产妇血管重构的评估在怀孕期间在小鼠子宫

Developmental Biology
 

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Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Colucci, F. Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (106), e53534, doi:10.3791/53534 (2015).

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Abstract

Introduction

营养物质,气体和废产物的过程中真哺乳亚纲妊娠交换是由胎盘介导的。在女性生殖道,子宫动脉是血液的主要管道到子宫。植入后,这些分支成为专门的容器被称为螺旋动脉通过底蜕膜对胎儿胎盘单位线圈。直径和这些螺旋动脉,这是由白细胞包围,尤其子宫自然杀伤(UNK)细胞的弹性,决定体积和血液可用速度胎盘1,2。正确的血流动力学改变为螺旋动脉重塑的结果是妊娠成功的关键。

而潜在的机制在人和鼠妊娠之间的细节不同,在这两个物种重塑过程的最终结果是扩张型,高电导脉管即失去了它的平滑肌层。在小鼠中,UNK细胞衍生的干扰素(IFN-)γ就要引起这些变化在大约妊娠中期3-5。缺乏或者NK细胞或IFN-γ信号传导途径的组分小鼠不能经受这些变化,这是与减少胎儿生长6,7-关联,强调的充足的血液供应,胎儿胎盘单元的重要性。在人类早期妊娠,外滋养细胞的间质及血管内入侵及其与UNK细胞的相互作用是引起血管改变,促进胎儿生长8-10重要。 UNK细胞可以通过趋化因子11和细胞因子如粒细胞巨噬编排人类滋养细胞浸润-集落刺激因子(GM-CSF)12。浅滋养细胞浸润与减少动脉重塑和妊娠并发症,如先兆子痫9相关联。

该协议是基于安妮·克罗伊是谁介绍的很重要的开创性工作免疫系统,特别是NK-衍生的IFN-γ通过免疫组织化学和优雅转移实验5,13成功血管重塑的作用。在这里,我们描述了一种快速而经济的方式,以评估螺旋动脉重塑状态。虽然我们实验室常规于妊娠中期(妊娠天(GD)9.5)14评估这个,重塑过程需要gd8.5和12.5 15之间的地方。自动幻灯片扫描仪的出现,极大地促进了血管和管腔面积的评估由部分,我们发现这是不是测量血管直径更可重复的方法。在加入免疫组化检测的SMA的允许从体视评估获得的结果的一个简单的验证。如同所有的体视技术,建议由至少两个审查员来执行评估作为一个盲实验。为此目的,一个随机化步骤可以引入时串行地切婷的样本,以便评估的幻灯片研究者不知道从哪个实验组的样品来。

该协议的总体目标是提供一个可靠的工具来仔细评估螺旋动脉重塑在小鼠中定义母亲和父亲的基因型,在小鼠模型妊娠并发症的范围内。结果强调在此过程中,这是正常的胎儿生长所必需的细胞UNK的依赖性​​。

Protocol

在这个手稿中讨论的所有程序都是按照英国内政部法规和剑桥伦理审查委员会的批准。

1.标本采集

  1. 设置使用8-12周龄的雌性C57BL / 6小鼠成年男性(最多2个每个女性的男性),下午定时交配。检查阴道塞的存在,作为交配的标志在随后的日子里的清晨。塞在早上马克gd0.5的存在。
  2. 上gd9.5,安乐死动物通过颈脱位和打开腹腔。需要注意的是安乐死的CO 2可能会引起血管扩张。
  3. 使用牙线轻轻结扎子宫动脉图1,虚线箭头)。扎周围动脉牙线在每个子宫角,近端至卵巢的尖端,以及围绕子宫颈。
    注意:不要破裂的血管,因为这可能会导致崩溃的动脉。
  4. <利>迅速解剖子宫使用解剖剪刀,远侧切除整个子宫的三个连接点在子宫角和子宫颈的尖端。
  5. 将子宫,对准备好的聚苯乙烯片使两个角都沿着长轴从子宫颈相反的方向对齐。轻轻地伸展并销插入使用2-3个地下25针的地方。
  6. 浸入聚苯乙烯成制备50ml锥形管中。补足至50ml,用10%福尔马林中。定为5-6小时,在室温下进行。
  7. 丢弃福尔马林溶液和替换用50ml 1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)5分钟。
  8. 近侧到各端的连接点和近侧切除两个子宫角,以在中心子宫颈,修剪掉周围的植入位置的任何多余的脂肪和在PBS中清洗两次,每次5分钟,以去除福尔马林的痕迹。
  9. 存储在70%乙醇的样品在4℃(长达两周)直到加工。
    注意:的Ethanol是高度易燃的。
  10. 使用使用表1所示的参数的自动处理系统。在石蜡单独嵌入的角,以便它们可以沿垂直于子宫的长轴进行切割。这确保了每个植入部位的最大面积将在块2A)的中间被暴露以供分析。
    可选:这是针对该块的随机化方便的时间点,如果需要的。
  11. 用切片机,切断从块7微米厚的连续切片。在染色行HE每49微米间隔一个部分(H&E,见2.1)。存储的剩余部分在室温下的SMA染色和其他下游应用。
:21px;“>二甲苯
时间 温度
70%乙醇 1小时 40℃
100%乙醇 1小时 40℃
100%乙醇 1小时 40℃
100%乙醇 1小时 40℃
100%乙醇 1小时 40℃
100%乙醇 1小时 40℃
100%乙醇 1小时 40℃
1小时 40℃
二甲苯 1小时 40℃
二甲苯 1小时 40℃
石蜡 1小时 63℃
石蜡 1小时 63℃
石蜡 1小时 63℃
石蜡 1小时 63℃

表1:设置用于子宫组织的处理设置用于自动组织处理概述

2. STEReological评估

  1. H&E染色
    1. Deparaffinize切片浸入滑动地安装在滑动机架的100%二甲苯浴中10分钟,在室温下。
      注意:二甲苯是易燃品,可疑致癌物是通过接触和吸入有毒。这项工作要在通风橱中进行,使用个人防护装备(PPE)。
    2. 浸入含有清洁二甲苯另外10分钟,在滑动浴。
    3. 顺序地浸入载玻片在含有100%的乙醇,95%乙醇,70%乙醇与纯净水,每次5分钟浴。
    4. 沉浸载玻片于50%吉尔否3苏木溶液,用纯化水稀释,5分钟。
      注意:苏木是通过摄入和接触对眼睛有害。在处理时应佩戴合适的个人防护装备。
    5. 流动的自来水10分钟在染色槽洗幻灯片。
    6. 在1%的浸入滑动酸/醇溶液(1%10M的盐酸在70%乙醇),持续10秒和洗涤,并在染色槽流动的自来水。
    7. 浸泡在曙红溶液玻片30秒和下流动的自来水10分钟在染色槽清洗。
    8. 内通风橱,依次浸入载玻片在含有70%乙醇,95%乙醇和100%乙醇,每次5分钟浴。
    9. 浸入含有二甲苯10分钟洗澡幻灯片。
    10. 摩盖玻片用二甲苯基的安装平台。在之前的可视化,在显微镜下将载玻片在通风橱干燥水平地和彻底。
  2. 血管的大小和重塑状态体视评估
    1. 对于每个着床部位,确定哪些部分是靠近正中矢状点。胎儿和胎盘显影之间的绒毛尿囊附着用作正中矢状点的良好指标。
    2. 选择3个部分,在49微米的间隔接近正中矢状点进行分析。扫描选定的幻灯片。为了避免增量泸静脉,这已被证明是更位于边缘的在植入部位16,限制在每个植入位点2A)的中央2/4的分析。
    3. 为了评估管腔大小,绘制血管周围的内侧,并记录此形状的面积。总容器大小,绘制围绕容器的外壁上,包括内皮细胞,周细胞和壁间白细胞。
      注意:总血管大小的腔比为容器的重塑状态的代理。作为船只通过该部被切断沿平面线圈,可能存在在一个滑动同一动脉的多个横截面。避免测量同一动脉多次。
    4. 记录在每个种植部位与最大和最圆流明的5艘测量。测量一式三份的每个植入位点(三个部分隔开49微米彼此分开)。这些15个测量represe平均NTS的最大船只的平均直径。
    5. 为了避免一些样品中较大的血管比例过高,测量容器中的每个植入位点的数目相同。

3.定性评估采用免疫组化

  1. 脱蜡和补液
    1. Deparaffinize切片浸入滑动安装在耐热滑架的100%二甲苯浴,在室温下10分钟。
    2. 浸入含有清洁二甲苯另外10分钟,在滑动浴。
    3. 顺序地浸入载玻片在含有100%的乙醇,95%乙醇和70%,纯化水,每次5分钟浴。
  2. 抗原检索
    1. 制备在纯水中的10 mM柠檬酸钠缓冲液,并调整至pH 6,用10摩尔的盐酸。
    2. 填写一个耐热的容器,可以容纳含有足够笏国内压力锅600毫升用400毫升柠檬酸钠缓冲液和地点呃淹没容器的一半。松散地连接高压锅热的盖,直至沸腾。
    3. 地方玻片架放入柠檬酸钠缓冲液和紧密固定压力锅的盖上。一旦加压,使沸腾3分钟。
    4. 降压压力锅,取出内部容器。允许滑动到在柠檬酸钠缓冲液冷却,在室温下10分钟。
    5. 洗幻灯片中含有纯净水5分钟洗澡。
    6. 环绕使用疏水性屏障笔的部分。
    7. 通过浸没在PBS 5分钟洗幻灯片。
  3. 阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合
    1. 孵育3%过氧化氢稀释在纯水中,在湿润的腔室30分钟,在室温下部分。
      注意:过氧化氢是强烈刺激眼睛,皮肤和在摄入。穿戴合适的个人防护装备。
    2. 挖掘掉多余的过氧化氢溶液和洗涤SLI德两次通过浸没在Tris缓冲盐水(TBS)中,每次2分钟。
    3. 孵育小鼠免疫球蛋白封闭试剂从根据制造商的说明制备对小鼠套件鼠标部分。
    4. 洗涤滑动两次在TBS中每2分钟。
  4. 平滑肌肌动蛋白免疫检测
    1. 制备抗体稀释液(在试剂盒中提供),并孵育切片5分钟,在室温下,或根据制造商的说明。
    2. 稀释1:100的小鼠抗人平滑肌肌动蛋白(DAKO M0851)在抗体稀释液溶液。稀释在抗体稀释溶液小鼠IgG2a同种型对照,以确保最终的免疫球蛋白浓度在两种解决方案等效的。
    3. 点击多余的抗体稀释溶液,并覆盖部分与任何稀释的抗体或同种型控制解决方案。孵育在一个加湿室中30分钟,在室温下进行。
    4. 洗涤滑动两次在TBS中每2分钟。
    5. 稀释生物素化的抗小鼠二抗孵育切片在室温下10分钟,或根据制造商的说明。
    6. 洗涤滑动一旦各用TBS和PBS进行2分钟,分别。
    7. 根据制造商的说明制备3,3'-二氨基联苯胺(DAB)溶液。顶盖采用DAB溶液部分和孵化长达4分钟,确保监测部分,以避免过多的颜色变化。
      注意:DAB是易燃品,可疑致癌物是通过接触和吸入有毒。在处理时应佩戴合适的个人防护装备。
    8. 沉浸在纯净水滑梯,一旦染色所需的强度达到。
    9. 染液用50%吉尔号3苏木为20秒,并在流动的自来水直到水运行清楚在染色槽清洗。
  5. 脱水和安装
    1. 在通风橱中,依次浸泡在含70%ETH浴场幻灯片anol,95%乙醇和100%乙醇,每次5分钟。
    2. 浸入含有二甲苯10分钟洗澡幻灯片。
    3. 摩盖玻片用二甲苯基的安装平台。在通风橱中可视化,在显微镜下将载玻片事先干燥水平地和彻底地

Representative Results

的Rag2 - / - IL2RG - / -小鼠缺乏所有成熟淋巴细胞,包括NK细胞17,它们的子宫动脉不能经受周围妊娠中期-5,14-见于同类系野生型C57BL / 6(WT)小鼠中的血管变化。因为这减少重塑的Rag2的结果- / - IL2RG - / -小鼠显示显著较小腔表面区域,表示整体较小的船只,可显现在H&E染色的切片和量化stereologically( 图2)。此外,相对壁厚(容器腔比)在这些小鼠的螺旋动脉增高,提示血液供应减少和较高的血流速度。

采用免疫组化检测SMA的这种量化考核确认。它的特点为野生型小鼠的血管中层内失去大部分的SMA的螺旋动脉通过妊娠中期。如果此NK细胞驱动的过程中不发生,SMA保留在容器的介质,并且可以容易地免疫组织化学检测为周围的血管图3)的环。

图1
图1:小鼠子宫在gd9.5,示意图示出子宫角,子宫颈(蓝色)的相对位置和主要的子宫动脉(红色)。指示是子宫角(箭头)和结扎点(虚线箭头)的长轴线。用于免疫组织化学的部分被沿着视平面切割。

图2

图2:动脉重塑在妊娠中期的体视学评估(A)为例ASSE鲁米和从野生雌性H&E染色切片总血管领域的底蜕膜的中央2/4 ssment(由垂直黑划定虚线)在gd9.5。在船只在更高的放大倍率,红色虚线划定总血管区,黄色虚线划定管腔面积。栏= 500微米(左),50微米(右)。子宫的长轴是水平行中该取向。 (B)来自WT(C57BL / 6)和量化的Rag2管腔区域(左面板)和管腔面积的比率,以总血管面积(右图) - / - IL2RG - / - 小鼠(在C57BL / 6背景)。每个数据点代表的15个测量(每部5测量,每植入部位3部分)的平均值。棒表示平均N =从每组4怀孕11-13植入部位; p值从双尾,非配对曼 - 惠特尼检验。 WT:野生型。

“图3”SRC 图3:在蜕膜免疫组化检测的平滑肌肌动蛋白上的WT(上)和代表性的Rag2 SMA染色- / - IL2RG - / -小鼠 (在C57BL / 6背景下,底部)在gd9.5。栏= 100微米。 WT:野生型。

Discussion

这里介绍的协议的目的是提供以用来评估所必需的成功怀孕的血管变化可再现方法。临界本评估的成功是组织切片的质量。这两个精确确定的植入部位的孕周,以及可靠的结扎子宫动脉是关键步骤。变化的参数,如时间固定的,组织处理协议等等也可能影响结果。对于无偏体视学评估,以测量在每个植入部位血管的数目相同是很重要的。它建议以测量每植入部位并且每个植入位点以一式三份5船只。这15个测量值的平均值代表着5大血管平均尺寸。

另外,从alymphoid 的Rag2数据- / - IL2RG - / -这里显示的小鼠,我们发现这PROTocol为一些的母体免疫功能不足的模型,其中包括抑制NK细胞14的一个很有用的。在动脉重塑缺陷也被证明在受损滋养细胞侵袭18的模型和此处所描述的技术可能会有所帮助,以评估在这些情况下,脉管。我们优化和验证此协议为蜕膜血管重塑在妊娠中期在小鼠调查,但还可以想到,以适应这个协议在其他模型系统 (例如大鼠)或甚至在其他器官中工作。而我们发现,对NK依赖性重塑可以鲁棒地评估在gd9.5,它可修正为其它时间点,如gd12.5,当产妇脉管被完全改造。在这个时间点,血管内滋养细胞浸润是更深16和这个时间点可以是更适合于滋养层的血管变化的作用的调查。如果额外的量化读数的需要,研究者还可以增加染色的SMA部的数量和每个植入位点内的评估部分改造血管的百分比。

该协议的限制是组织学检查的描述性。功能测定,然而,仅慢慢变得可用(例如多普勒超声19)。这些技术需要专业技术知识和用于获取和维护设备更高的费用,但是具有提供在体内的读出纵向为,可以在组织学可观察到的变化的影响的优点。所有的体视学考试的一个可能的缺点是研究者的主观性。为此,使用分析所有样品独立两个独立的考官可以帮助避免这个问题。而这里所概述的协议提供了洞察多少血如何到达胎母接口,它可能是有利的,可以与并发症结合通过塑料评估血液的总量在任何给定时间在脉管的ementary方法蒙上16。

该协议的优点是,它结合了两个独立的方法。血管变化是首次定量体视学评估,然后将结果进行验证定性采用免疫组化。结果的可靠性可以通过随机样品得到进一步加强。此协议中制备的样品可以容易地用于还研究怀孕的其他参数,如decidualisation,妊娠(MLAP)或感兴趣的细胞的免疫检测的mesometrial淋巴聚集体的发展,在妊娠中期到严格评估怀孕的表型。

动脉重构是妇女和这些变化的失败简单怀孕的关键一步巩固了很大的产科综合征(GOS),即先兆子痫,胎儿生长受限死胎。我们在座的技术来仔细评估,模仿GOS的病理生理的一些特点小鼠模型中怀孕的表型。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice (8-12 weeks old) Charles River
Dental floss
Polystyrene Used for holding tissue in place
Straight dissection scissors EMS 72940
25 G needles BD  300600 Used for holding tissue in place
50 ml conical tubes Falcon 352070
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Phosphate buffered saline Sigma P3813-10PAK
Ethanol Sigma 32221-2.5L
Paraffin Sigma 327204-1KG
Xylene Fisher Scientific X/0250/17
Automated tissue processor Sakura 6032
Microtome Leica RM2245
Slide rack Sigma Z710989
Coplin jar Sigma S5891
Purified water
Hematoxylin solution, Gill No. 3 Sigma GHS332-1L
Eosin Y solution Sigma HT110116-500ML
Fume hood
Xylene-based mounting media VWR 361254D
Slide scanner Hamamatsu NanoZoomer
Slide scanner software Hamamatsu NDP viewer
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma 32320 Make 10 mM solution and adjust pH to 6
Pressure cooker Used for antigen retrieval
Heating plate Used for antigen retrieval
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H/1800/15
Tris buffered saline Sigma T6664-10PAK
Mouse on mouse kit Vector BMK-2202 Significantly reduces background
Mouse anti-human smooth muscle actin DAKO M0851 Cross-reacts with mouse
IgG2a isotype control DAKO X0943
Humidified chamber Sigma H6644
3,3’-Diaminobenzidine solution Sigma D4293-5SET
Hydrochloric acid Fisher Scientific H/1050/PB17

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References

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