DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Biology

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Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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Abstract

Introduction

각각의 근섬유가 큰, 매우 조직 세포 융합 세포이다. 근육에 대한 몇 가지 세포 배양 모델이 있습니다; 그러나,이 모델은 완전히 성숙한 근섬유로 분화하지 않는 전공 제한으로있다. 예를 들어, L6 및 C2C12 세포주는 마우스 및 래트 각각 1-4로부터 유도된다. 혈청 기아 조건 하에서, 단핵 "근육 모세포 같은"세포 증식을 중단 세포주기 회수를 받아야하고 sarcomeres과 다핵 세포를 형성하는 근육 조직 프로그램에 입력 myotubes라고 함. 장기간 배양 조건으로, myotubes는 수축 특성을 나타낼 수 있으며, 문화의 "트". 인간 세포주는 이제 5 확립되었다. 이들 불멸화 세포주 이외에, 단핵구는 근육 아세포로부터 myotubes을 형성 할 것이다 혈청 기아 유사한 조건 하에서 분리 될 수있다. 이들 세포주 및 일차 근원 세포 배양 물은 높은 사용 아르FUL들은 플라스미드로 형질 감염 또는 바이러스 형질 도입 및 염기성 세포 생물학적 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있기 때문이다. myotubes를 형성하도록 유도 된 경우에는, 이들 세포는 심지어, 성숙한 근육 조직의 많은 두드러진 특징이 부족하다. 구체적 myotubes 개별 성숙한 근섬유보다 훨씬 작고 근섬유의 정상적인 형상이 부족하다. 비판적으로, myotubes는 가로 (T-) 세관 부족, myoplasm에 걸쳐 효율적으로 칼슘 2 + 릴리스에 필요한 멤브레인 네트워크.

차 근원 세포 또는 근육 조직 세포 라인에 다른 방법은 성숙한 근섬유를 사용하여 수반한다. 형질 전환은 태그 된 단백질의 발현을 확립하기 위해 사용될 수 있지만,이 방법은 비용과 시간이 소요된다. 마우스 근육의 생체 전기는 속도 및 신뢰성 6-10위한 바람직한 방법으로서 떠오르고있다.

생체 전기와 근섬유 하를 효율적으로 분리하는 방법마우스 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 (6)에 최적화되어했습니다. 방법은 쉽게 완료 플라스미드에서 생체 내 발현 유도하는 최소 침습 있습니다 할 수 있습니다. 이 방법은 현재의 sarcolemma -6,7- 레이저 파쇄 촬상 비롯한 고해상도 영상화 방법과 결합된다. 형광 염료 및 형광 표지 된 단백질의 발현이 결합 성숙한 근섬유 세포에서 생물학적 과정을 모니터링하는데 사용될 수있다.

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Protocol

본 연구의 방법은 가이드 라인을 승인 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 노스 웨스턴 대학 파인 버그 학교 (IACUC)와 윤리에 따라 수행되었다. 모든 노력이 고통을 최소화 하였다.

마우스의 굴근 심지 브레비스의 생체 내의 Electroporation (FDB) 근육 번들 1. 실험 절차

  1. 포유 동물 세포에서 발현하는 것으로 알려져 프로모터를 사용하여 생체 내 발현을위한 디자인 플라스미드 (예를 들어, 거대 세포 바이러스, CMV) 또는 근육 (예를 들어, 근육 크레아틴 키나제, MCK) 6,7. 큰 플라스미드는 낮은 수준에서 표현 할 수 있습니다. CMV 프로모터 광범위 6,7 사용되어왔다.
  2. E.로부터 플라스미드를 정화 대장균은 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 조건을 사용하여. 5 μg의 플라스미드 / μL - 2에서 무균, 내 독소 무료 TE 버퍼에 플라스미드를 녹인다.
  3. 희석 및 concentratio에 플라스미드 나누어지는멸균 독소 무료 TE (2 μg의 / μL) 10 μL에서 DNA의 20 μg의의 n은 멸균 microcentrifuge 관에 주입 당 버퍼. 주입 당 하나의 나누어지는을 준비합니다.
  4. 8 단위의 최종 농도를 제공하는 칼슘 및 마그네슘없이 멸균 인산 완충 식염수에 1 배인 히알루로의 콘텐츠 - (- / PBS)에 희석한다. 나누어지는 멸균 microcentrifuge 관에 주입 당 희석 히알루 10 μL.
  5. 진정 및 꼬리 또는 발가락 핀치에 응답 할 때까지 2.5 % 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취. 정상 체온을 유지하기 위해 가열 패드 또는 가열 테이블에 앙와위에 동물을 놓는다.
  6. 사전 기술 바늘 사이트 유래 바깥쪽으로 방사를 사용 포비돈 요오드 스크럽 알코올 교류 응용 3 회 마우스 발바닥을 청소한다. 이 기술은 병원균 도입을 최소화 무균 상태에서 바늘 위치를 유지한다.
  7. 번째의 발바닥 주사피부와 멸균 1 ML의 주사기를 사용하여 근육 사이의 1 배의 히알루 용액 (2 ㎎ / ㎖ = 8 대)의 10 μL와 전자 마우스. 히알루는 근섬유로 플라스미드를보다 효율적으로 진입을 허용하는 세포 외 기질 성분의 소화. 발 뒤꿈치의 바닥에 입력하고 발가락쪽으로 바늘을 진행합니다. 바늘이 후진으로 천천히 액체를 놓습니다. 피부 아래에 주사 부위의 확장과 분홍색을 설정하기 시작합니다.
  8. 반복 1.6 반대쪽 발에 1.7 단계를 반복합니다.
  9. 마취를 분리하고 다시 새장에 마우스를 놓습니다. 마우스가 완전히 마취에서 복구 할 수 있습니다.
  10. 2 시간을 기다립니다.
  11. , 마취 및 발 소독 절차를 반복 1.5 및 1.6 단계를 반복합니다.
  12. 히알루로니다 제와 같은 방식으로 발바닥 내로 희석 플라스미드 DNA를 주입. 최대 볼륨 20 μL 이하인지 확인합니다. 이중 발현 플라스미드 20의 최대 음량 각 플라스미드 20 μg의 주입# 181; L 이하이다.
  13. 반대쪽 발바닥에 플라스미드 주입을 반복하거나 제어 주사에 대한 반대측 발을 사용합니다.
  14. 처음에 주입 한 발에서 떨어져 미세 집게로 밑줄 근육으로부터 피부를 들어 올려 다리의 치유 발가락 라인에 수직 위치에 발가락 근처 피부의 공을 통해 하나 27 G 바늘을 놓습니다. 두 번째 멸균 27 G 바늘을 가지고 발 뒤꿈치에서 피부를 통해 수평으로 배치합니다. 장소 바늘 떨어져 각 ~ 다른 1cm 평행.
  15. 바늘이 서로 접촉하지 않도록하고 병렬 바늘에 악어 클램프, 클램프 전극을 사용. 점토의 사용 장소에 클램프를 확보 할 수있다.
  16. 전기 자극기에 전극을 연결합니다.
  17. 100 V / cm에서, 1 Hz에서 20 펄스 지속 시간이 20 밀리 초 / 각을인가함으로써 근육 Electroporate. 발가락 자극하여 경련 수 있습니다.
  18. 필요한 경우 반대쪽 발에 자극 절차를 반복합니다.
  19. 바늘을 제거합니다. 포비돈 요오드 스크럽과 발바닥을 닦습니다.
  20. 마취를 끕니다. 복구 케이지와 모니터 활동에 마우스를 돌려줍니다. 예상대로 절차가 수행 된 경우, 동물을 30 분 내에 정상 보행을 회복 및 사전 주입 동작과 보행 또는 활성 수준에 차이를 나타내지 않는다한다. 따라서, 시술 후 진통제는 필요하지 않습니다. 복구시, 동식물 사육장에 동물을 반환합니다.
    참고 : 단백질 발현은 전기 후 빠르면 48 시간을 분석 할 수 있습니다. 14 일 전기 (10) 후 - 그러나, 전기 후 더 완벽한 복구를 할 수 있도록, 우리는 7 고립과 근섬유의 연구를 선호한다. 식 4 주 후 일렉트로만큼 분석 될 수있다.

굴근 심지 브레비스 (FDB) 섬유의 분리 2. 실험 절차

  1. 해동 콜라게나. 각 FDB 번들 12 웰 조직 배양 플레이트에 웰 두 준비. 하나에서 잘 1m를 추가미리 예열 둘 베코의 수정 이글스 미디어 플러스 소 혈청 알부민 (DMEM + BSA)의와 다른 난 잘 미리 예열 링거 액 1ml를 추가합니다. 또한, 요리를 실 가드 35mm에 1 배 링거 용액의 신선한 10ml를 추가합니다.
  2. 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 또는 다른 방법으로 다음, CO 2 마취 가스의 흡입을 통해 동물을 희생.
  3. 깨끗한 면도날을 사용하여 발목 관절 위의 뒷다리를 제거하고 접시를 실 가드 35mm의 1 배 링거 용액에 잠수함.
  4. 한 발 꽉 핀, 5 발가락 끝의 각 통해 발목에서 30 G 바늘과 실 가드 접시에, 발바닥이 위로 향하게.
  5. 발목에서 시작, 조심하지 닉, 바로 발가락쪽으로 헤어 라인을 따라 피트의 측면을 피부 아래의 근육을 피부를 싹둑. 다리의 반대편에 반복합니다.
  6. 미세 집게로 발목의 기지에서 피부를 잡고 발 뒤꿈치에서 피부를 잘라.
  7. 피부를 리프팅피부로하지 닉 근육으로 가위를 가리, 집게와 플랩. 효과적으로 피부를 제거한 하부의 결합 조직이 잘린.
  8. FDB 근육 다발이 뼈의 힘줄을 확보하기 위해 발 뒤꿈치에있는 큰 힘줄을 잘라 제거하십시오. 집게와 힘줄을 잡고 조심스럽게 가위로 FDB에 연결된 모든 결합 조직을 제거하는 큰 흰색 건에서 FDB 번들을 해부하다. 제대로하면 번들은 쉽게 개인의 자리로 이어지는 밝은 흰색 힘줄을 드러내는 기본 힘줄의 들어 올려됩니다. 발에서 번들을 확보 발가락 근처의 힘줄에서 FDB를 잘라.
  9. 잘 포함하는 DMEM + BSA의 전체 근육 번들을 놓습니다.
  10. 반대쪽 발에 반복합니다.
  11. 일단 모든 FDB 근육은 각 웰에 포함 된 DMEM + BSA와 근육에 콜라겐의 100 μl를 추가, 격리됩니다.
  12. 소화 이전에 거꾸로 형광 현미경에 전기의 성공을 확인합니다. 수행 properl 경우Y, 90 %의 형질 전환 효율은 위쪽으로 달성 될 수있다.
  13. 약 1 시간 동안 10 %의 CO 2에 가습, 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 시간은 질병 모델과 배경과 콜라겐의 많은에 따라 달라질 수 있습니다.
  14. 1 시간 후, 조심스럽게 잘 포함 만 링거 용액에 FDB 번들을 전송합니다.
  15. 1 ml의 피펫을 사용하여 링거 용액 웰 FDB 번들 씹다. 번들 쉽게 피펫 팁을 통과 할 수 있도록 깨끗한​​ 면도날 피펫 팁의 끝을 잘라. 조심스럽게 번들가 통과 팁과 평행 다운 할 수 있도록 근육 (~ 15 배)를 씹다. 본래 섬유는 링거 용액에 떨어질 것입니다. 섬유가 쉽게 번들을 떨어지지 않는 경우, 콜라겐 용액에 다시 근육을 놓습니다.
  16. 판 당 접시 ~ 500 μL에 고립 된 섬유 플레이트.
  17. 근육은 15 분 동안 잘에서 소화 할 수 있습니다.
  18. 반복 2.15 단계2.17로 다발의 크기가 감소 될 때까지 섬유의 대부분은 번들 (통상 2-3 회 전체)로부터 해리된다. 일단 근육 용이 1 ml의 피펫 팁을 통과 해리.
  19. 섬유가 15 분 이상 동안 접시에 부착하자. 신선한 링거 용액 시간 제약에 따라 잔여게나 희석 플레이트에 추가되거나 변경 될 수있다.
    참고 : 섬유 이제 이미징을위한 준비가되어 있습니다.

공 초점 현미경을 사용하여 레이저 유도 멤브레인 손상의 시각화 3. 실험 절차

  1. 로드 섬유 2.5 μm의 300 μL 링거 용액 FM 4-64 염료 FM 1-43으로 이미징 직전. 일반적으로, 분리 후 이미지 섬유 15 분까지 2 시간. 그러나, 섬유는 24 시간 후 분리까지 영상화 할 수있다.
  2. UV 레이저 및 60X / 63X 대물 렌즈가 장착 된 공 초점 현미경에 유리 바닥 접시를 놓습니다.
  3. 섬유를 찾습니다. 섬유가 단단히 연결되어 있는지 확인합니다현미경 기반을 눌러 접시에. 해리 과정에서 손상되었다 섬유를 제외합니다. 손상된 섬유 컬 막 소포, FM 염료의 흡수 높은 수준을 포함​​하거나 강렬하게 구부리 수 있습니다.
  4. 섬유 막에 손상을 유도하는, 핵의 클리어 필드 촬상 창의 중심에 위치 sarcolemma. sarcolemma 매우 날카로운되도록 FM 염료 채널을 사용 sarcolemma에 초점을 맞 춥니 다.
  5. FM 4-64 채널을 활용 sarcolemma에 투자 수익 (ROI) 크로스 헤어를 놓습니다.
  6. 3 초 (~ X 350 nm의 영역 350 ㎚) 80 %의 전력에서 1 픽셀 지점을 조사. FM 염료는 부상의 사이트에서 셀을 입력합니다. 전력 및 시간을 증가 시키거나 모독의 영역을 감소하도록 조정될 수있다.
  7. 손상시 손상하기 전에 매 2 초 후 손상, 최대 5 분 후 매 10 초 섬유의 이미지를 캡처합니다. 타이밍은 필요에 따라 조정될 수있다. 개별 이미지는 이미지 J.에서 시간 경과 영화로 변환 할 수 있습니다
  8. 단계를 반복합니다접시 당 최대 3 섬유에 3.7을 통해 3.3.

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Representative Results

전기 효율적으로 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 번들 (그림 1A)로 정제 된 플라스미드 DNA를 소개하는 최소 침습 기술이다. 이레는 형질 전환 형광 태그 단백질은 고립 된 근섬유 (그림 1B)에 가시화 게시 할 수 있습니다. 고립 된 섬유는 도금 공 초점 현미경 이미징에 대 한 준비가되어 있습니다. 섬유 레이저 유도 부상으로 실시 할 수있다. FM 염료 막 손상의 위치를 식별하는 데 사용될 수있다 (도 1C)

소화 과정 중에, 근섬유의 소수 (흰색 화살표) (도 2A)를 손상 될 수있다. 손상된 근섬유는 sarcolemma (검은 색 화살표)에서 막에 blebbing 존재로 식별 할 수 있습니다. 섬유 손상은 또한 실험에 적합하지 않고 사용되어서는 안된다. 식 O를 보여주는 대표 공 촛점 이미지절연 근섬유도 2b 내의 FA 형광 융합 단백질. CMV 프로모터의 활용은 근섬유에 최적의 단백질 발현을 구동한다. DIC 영상은 최적의 섬유를 보여줍니다. FM 4-64은 낮은 수준 이전에 손상 (그림 2C)에서 막에 존재한다.

라이카 SP 5 공 초점 현미경에 몇 군데 FM 4-64로드 근섬유의 대표 이미지입니다. sarcolemma가보기 (흰색 상자) 및 투자 수익 (ROI) 십자선 (흰색 X)의 분야에서 중심이 myonuclei없는 영역 (그림 3, 중간)에 sarcolemma의 선명한 형광 가장자리에 정렬됩니다. 핵은 FM 염료 분석 후 이미지에 영향을 미칠 수있는 피할 수있다. 막 손상시, FM 염료는 최소 (오른쪽 그림 3) 정상 근섬유를 입력합니다. 막 수리 결함이 근육 섬유는 레이저에 의한 손상에 FM 염료 흡수의 수준을 증가 표시됩니다.

-together.within 페이지 = "1"> 그림 1
생체 일렉트로 레이저 손상 프로토콜도 1 개략도. (A)는 히알루로 마취 된 마우스 발바닥에 주입된다. 플라스미드 DNA는 주입되는 전압이인가된다. (B) 세븐 일 후 주입, 굴곡 심지 브레비스 (FDB) 번들 (흰색 화살표 중간 패널) 뒤에 노출 힘줄 (검은 색 화살표)를 떠나 노상에서 격리됩니다. (C) 섬유 도금과 레이저 유발 라이브 근섬유 손상에 대해 수행된다. 왼쪽 패널, 규모 50 μm의. 오른쪽 패널, 규모 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3551fig2.jpg "/>
찬란 태그 단백질을 표현 그림 2. 고립 된 근섬유. 세븐 일 포스트 전기는, 단백질 발현은 근섬유를 통해 감지된다. (A) 막에 blebbing 구별 (흑색 화살표) 및 멤브레인 중단 (흰색 화살표)가 불가능 근섬유의 소수의 분리 절차 결과. 규모 5 μm의. (B) 건강한 근섬유의 대표 이미지입니다. 균등 sarcomeres는 DIC 영상 (왼쪽)으로 시각화된다. 근섬유 표현 넥신 A6는 GFP (중앙 패널) 태그. 종래 손상 (우측 패널)로 염색 최소 FM 신호가있다. 규모 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
레이저의 그림 3. 정렬FM 양성 Sarcolemma에 십자선은. sarcolemma에 관심 영역은 시야 내에서 중심에있다. sarcolemma이 확대된다 (흰색 점선 상자) 및 투자 수익 (ROI) 십자선은 핵 (중앙 패널)없는 영역에서 sarcolemma의 날카로운 FM 양성 가장자리에 정렬됩니다. 손상시, FM 염료 부상 부위 (오른쪽 패널, 흰색 화살표)에 들어갑니다. 규모 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

생체 내 형광 태그로 단백질을 연구하는 전기의 사용은 이상적으로 충실히 근육 전체 셀 구조를 복제 적합한 세포주 모델의 부재 주어진 근육의 연구를 위해 적합하다. 이 프로토콜은 레이저 상처 후 단백질 지역화 및 전좌의 상세한 화상을 제공하는 일렉트로 고해상도 공 초점 현미경의 사용률을 설명한다. 이 방법은 세포 골격 재구성, 인신 매매 및 융합을 포함한 다른 세포 과정을 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.

FDB 근육 다발 익스프레스 플라스미드 내의 근섬유의 90 %까지,이​​ 프로토콜을 사용하고, 이것은 이전과 이후 모두 분해 근섬유 형광 현미경에 의해 용이하게 알 수있다. 주사 부위에 가깝게 관찰 높은 식 표현의 경사는 일반적으로 존재한다. 때문에 발현 그라디언트, 다양한 단백질 발현의 효과를 모니터링 할 수 아프로엄마 하나의 실험. 모든 형질 전환 방법과 마찬가지로이 방법은 과잉 발현과 관련된 문제에 의해 제한된다. 특히, 높은 수준의 표현으로, 단백질 응집가 발생할 수 있습니다. 우리의 경험에서 mCherry 형광 태그 (예를 들어 7도 4 참조)의 해상도 및 단백질 도메인의 선명도를 감소 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 태그보다 더 응집을 보여준다. 또한, mTurquise2과 금성 형광 태그 모두 충분한 형광 발현을 보여줍니다. 그러나 두 단백질은 eGFP는보다 밝은 있습니다.

이 방법은 테스트 약학 제제 및 세포 상처 포함한 다양한 조건 하에서 화상 거실 근섬유하는데 사용될 수있다. 우리는 sarcolemma을 방해하는 레이저 부상을 사용하지만, 다른 프로세스는 부상이 방법에 적용 할 수있다. 이를 위해 막 형성 될 수도 유리 비드를 압연에 의해 유도 삼투압 충격뿐만 아니라 세포막 손상에 의해 생성 소포평가 일렉트로 근섬유 11,12을 이용. 레이저 상처를 들어, 유형 및 레이저의 전력뿐만 아니라 목적은 막 (13, 14)의 병변을 만드는 데 필요한 시간의 길이에 영향을 미칠 것이다. 또한, 외부 버퍼 내의 버퍼들, 즉 칼슘의 농도 및 FM 염료는 복구 프로세스 (13, 15)에 영향을 미칠 것이다. 이 방법론은 모두 니콘 라이카 공 초점 영상 시스템에서 테스트되었으며, 양쪽 기술을 수행 할 수있다. FM 4-64 녹색 형광 단백질 (7)와 실험에 적합하다. 기타 FM 1-43, 부정적이 염료 13,15,16의 적용을 제한 610 나노 미터에서 470 나노 미터 및 배출 절정에 여기 피크로 인지질을 충전 바인드 다른 친 유성 염료를 사용하고 있습니다. 광표백과 광독성 인해 이상 이미징에게 모두 가능한 결과입니다. 묘화 노광 시간, 이미지 주파수와 채널 수 사이의 적절한 균형을 결정쉽게 이러한 효과를 감소시키기 위해 조작 된 변수들이다.

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Disclosures

관심의 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

이 작품은 NS047726, NS072027 및 AR052646은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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