Author Produced

חוט השדרה עכבר בילוד דגם פגיעה דחיסה

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. L. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פגיעה בחוט השדרה (SCI) בדרך כלל גורמת גירעונות נוירולוגיות הרסניות, במיוחד בגלל נזק סיבי יורד מהמוח אל חוט השדרה. אזור נוכחי עיקרי של מחקר מתמקד מנגנוני פלסטיות אדפטיבית העומדים בבסיס התאוששות תפקודית ספונטנית או מושרה הבא SCI. התאוששות תפקודית ספונטנית מדווחת להיות יותר מוקדם בחיים, העלאת שאלות מעניינות על אופן שבו שינויים פלסטיים אדפטיבית כמו חוט השדרה מפתח. כדי להקל על החקירה של הדינמיקה הזאת, פיתחנו מודל SCI בתוך העכבר הילוד. המודל רלוונטי עבור ילדי SCI, אשר מעט מדי למד. בגלל פלסטיות עצבית המבוגר כרוכה בקצת המנגנונים כמו פלסטיות עצבית חייו מוקדמי 1, מודל זה עשוי להיות פוטנציאל כמה רלוונטי גם למבוגר SCI. כאן אנו מתארים את ההליך כולו להפקת דחיסה בעמוד השדרה לשחזור (SCC) פציעה עכבר בילודמוקדם ככל לאחר לידה (P) יום 1. SCC מושגת על ידי ביצוע laminectomy ברמת שדרה נתונה (המתואר כאן ברמות החזי 9-11) ולאחר מכן באמצעות מפרצה שונה Yasargil מיני-קליפ לדחוס במהירות לשחרר לחץ על חוט השדרה . כפי שתואר קודם לכן, העכברים בילוד נפצעו יכולים להיבדק על גירעונות התנהגותיות או הקריבו עבור vivo לשעבר ניתוח פיסיולוגי של קישוריות הסינפטי באמצעות טכניקות הקלטה אופטית אלקטרו תפוקה גבוהה 1. מוקדם יותר ומחקר מלווה באמצעות ערכה התנהגותית ופיזיולוגית הוכיח בפגיעה דרמטית, חריפה של תנועתיות hindlimb ואחריו התאוששות תפקודית מלאה בתוך 2 שבועות, ואת ההוכחה הראשונה של שינויי מעגלים פונקציונליים ברמה זיהה יורד 1 קשרים סינפטיים.

Protocol

פרוטוקול הניסוי אמור אושר על ידי הרשות הלאומית חית המחקר בנורבגיה (Forsøksdyrutvalget, מספר אישור ניסיוני המקומי 12.4591) בהתאם לתקנות טיפול בבעלי חי איחוד האירופי (אגודה למדעי בעלי חי פדרציה אירופאית מעבדה). נעשו מאמצים לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים והסבל שלהם. במאמר זה הליך המשמש על לאחר הלידה (P) יום 1 wild-type ICR (אזור בקרה החתמה) עכברים (ג'קסון, ארה"ב) מתואר אך באותה גישה יכולה לשמש גם בשלבים מאוחרים יותר.

1. בניית מערכת גז הרדמה עבור עכברים עובריים (איור 1)

  1. לבנות-מסיכת אף מהקצה של מזרק. חבר זה אל שסתום 3 כיווני עם צינורות פלסטיק (איור 1 - צינורות אדומים איור 2A1).
  2. לקדוח חור קטן בצד של מסכת האף לקשר זאת צינורות פלסטיק להסיר את בגלישה של גז מןמסכה. בסופו של הצינורות או על משאבת ואקום שנקבעה לחץ שלילי קל, או במנדף (איור 1 - צינורות ירוקים בהירים).
  3. תן תא הרדמה מצלחת פטרי פלסטיק 150 מ"מ x 25 מ"מ (איור 2A2).
    1. מצד אחד, לעשות חור גדול מספיק כדי להכיל את הראש של העכבר ואת מסכת האף.
    2. בצד השני, לעשות שני חורים קטנים שדרכם צינורות הפלסטיק ומן את מסכת האף יכולים להיות מוכנסים (איור 1 - צינורות ירוקים אדום בהיר, בהתאמה).
    3. עושה חור שלישי על החלק העליון של המכסה ומתחבר זה צינור פלסטיק שלישי המסתיים ב משאבת הוואקום (איור 1 - צינורות ירוקים כהים). מטרת הצינור שלישי זה היא להבטיח שכל גז עודף שלא נתפס על ידי לשקע מן מסכת האף מוסר.
  4. לבנות תא שינה על ידי יצירת חור בתחתית של כל סוג של צלחת מעבדה כי הוא גדול מספיק כדי גontain העכבר ויש לו יתרון חלק ואפילו (הפתח של המנה חייב לשקר סומק עם השולחן כדי למנוע דליפה של גז). חבר את החור בתא עד שסתום 3 הכיוונים עם צינורות פלסטיק (איור 1 - צינורות חומים). מניח את חדר השינה מתחת למכסת מנוע קטר.
  5. חבר שסתום 3 דרך הצינור לשקע מן מאדה (איור 1 - צינורות צהובים האיור 2A3).
  6. חבר את הכניסה של מאדה את אספקת החמצן (איור 1 - צינורות כחולים).

שינוי 2. קליפ מיני-Yasargil זמניים מפרצת ליצור את כלי דחיסה (איור 2 ולוח 1)

  1. הצמד את קליפ היטב עמדה עם מהדק. באמצעות זכוכית מגדלת המשקפת עבור שליטה ויזואלית, לשייף את המשטח החיצוני של הקצה של כל להב קליפ בעובי סופי של כ -150 מיקרומטר באמצעות אבן השחזה רכוב על מקדחה (התרשים 2B ו- C). הפוך פקק עבור קליפ על ידי חיתוך קטע קצר של צינורות נימי פוליאתילן (טבלה 1) תחת סטראו באמצעות מיקרו-סכין (טבלה 1), ומניחים הזה על אחד הלהבים (איור 2A4 ומספרים 2B ו- C). הדבר מונע סגירה מלאה של קליפ ויוצר ממדי דחיסה סטנדרטיים. כאשר הקליפ סגר את המרחק interblade הוא כ 230 מיקרומטר. הפוך פקק חדש עבור כל ניסוי כחומר פוליאתילן עשויים לדחוס במהלך שימוש, אשר ישנה את חלל interblade.
    הערה: המתח באביב קליפ פוחת לאורך זמן כך שלאחר כ -80 לחיצות קליפ כבר לא סוגר באופן מלא את המגופה צריך להיות מוחלף.

3. הכנה לפני הניתוח

  1. מניחים את העכבר בתא שינה (איור 1) וליזום הרדמה עם isoflurane 4% (איור 2A5 (איור 2A3 ולוח 1).
  2. בדוק את רפלקס הנסיגה של העכבר על ידי צובט את האינטרנט של עור בעדינות בין האצבעות עם מלקחי פלסטיק דקים. לעשות את זה בזהירות כמו עכברים שזה עתה נולד נפצעים בקלות. צביטת תוצאות קשות מדי שטפי דם מיידיים. ביצוע בדיקה זו בתחילת תרופות ההרגעה מעורר את רפלקס ומספק אינדיקציה טובה של כמות הכוח הדרוש.
  3. לאחר רפלקס הוא בוטל, להסיר את העכבר מאולם השינה ולמקם אותו אפרקדן על שולחן הניתוחים עם החוטם מוכנס לתוך מסכת האף המספק אספקה ​​רציפה של 4% isoflurane מעורבים חמצן טהור (איור 1). ודא כי כרית החימום מופעלת ומוגדרת 37-38 מעלות צלזיוס כפי היפותרמיה במהלך הניתוח יכול להיות קטלני.
  4. כדי להשיג שיכוך כאבים מלאים, להזריק תת עורי 50 μl של ההרדמה המקומית Bupivacain (2.5 מ"ג / מיליליטר, איור 2A7 ולוח 1) לבצע את הזריקה.
  5. מנמיך את ריכוז isoflurane נמסר מסכת האף 1-2%.

4. הגבי Laminectomy

  1. בצע ניתוח תחת בקרה מיקרוסקופית.
  2. לאחר ניקוי השטח ניתוח עם גלוקונאט כלורהקסידין (טבלה 1 # 19) לפחות 30 שניות, לעשות חתך בעור רוחבי 1-2 מ"מ T9-T11 באמצעות microknife (איור 2A8).
    הערה: העכברים בילוד ICR החלק המקורי של הבטן, גלוי כאשר הוא מכיל חלב, עומד בפני הרמות בחוליות T12-T13 (איור 3). ציון דרך נוסף הוא החלק המקורי של מצרף רקמת השומן התת עורית החזי שמסתיים בסביבות T8-9. אתר זה גלוי רק לאחר חתך בעור.
  3. (איור 2A9 ו A10) כדי להרחיב את הפתח העור בכיוון רוחבי כדי 8-9 מ"מ על ידי משיכת העור בעדינות rostrally ו caudally (העור דמעות בקלות, יצירת פצע חלקה וישרה). זה מספק גישה לרוחב מספיק אל עמוד השדרה.
  4. לחזור בו שולי החתך בעור ממבנים בסיסיים על ידי הוספת חתיכות סטרילי של ספוג הג'לטין עוצר דמום (איור 2A11 ולוח 1) תת עורי מקורי ואת זנב אל החתך. זה מגדיל את הפתיחה ומונע על העור מפני חוזרת בה ולטשטש את האזור במהלך הניתוח. ספוג ג'לטין עוצר דמום לא צריך להיות טבול מלוח לפני השימוש.
  5. כדי לחשוף את עמוד השדרה, לנתח את השרירים ליד חוליות עמוד השדרה באמצעות מספריים דקים (איור 2A12, ולוח 1). חותכים את הקבצים המצורפים של השרירים אל עמוד השדרה ולחשוף את lamina (איור 4 א). לֹאדואר גם כי בשלב זה בתהליך השדרה אינו מפותח.
  6. זהה את קו האמצע וחותך רוחבי בין שני הרבדים (אשר בשלב זה הוא סחוסים) במספריים דקים (איור 4B). בזהירות במקום להב אחד מלקחיים דקים בין lamina ואת הדורה (האיור 4C), לתפוס את lamina עם המלקחיים להרים אותו בזהירות עד פיסה שובר משם, משאירה את הדורה ללא פגע (איור 4D). חזור על 2-3 פעמים כדי לקבל laminectomy ארוך תחום 1-2.
  7. באמצעות מלקחיים רזה כמו rongeurs, להסיר חלקים של המפרקים פן בילטרלי כדי לקבל מספיק מקום כדי למקם את הקליפ בתוך תעלת השדרה. נקה את אזור הניתוח ולשלוט דימום עם חתיכות קטנות של ספוג הג'לטין עוצר דמום.

5. פגיעה בחוט השדרה דחיסה

  1. פתח את מפרצת מיני-קליפ שונה במחזיק קליפ (איור 2A13 ואיור 2B) ואת המקום הלהבי דואר משני צדי חוט השדרה בחללים בין הפן מצטרף ואת החוט. ודא כי להבי מוכנסים מספיק עמוק כדי להשפיע על חלק הגחון של חוט השדרה. אם הדבר אינו אפשרי, להסיר יותר של המפרקים פן.
  2. שחרר את-קליפ מיני במהירות, מחזיק אותו במקום עם בעל קליפ למנוע ממנה לזוז. שמירה על הדחיסה במשך 15 שניות.
  3. פתח את-קליפ מיני במהירות ולהסיר אותו. כדי להשיג דחיסה סימטרית, להפוך את הכיוון של קליפ מיני, ושימוש הסימן בולט לעין שבצע בצקת והדימום מן הדחיסה הראשונה כמדריך, למקם את הקליפ בכיוון ההפוך עבור דחיסה של 15 שניות שנייה (לפני ניסוי הראה כי זה מייצר גירעונות היסטולוגית ופיסיולוגיים סימטריים, ואילו לחיצות בודדות לא 1). דורה לא צריך להיפגע על ידי דחיסה.
  4. נקו את האזור ולשמור המוסטאסיס עם חתיכות של ספוג הג'לטין עוצר דמום.
  5. מוציאים את חתיכות של ספוג הג'לטין עוצר דמום שהונחו תחת שולי החתך בעור בתחילת הניתוח ולסגור את החתך בעור עם 6.0 תפר סטרילי בעל מחט (איור 2A14 ו -15).
  6. להזריק מתחת לעור 0.75 מ"ג / ק"ג משקל גוף עצירות (איור 2A16) מדולל PBS סטרילי באמצעות מזרק אינסולין (300 μl, 30 G).

6. טיפול לאחר הניתוח

  1. הסר את עכבר מסכת האף ולמקם אותו סט קאמרי בקרת טמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס עד ההרדמה פגה והעכבר הופך התראה (השעה 1-3 היא בדרך כלל מספיק).
  2. להזריק דיאזפם (איור 2B17) intraperitoneally לתוך אמא (8 גרם / ק"ג משקל גוף). זה יוצר וטשטוש מפחית את הסיכון של קניבליזם במהלך הלילה הראשון, כאשר סיכון זה הוא גבוה ביותר.
  3. החזר את העכבר פעל לכלוך רב.
  4. אם ההמלטה היא אניarge (> 12 גורים), להסיר חלק גורי unoperated, חיות הגדולות מועדפת אם הם נבדלים זה מזה בגודל, כדי להפחית את התחרות עבור החלב. טיפול אימהי של הגורים המופעלים עדיף בקו ICR אם גודל ההמלטה הוא כ -9 גורים.
  5. לניהול כאב, לנהל עצירות (0.75 מ"ג / ק"ג משקל גוף) תת עורית פעם ביום בימים שלאחר הניתוח הראשון, באמצעות מזרק אינסולין (300 μl, 30 G). נפח מתאים להזרקה תת עורית הוא 30-50 μl. ב ניקוד תסיסת עכברים בילוד מהווה אינדיקציה טובה של כאב.
  6. בצע בדיקה יומית של העכברים הפצועים באמצעות גיליון ציון להעריך תזונה, משקל גוף, התייבשות, כאבים, ריפוי פצעים, אצירת שתן ומצב זיהום. על פי התוצאה המתקבלת, לספק טיפול מיוחד, כגון זריקות של פתרון תזונת ילדים סטריליים (טבלת 1 # 18) במקרה של תזונה לא נורמלית. על דף התוצאות גם0; מגדיר קריטריונים קצה אנושי. אמא כי אינו שולל את הגורים נפצע הוא המטפל הטוב ביותר.
  7. במקרה היוצא הדופן של חוסר תפקוד שלפוחית ​​שתן, לבצע עיסוי שלפוחית ​​שתן פעמים ביום עד הפונקציה משוחזרת. הדבר נעשה על ידי הצבת העכבר במצב שכיבה ביד אחת מעסה את הבטן התחתונה בעדינות בכיוון rostro- הזנב באמצעות האצבע.

Representative Results

פציעה ואובדן דחיסה בעמוד השדרה של פונקציה

כפי שתואר קודם לכן, על ידי אופטימיזציה של טרום ניתוחי, ניתוחים לאחר הניתוח, מודל SCI דחיסה לשחזור של עכבר בילוד ניתן להשיג 1. פקק פוליאתילן דגש על להב אחד קליפ (תרשים 2B ו- C) מונע סגירה מלאה של הקליפ שומר על מרחק שבשבת היתר בעקביות בסביבות 230 מיקרומטר. היפוך הכיוון של קליפ בין שתי תוצאות הלחיצות ב פציעה סימטרית, כמו להישפט על ידי סיבוכים היסטולוגית (איור 5 א ו -1). מייד לאחר הסרת המיני-קליפ, רקמת חוט השדרה הדחוסה הופכת כהה בשל חבלה המורגי ובצקת. תצפית של קטעי סדרה של חוט השדרה נפגע מוכתמים עבור Eosin ו Hematoxylin כבר ביום אחדחרה פציעה מגלה הידרדרות הדרגתית של הרקמות כאשר מתקרב מוקד הנגע (איור 5 א). הנוכחות של חללים או דם Intraspinal ב הנגע אינה יוצאת דופן.

הערכה התנהגותית, למשל על ידי מעקב אחר מסלולי hindlimb בתנאים נושאות משקל הלא כמה שעות לאחר הניתוח, מראה בפגיעה דרמטית תנועתיות hindlimb בעכברים SCC נפצעו לעומת עכברים שליטה דמה שבו רק laminectomy מתבצע (איור 5 ב ו 1) . בדיקה זו ניתן לחזור עד שהעכבר הוא מסוגל לבצע בדיקות התנהגותיות אחרות שדורשות נושאת משקל משלה 1.

תמותה והתאוששות לאחר ניתוח

התמותה Intraoperative נובע בעיקר דום נשימה ו דום לב נגרם על ידי ריכוז גבוה של isoflurane הדרושה להשגת anesthesi מספיקא. היכרות עם Bupivacaine ההרדמה המקומי לפרוטוקול כירורגית מתירה הפחתה של ריכוז isoflurane ובכך מפחית את שיעור התמותה באופן משמעותי. בסדרת הניסויי אחרונה כוללים יותר מ -20 חיות, התמותה במהלך הניתוח הייתה אפסית. לעומת זאת, שלאחר ניתוח הישרדות מושפעת בעיקר קבלת העכברים המופעלים על ידי אמם. שיפור משמעותי חל כאשר החרדה ואת האגרסיביות הופחת על ידי מתן זריקה אחת של דיאזפם (IP 8 גרם / ק"ג משקל גוף) לאם לפני שחזר העכברים פעלו המלטה 1. קבלה והתאוששות לאחר ניתוח של העכברים פעלו יכולים להיות במעקב על ידי הנוכחות של חלב בבטן. הקיבה של עכבר P1-P7 כי יש חלב שיכור הוא לבן ברור ונראה לעין דרך עור הבטן (איור 3). השוואת ההאכלה פעלה, בקרת אחיזת עיניים ועכברי unoperated שימושית להערכת המצב התזונתי של לפציעהעכברים ד. הערכת הצמיחה של מופעלות לעומת עכברי unoperated מראה כי על אף ירידה במשקל מעט במשך היום שלאחר הניתוח הראשון, עקומת הצמיחה של עכברים פעלו מנרמלת במהירות ואילך (איור 6). תמותה הקשורים בתפקוד שלפוחית ​​השתן או זיהום לא נצפתה גם בעכברים למד עוד 7 שבועות.

<td> 10
מספר באיור. 2 שֵׁם יצרן / ספק התייחסות # קישור הֶעָרָה
1 מזרק פלסטיק (30 או 50 מ"ל)
2 צלחת פטרי מפלסטיק (150 x 25 מ"מ)
3 מאדה Fortec isoflurane Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ אנו משתמשים ו מכשיר ישן שאינו מיוצר יותר, בדקו את הקישור עבור מכשיר חדש
4a זמני מפרצת Yasargil מיני-קליפ Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b מזהה 0.58 מ"מ צינור נימי פיין נשא פוליאתילן, OD 0.96 מ"מ רפואי Smiths 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isoflurane (Forene) אבוט GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (Bupivacain) אסטרה-זנקה http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 מזרק Insuline 0.3 מ"ל 30 G 8mm x VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 חוד החנית פיין מיקרו סכין 5 מ"מ Ultra כלי מדע פיין 10,315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
קאט & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 מלקחיים בסדר גרף חוץ - טיפ 0.5 מ"מ כלי מדע פיין 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
קאט & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1
לא באמת הכרחי, לעתים קרובות השיניים הן גדולות מדי
מלקחיים SuperGrip ישר כלי מדע פיין 00,632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
קאט & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1
שני מלקחיים נחוצים
11 Spongostan מיוחד 70 x 50 x 1 מ"מ Ferrosan
12 מספרי האביב Vannas - 2 להבי מ"מ ישר כלי מדע פיין 15,000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
קאט & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 מלקחי קליפ Vario החלת Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) ג'ונסון וג'ונסון J105G
15 בעל מחט מיקרו Diethrich 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (עצירות) Schering-Plough
17 Stesolid (diazepam) Actavis ידוע גם בשם הווליום
18 Pedamix Kabi Fresenius http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (gluconate chlorhexidine) FresenKabi ius D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

רשימת טבלת 1. כלים וציוד להפקת פציעת דחיסה בעמוד שדרה מונחה קליפ עכבר בילוד.

איור 1
איור 1. סכמטי של התקנת הרדמה. סכמטית זה מציג את התקנת ההרדמה מיועדת העכבר בילוד, עם תא שינה עבור הרדמה ראשונית מכשיר מסיכת אף הרדמת המשך במהלך ניתוח.

איור 2
איור 2. כלים עיקריים קליפ דחיסה. (א) כלים המשמשים במהלך ההליך. המספרים תואמים את הביאור המשמש בטבלה 1. (B ו- C) ממפרצת זמני Yasargil מיני-קליפ עם הקצה של כל להב גזוז ידני עד כ 150 מיקרומטר עובי. פקק עשוי פרוסת צינורות פוליאתילן (טבלה 1) מושם על אחד הלהבים כדי למנוע סגירה מלאה של קליפ. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. App: מוליך קליפ (12 # ב א); St:. פקק אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. לנדמרק להערכה לפני הניתוח של רמת השדרה עכבר בילוד ICR. (א) להציג לרוחב של עכבר ICR P1 עם חלב לבן בשנות ה tomach. החלק המקורי של הקיבה מתאימה לרמת שדרת T12-T13. (ב) העכבר P1 ICR בהרדמה ב אפרקדן. אמנם יותר קשה לדמיין מאשר (א), הקיבה מלאת חלב ניתן לזיהוי. החלק המקורי של הקיבה עולה רמת T12-T13 שדרה. ברי סולם: 0.5 סנטימטר.

איור 4
איור 4. הגבי laminectomy. (א) Dissection של השרירים ליד חוליות עמוד השדרה. שים לב בגיל זה תהליך השדרה אינו מפותח. (ב) חתך האלכסוני של lamina במספריים דקים. (ג) מבוא של להב אחד מלקחיים דקים בין lamina ואת הדורה. נקודת הכניסה מוצגת על ידי ראש החץ. (ד) הסרת lamina. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ.

קבצים / ftp_upload / 53,498 / 53498fig5.jpg "/>
איור 5. היסטולוגית ותוצאות התנהגותיות לאחר פציעת דחיסה בעמוד השדרה ב P1. (א) Eosin ו Hematoxylin מכתים בסעיפי חוט שדרה של עכבר פצוע (1 יום לאחר פציעה) במרחק שונה מן מוקד פציעה. (ב) עקבות נציג של מסלולי forelimb ו hindlimb נצפו 6 שעות לאחר פציעה או לאחר laminectomy מלא דמה. עקבות על גבי מייצגי מסלולים צופים נוף רוחבי של החיה. עקבות בתחתית מייצגי מסלולים מנקודת היבט הגחון של החיה. ראו גם 1. סרגל קנה מידה: 250 מיקרומטר. ד"ה: בקרן הגבית; L, עזב; R: ימין; SCC: דחיסה בעמוד השדרה; VH:. צופר הגחון אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. עקומות גדילה השוואתיות. היסטוגרמה המציגה את העלייה במשקל של עכברי unoperated ו SCC נפצעו מיום לידת 1 עד היום לאחר לידת 9.

Discussion

במאמר זה הליכי פציעה SCC שנוצר קליפ בעכברים P1 מתוארים. הנהלים אותו יכול גם להתבצע בשלבים מאוחרים יותר. פציעות דחיסה בוצעו בהצלחה P5, P7, P9 ו P12 (Züchner, et al., כתב היד בהכנה). בכלל שלבי הלידה, הרדמה כללית מתקבלת עם isoflurane מתאדה חמצן טהור, אבל תוצאת ההרדמה מאוד תלויה בגיל. בשנת הניסיונות הראשונים ב P1-P4, לפני ההרדמה מקומית הוכנסה לפרוטוקול, אז זה היה קשה להשיג הרגעה עמוקה וממושכת עקב חלון במינון ותוצאה צר שבין הרגעת יתר מספיק. בנוסף, חששות הקשורים השפעת neurotoxic של isoflurane בחי יילוד הועלו 27-30. שילוב של isoflurane ותוצאות Bupivacaine המקומיות הרדמת הרדמה עמוקה יותר ויציבה יותר תוך התרת הפחתה במינון isoflurane בפקטור של 2-3. סוגים שונים של anestheSIA תואר מכרסם בילוד, כולל cryoanesthesia 31,32, אבל אי נוחות פוטנציאל אחד cryoanesthesia הוא אפקט נוירו שלה (נבדק על ידי 33,34), אשר יכול לסבך את הדור של פציעה יעילה לשחזור. הרדמה מבוססי ברביטורטים נחשב כבעל יעילות נמוכה בעכברים בילוד בשל רמות נמוכות של אלבומין בסרום ואת השומן בגוף מאשר במבוגרים 35,36.

למרות די פולשנית וטראומטית, פעם ההליך הוא הקים את שיעור התמותה במהלך הניתוח הוא נמוך. עם זאת, ישנם צעדים קריטיים במהלך ההליך הדורשים תשומת לב מיוחדת כדי לשפר את ההתאוששות ואת ההישרדות של העכברים פעלו. סוגיה חשובה אחת היא לבחור גורים כי תהיה את הסיכוי הטוב ביותר לשרוד את הניתוח. כאשר ההמלטה היא גדולה מצבו התזונתי של גורי הפרט משתנה. בנוסף דימום בלתי נמנעת המתרחשת במהלך הניתוח, גורים המופעלים לבלות שעהזה מן האם, ולעתים קרובות הם לא שותים חלב לפני למחרת בבוקר. זהו אפוא יתרון לבחור גורים שכבר כמות מסוימת של חלב בבטן. זה גלוי בקלות דרך עור הבטן בין P0 ל- P7.

במהלך הלילה הראשון את הגור המופעל נמצא בסיכון גדול להיות שפורק על ידי האם. במהלך פיתוח ראשוני של מודל זה יותר ממחצית העכברים פעלו נעדרו למחרת בבוקר, עם סימנים ברורים של דם בכלוב. Necrophagy, קניבליזם תינוקות במכרסמים נחקרו במשך עשרות שנים 37-40. במחקר זה, קניבליזם היה עדים רק פעם אחת, אבל נחשב הסבר הסביר יותר necrophagy כי הגורים שהוחזרו לכלוב היו בדרך כלל במצב טוב כך מות מסיבות טבעיות במהלך הלילה נראה רחוק מסביר. דבר זה הוביל את הרעיון של שימוש תרופתי הפיך כגון דיאזפם להפחתת חרדה ותוקפנות in האם (ביקורת ב -41). הזרקת Intraperitoneal של דיאזפם שיפר מאוד את המצב, שומטת התמותה במהלך הלילה הראשון מתוך יותר מ -60% לפחות מ -20%.

צמצום גודל המלטה ע"י דילול ומפר את ההמלטה כמה שפחות לאחר שב לאחר ניתוח הם אלמנטים נוספים שיכול להועיל חיות פעלו. עם זאת, משאיר גורים פעלו רק עם האמא הוא לא מועיל. את האיזון הטוב ביותר של גורים שמופעלים / unoperated עשוי להשתנות בהתאם לענף, אבל עבור עכברי ICR ו SCID-ICR עוזבים 4-5 גורים מופעלים (פציעה או אחיזת עיניים) יחד עם 3-4 גורי unoperated נתן את התוצאות הטובות ביותר.

במובן כללי, המגבלה העיקרית של מודל בילוד SCI זה היא כי חוט השדרה בילוד שונה במובנים רבים מן חוט השדרה מבוגר, ולכן לא יכול לספק תוצאות הניסוי כי הם דומים לאלה שהושגו ממודלים SCI מבוגר. הבדלים כאלה כוללים שגודל כולל של שרירים נפח של חוט השדרה, מספר תאים, תת-ייצוג של סוגי תאים מסוימים כגון oligodendrocytes, תגובות חיסוניות בשלה ומעגלים עצביים בשלה. מסקנות מניסויים במודל זה חייבים אפוא לשקול בזהירות. מצד השני, המודל רלוונטי עבור התרחיש יחסית פחות הנחקר של SCI ילדים. יתר על כן, החולשה לכאורה ביחס למודלים מבוגרים SCI הוא גם כוח פוטנציאלי זה עלול להביא להבהרת מנגנונים פלסטיים כי, למרות מינימאלי המצוי חוט השדרה המבוגר, יכול לייצג מצע טיפולי אם כינה. זה מתקבל על הדעת כי השבה של בתנאים בילוד או אפילו עובריים יכול להיות מיושם באמצעות השתלת פחות מפותחות תאים או רקמות או על ידי טיפול עם ריאגנטים כי לעורר את הרקמה הבוגרת עם מאפיינים התפתחותיים מוקדם. באמצעות אנזימים לחסל רשתות perineuronal הוא דוגמה של הגישה השנייה 42,43.

"Jove_content"> נושא מרכזי בעת ההקמה במודל חיה עבור SCI הוא להשיג פגיעה סטנדרטית. זהו היבט חשוב כי טופל במודלים מרובים SCI, למשל, חיתוך הרוחב, hemisection, אימפקטורים, דחיסת בלון, למעוך מלקחיים, דחיסת משקל סטטי, וכו 'עם כל כבוד להשפיע התקנים, מאמצים בכיוון הזה גרמו דגמי SCI ב מכרסמים מבוגרים שבו מספר רב של פרמטרים של ההשפעה כגון מהירות, כוח ומשך ניתן להשפיע (הנסקרת ב -44). גישה אחרת, מעורב ציוד פחות, מעסיקה שינוי של קליפ מפרצת Kerr-Lougheed 45,46. גישות אלה 2 משלימות כמו impactor מחק פציעת חבלה ואילו מחק קליפ פציעת דחיסה עם מידה מסוימת של איסכמיה במקביל. בגלל האילוצים בהיקפים המשמעותיים הפגיע גדול יותר של עכברים בילוד, קשרה את התמותה הגבוהה עם ניתוחים כבר כמו גם את העלויות של developing ציוד בקנה מידה קטן יותר, הוא נבחר לפתח דחיסה שנוצר קליפ ולא בגישה contusion impactor שנוצר. הדבר זה הושג על ידי התאמה-קליפ מיני מפרצה זמינה מסחרי כדי להתאים את הגודל של עמוד השדרה של עכברים בילוד 1. הוספת פקק מבטיחה רוחב דחיסה סטנדרטי, וכל עוד את המתח של קליפ דוחס עד קצה גבול היכולת של הפקק, הכח של הדחיסה במהלך שלב סטטי ברוחב מינימאלי צריך להשתנות מעט. מה שלא טופל הוא המהירות של הדחיסה במהלך השלב הדינמי שלה, מאז זה ישתנה כמו שינויי המתח קליפ במהלך חייו. כשלב סטטי של הדחיסה נמשך זמן רב יותר בשלב הדינמי, ויש מעט להציע כי רקמת חוט השדרה מפעילה הרבה של נגדי כנגד להבי המיני-קליפ, סביר להניח כי חומרת הפציעה הכי תלויה בשלב סטטי. זה, לעומת זאת, נשאר להיבדק. פציעהחומרת עשויה להיות תלויה בגורמים רבים, כולל כוח דחיסה סטטי ומשך, מהירות דחיסה ופריסה, עמדת-קליפ מיני, ומספר לחיצות מתבצעת באותו אתר. לפיכך, וריאציה קומבינטורית בפרמטרים אלה עלולות לגרום הדור של ספקטרום של חומרות פגיעה כתוצאה חלשה עד חמור. למרות הסיכון הקיים השתנות, במחקרנו שפורסמו בעבר 1 השגנו תוצאות עקביות ב היסטולוגית, רמות פיזיולוגיות והתנהגותיות, כך שיש מעט להציע כי סטנדרטיזציה מקובלת קשה להשיג. נציין כי במחקר זה השתמשנו בשיטות מרובות של אימות בכל רמה, כולל בדיקות התנהגותיות כגון דריכת אוויר כפי שמוצג באיור 5.

במודל SCI בילוד זו הפגיעה חוסכת שיעור מסוים של אקסונים ובכך מספקת מצב נוח לעורר פלסטיות אדפטיבית דרך מחדש modelinגרם של קשרים חסך לבין היווצרות של מעגלים חדשים. יתר על כן, מאז העכבר בילוד מתאים גם לחקירה על ידי שיטות ניסיוניות רבות, ניתן להשתמש במודל זה כדי ללמוד התאוששות תפקודית פלסטיות אדפטיבית עם גישה אינטגרטיבית, כולל בדיקות התנהגותיות, מדרדר ו האנטרוגרד מעקב axonal, אימונוהיסטוכימיה, אלקטרופיזיולוגיה וגבוה הקלטת 1 אופטית -throughput. כדוגמא, ונצלנו גישת אינטגרטיבית זו להפגין מחדש מודלי רשת ברמת תשומות יורדות ספציפיות באמצעות הדמית סידן תפוקה גבוהה ב vivo לשעבר הכנות wholemount של גזע המוח 1 חוט שדרה נפגע. זה יכול להיות דחף נוסף באמצעות נוירו-optogenetic ופרמקולוגיה optogenetic כלים להעריך את השיפוץ של קשרים סינפטיים בין תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים שדרה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic syringe (30 or 50 ml)
Plastic Petri dish (150 x 25 mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8, (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2, (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7, (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361, (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14, (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12, (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519, (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29, (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46, (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9, (8), e104250 (2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588, (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590, (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586, (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180, (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55, (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51, (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28, (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7, (6), e39264 (2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361, (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84, (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204, (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108, (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152, (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18, (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37, (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8, (8), e71317 (2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8, (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47, (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61, (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11, (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15, (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55, (1), 83 (2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9, (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26, (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49, (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10, (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19, (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19, (2), 191-203 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics