤدي إلى توضيح آليات اللدونة أنه على الرغم موجودة بشكل ضئيل في الحبل الشوكي الكبار، يمكن أن تمثل الركيزة العلاجية إذا رد إليه اعتباره. فمن المتصور أن إعادة الأوضاع حديثي الولادة أو حتى الجنينية يمكن أن تنفذ من خلال زرع خلايا الأقل نموا أو الأنسجة أو عن طريق العلاج مع الكواشف التي تولد أنسجة البالغين مع الخصائص النمائية السابقة. باستخدام أنزيمات للقضاء على شبكات محيط بالعصبون مثال على هذا النهج الأخير 42،43.

"jove_content"> وثمة مسألة رئيسية عند إنشاء نموذج حيواني لاصابات النخاع الشوكي هو الحصول على إصابة موحدة. هذا هو جانب هام التي تم تناولها في نماذج اصابات النخاع الشوكي متعددة، على سبيل المثال، transection، تنصيف، الرواطم، ضغط البالون، وسحق الملقط، ثابت ضغط الوزن، وما إلى ذلك وفيما يتعلق تؤثر على أجهزة الهاتف، وأسفرت الجهود المبذولة في هذا الاتجاه في نماذج اصابات النخاع الشوكي في القوارض الكبار حيث يمكن التلاعب بها معلمات متعددة من تأثير مثل السرعة والقوة والمدة (التي استعرضتها 44). وثمة نهج آخر، تنطوي على أقل من المعدات، ويعمل على تعديل كير Lougheed تمدد الأوعية الدموية كليب 45،46. هذه المقاربات 2 متكاملان كما المسبار يقلد لإصابة كدمة في حين أن يقلد كليب اصابة في ضغط مع درجة معينة من نقص التروية المتزامنة. بسبب القيود حجم كبير وتزيد من ضعف الفئران حديثي الولادة، وارتفاع معدل الوفيات المرتبطة العمليات الجراحية أطول فضلا عن تكاليف جمعةoping المعدات على نطاق أصغر، وقد اختير لتطوير ضغط ولدت كليب بدلا من نهج كدمة ولدت المسبار. وقد تحقق ذلك من خلال تكييف متوفر تجاريا تمدد الأوعية الدموية المصغرة كليب لاستيعاب حجم العمود الفقري من الفئران حديثي الولادة 1. إضافة سدادة يضمن عرض ضغط موحد، وطالما أن التوتر من مقطع يضغط على الحد من سدادة، يجب أن قوة ضغط خلال المرحلة ثابتة في الحد الأدنى من العرض تختلف قليلا. ما ليست موحدة وسرعة ضغط خلال المرحلة الديناميكية، لأن هذا سوف تختلف مع تغير كليب التوتر خلال فترة المشروع. كمرحلة ثابتة للضغط تدوم أطول بكثير من مرحلة ديناميكية، وهناك دلائل تشير إلى أن نسيج الحبل الشوكي تبذل الكثير من المضادة ضد ريش مصغرة كليب، فمن المرجح أن شدة الإصابة الأكثر اعتمادا على مرحلة ثابتة. هذا، ومع ذلك، لا يزال لفحصها. جرحومن المرجح أن تعتمد على عوامل متعددة، بما في ذلك قوة ثابتة ضغط والمدة، وسرعة ضغط وإزالة الضغط، موقف ميني كليب، وعدد من الضغط على تنفيذها في نفس الموقع شدة. وهكذا، يمكن الاختلاف اندماجي في هذه المعايير يؤدي إلى توليد مجموعة من بالقسوة إصابة من ضعيف إلى حادة. وعلى الرغم من احتمال تقلب، لدينا في الدراسة التي نشرت سابقا 1 حصلنا على نتائج متسقة في النسيجية، ومستويات الفسيولوجية والسلوكية، لذلك هناك دلائل تشير إلى أن توحيد مقبول من الصعب تحقيقه. ونلاحظ أن في هذه الدراسة استخدمنا أساليب متعددة من التحقق من صحة في كل مستوى، بما في ذلك الاختبارات السلوكية مثل الهواء التنقل كما هو مبين في الشكل (5).

في هذا النموذج اصابات النخاع الشوكي الوليدي إصابة قطع الغيار نسبة معينة من المحاور، وبالتالي يوفر الوضع مواتية لانتزاع اللدونة التكيف من خلال إعادة modelin-ز الاتصالات يدخر وتشكيل دوائر جديدة. وعلاوة على ذلك، منذ الماوس حديثي الولادة هي مناسبة تماما للتحقيق من قبل العديد من الطرق التجريبية، فإنه من الممكن استخدام هذا النموذج لدراسة الانتعاش وظيفية واللدونة التكيف مع نهج تكاملي، بما في ذلك الاختبارات السلوكية، إلى الوراء وتقدمي تتبع محور عصبي، المناعية، الكهربية وعالية -throughput تسجيل البصرية 1. وكمثال على ذلك، أننا قد استفادت من هذا النهج التكاملي لإثبات شبكة إعادة النمذجة على مستوى المدخلات الهابطة محددة باستخدام عالية الإنتاجية التصوير الكالسيوم في الجسم الحي السابقين الاستعدادات wholemount من جذع الدماغ والحبل الشوكي المصاب 1. هذا ويمكن زيادة دفع عن طريق استخدام أدوات علم البصريات الوراثي العصبية والصيدلة علم البصريات الوراثي لتقييم إعادة عرض من الاتصالات المشبكية بين القطعان محددة من الخلايا العصبية في العمود الفقري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic syringe (30 or 50 ml)
Plastic Petri dish (150 x 25 mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8, (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2, (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7, (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361, (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14, (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12, (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519, (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29, (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46, (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9, (8), e104250 (2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588, (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590, (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586, (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180, (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55, (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51, (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28, (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7, (6), e39264 (2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361, (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84, (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204, (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108, (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152, (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18, (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37, (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8, (8), e71317 (2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8, (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47, (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61, (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11, (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15, (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55, (1), 83 (2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9, (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26, (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49, (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10, (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19, (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19, (2), 191-203 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics