DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

myofibers בודדת תאים גדולים, מאורגנים מאוד syncytial. ישנם כמה מודלים תא-תרבות לשריר; עם זאת, יש לי דגמים אלה כמגבלה העיקרית שלהם שהם אינם מבחינים באופן מלא בmyofibers הבוגר. לדוגמא, שורות תאי C2C12 וL6 נגזרות מעכברים וחולדות, בהתאמה 1-4. בתנאים של רעב סרום, התאים "כמו היצמדות למנגנון-" מונונוקלארים להפסיק הפצה, לעבור נסיגת מחזור תא, ולהיכנס לתכנית myogenic להרכיב תאי multinucleated עם sarcomeres, מכונה myotubes. עם תנאי תרבות ממושכים, myotubes עשוי להפגין תכונות התכווצות ו" פרפור "בתרבות. גם עכשיו הוקמו שורות תאים אנושיות 5. בנוסף לשורות תאים הונצחו אלה, יכול להיות מבודד myoblasts mononuclear משרירים ובתנאים דומים של רעב הסרום יהווה myotubes. שורות תאים אלה ותרבויות והיצמדות למנגנון עיקריות הן מאוד להשתמשפול כי הם יכולים להיות transfected עם פלסמידים או transduced עם וירוסים ומשמשים ללמוד תהליכים ביולוגיים של תא בסיסי. עם זאת, תאים אלה, גם כאשר נגרמו ליצירת myotubes, חסרים רבים מהמאפיינים הבולטים של ארגון שריר בוגר. באופן ספציפי, myotubes הם הרבה יותר קטן מאשר myofibers הבוגר הבודד וחסר צורה הנורמלית של myofibers. ביקורתי, myotubes חסר הרוחבי tubules (טי), הרשת הקרומית הנדרשת לשחרור Ca 2 + יעיל לאורך myoplasm.

שיטה חלופית ולהיצמדות למנגנון ראשונית או שורות תאי myogenic כרוכה באמצעות myofibers הבוגר. Transgenesis יכול להיות מועסק על מנת להקים ביטוי של חלבונים מתויגים, אך שיטה זו היא זמן רב ויקרה. Electroporation vivo של שריר עכבר התפתחה שיטה מועדפת למהירות ואמינות 6-10.

שיטות לelectroporation in vivo והבידוד יעיל של חה myofibersיש כבר מותאם לשריר brevis digitorum המכופף עכבר (FDB) 6. ניתן להשלים בקלות השיטות והם פולשנית לגרום בביטוי vivo מפלסמידים. גישה זו בשילוב עם שיטות עכשיו הדמיה ברזולוציה גבוהה הכוללים הדמיה לאחר שיבוש לייזר של 6,7 sarcolemma. השילוב של צבעים וביטוי של חלבונים שכותרתו fluorescently ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים תא בmyofibers הבוגר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השיטות במחקר זה בוצעו בהתאם אתי עם בית הספר לאוניברסיטת נורת'ווסטרן פיינברג לרפואה מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) אישרו הנחיות. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל.

1. נוהל ניסיון בElectroporation vivo של מכופף digitorum רוויס (FDB) השריר Bundle בעכבר

  1. פלסמידים עיצוב לביטוי בvivo באמצעות אמרגן הידוע להביע בתאי יונקים (למשל, ציטומגלווירוס, CMV) או בשרירים (לדוגמא, שריר קריאטין קינאז, MCK) 6,7. פלסמידים גדולים יותר עשויים לבטא ברמות נמוכות יותר. אמרגן CMV כבר נעשה שימוש נרחב 6,7.
  2. לטהר פלסמידים מא coli באמצעות תנאי תשלום רעלן פנימי לפי הוראות יצרן. ממיסים את פלסמיד במאגר סטרילי, רעלן פנימי חינם TE ב2-5 פלסמיד / μl מיקרוגרם.
  3. לדלל וaliquot פלסמיד לconcentration של 20 מיקרוגרם של ה- DNA בμl 10 של רעלן פנימי סטרילי (מיקרוגרם / μl 2) TE החופשי חיץ להזרקה לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. הכן aliquot אחד לכל זריקה.
  4. לדלל את המניות של hyaluronidase ל1X עם פוספט סטרילי שנאגרו מלוח ללא סידן ומגנזיום (PBS - / -) נותן ריכוז סופי של 8 יחידות. Aliquot 10 μl של hyaluronidase המדולל להזרקה לתוך צינור microcentrifuge סטרילי.
  5. להרדים את העכבר באמצעות isoflurane 2.5% עד מסומם ואינו מגיב לזנב או צביטת הבוהן. מניחים את החיה במצב שכיבה על כרית חימום או שולחן חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית.
  6. נקה את שודד של העכבר עם יישום לסירוגין של לשפשף יוד povidone ואלכוהול שלוש פעמים תוך שימוש בטכניקת הכנה שמקורם מאתר המחט ומקרינה כלפי חוץ. טכניקה זו שומרת על אתר המחט במצב ספטית, מזעור מבוא הפתוגן.
  7. הזרק שודד הדרכים של העכבר דואר עם 10 μl של פתרון hyaluronidase 1x (2 מ"ג / מיליליטר = 8 יחידות) בין העור והשרירים באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי. Hyaluronidase מעכל רכיבים של מטריקס להתיר כניסה יעילה יותר של פלסמיד לmyofibers. הזן בבסיס העקב ולקדם את המחט לכיוון הבהונות. לאט לאט לשחרר את הנוזל כמחט חזר בו. אתר ההזרקה מתחת לעור ירחיב ולהתחיל להפוך ורוד.
  8. חזור על שלבים 1.6 ו -1.7 ברגל הנגדית.
  9. נתק את ההרדמה ומניח את העכבר בחזרה בכלוב. אפשר העכבר כדי להתאושש באופן מלא מהרדמה.
  10. חכה שעה 2.
  11. חזור על נהלי עיקור הרדמה ורגל, צעדים 1.5 ו -1.6.
  12. הזרק את ה- DNA פלסמיד המדולל לשודד הדרכים באותו אופן כפי שhyaluronidase. ודא שעוצמת הקול המרבית היא 20 μl או פחות. לביטוי פלסמיד הכפול להזריק 20 מיקרוגרם של כל פלסמיד עם נפח מרבי של 20 &# 181; L או פחות.
  13. חזור על הזרקת פלסמיד על שודד הנגדי או להשתמש ברגל הנגדית לזריקות שליטה.
  14. על הרגל שהייתה בתחילה מוזרקת, להרים את העור מהשרירים והדגישו עם מלקחיים עדינים ומניח את מחט G אחד 27 דרך הכדורים של עור ליד הבהונות בעמדת בניצב לקו לרפא הבוהן של כף הרגל. קח מחט G 27 סטרילי שני ולמקם אותו בצורה אופקית דרך העור בעקב. מחטי מקום במקביל לכל פרט 1 סנטימטר אחר ~.
  15. שימוש במהדק תנין, אלקטרודות מהדק למחטים המקבילות לוודא המחטים לא ליצור קשר עם אחד אחרת. השימוש בפלסטלינה יכולה להבטיח את מהדק במקום.
  16. חבר אלקטרודות לממריץ חשמלי.
  17. Electroporate השרירים על ידי הפעלת 20 פעימות, 20 אלפית שניים בזמן / כל אחד, ברץ 1, ב 100 V / סנטימטר. הבהונות עשויות עווית עם גירוי.
  18. חזור על תהליך הגירוי ברגל הנגדית במידת צורך.
  19. הסר מחטים. נגב את השודד עם לשפשף יוד povidone.
  20. כבה את ההרדמה. החזר את העכבר לכלוב ההתאוששות ופעילות צג. אם ההליך בוצע כצפוי, את החיה צריכה להחזיר ניידות נורמלית בתוך 30 דקות ולהפגין אין הבדל ברמת ניידות או פעילות ממראש הזרקת התנהגות. לפיכך, לא משככי כאבים לאחר הליך נדרשים. על ההתאוששות, להחזיר את בעלי החיים לביבר.
    הערה: ביטוי חלבון יכול להיות assayed מוקדם ככל 48 שעות לאחר electroporation. עם זאת, על מנת לאפשר התאוששות מלאה יותר לאחר electroporation, אנחנו מעדיפים בידוד ומחקר של myofibers 7-14 ימים לאחר electroporation 10. ביטוי יכול להיות assayed כל עוד 4 שבועות לאחר electroporation.

2. נוהל ניסיון לבידוד של מכופף digitorum רוויס הסיבים (FDB)

  1. collagenase הפשרה. לכל חבילה FDB להכין שתי בארות בצלחת תרבית רקמת 12 גם. באחד גם להוסיף 1 מ 'l הנשרים מדיה מחומם מראש השתנה Dulbecco בתוספת סרום שור אלבומין (DMEM + BSA) ובשני טוב להוסיף 1 מיליליטר של טרום חמם Ringers פתרון. בנוסף, להוסיף טרי 10 מיליליטר של תמיסת Ringers 1x למ"מ 35 Sylgard צלחת.
  2. להקריב בעלי החיים באמצעות CO 2 או משאיפת גז הרדמה, ואחריו נקע בצוואר הרחם או בשיטה אחרת, כדי להבטיח את המוות.
  3. הסר את הרגליים האחוריות מעל מפרק הקרסול באמצעות סכין גילוח נקי ולצלול בפתרון Ringers 1x במ"מ 35 Sylgard צלחת.
  4. פין רגל אחת הדוק, בלעדי פונה כלפי מעלה, על צלחת Sylgard עם 30 מחטי G דרך כל 5 הטיפים בוהן ובקרסול.
  5. החל בקרסול, לגזור את העור כלפי מעלה בצד של כף הרגל לאורך קו השיער לכיוון הבהונות, נזהר שלא ניק השרירים מתחת לעור. חזור על פעולה בצד השני של רגל השני.
  6. מחזיק את העור בבסיס הקרסול עם מלקחיים עדינים, לחתוך את העור פני העקב.
  7. מתיחת העורדש עם מלקחיים, המספריים מצביעים לכיוון העור כדי לא ניק השריר. לגזור רקמת חיבור הבסיסית, ביעילות הסרת העור.
  8. כדי להסיר את חבילת שריר FDB לחתוך את הגיד הגדול בעקב לשחרר את הגיד מהעצם. מחזיק גיד עם מלקחיים, לנתח את צרור FDB מהגיד הלבן הגדול הסרת כל רקמת חיבור שצורפה לFDB עם מספריים בזהירות. אם נעשה כראוי החבילה תהיה בקלות להרים את של גידי הבסיס חושפים גידים לבנים בוהקים מובילים לספרות בודדת. חותך את FDB בגידים ליד הבהונות לשחרר את החבילה מהרגל.
  9. מניחים את כל חבילת השרירים בDMEM + BSA המכיל גם.
  10. חזור על פעולה ברגל הנגדית.
  11. ברגע שכל שרירי FDB מבודדים, להוסיף של collagenase 100 μl לכל DMEM + BSA ושרירים המכיל גם.
  12. בדוק את ההצלחה של electroporation במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לפני העיכול. אם properl עשהy, כלפי מעלה של 90% יעילות transfection יכול להיות מושגת.
  13. דגירה את הצלחת בC חממת humidified, 37 מעלות ב -10% CO 2 לכ 1 שעה. זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לדגם מחלה ורקע והרבה collagenase.
  14. אחרי שעה 1, בזהירות להעביר את צרור FDB לפתרון Ringers רק המכיל גם.
  15. Triturate צרור FDB בהיטב עם פתרון Ringers בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. חותך את הקצה של קצה פיפטה בסכין גילוח נקי כך שהחבילה יכולה בקלות לעבור את קצה פיפטה. בעדינות triturate השריר (~ 15 פעמים) מאפשר החבילה לעבור למעלה ולמטה במקביל לקצה. סיבים שלמים ייפלו לתוך צלצולי הפתרון. כאשר סיבים לא בקלות ליפול החבילה, למקם את השרירים גב לפתרון collagenase.
  16. פלייט הסיבים המבודדים על הצלחת ~ 500 μl לכל צלחת.
  17. לאפשר לשריר כדי לעכל בבאר במשך 15 דקות.
  18. חזור על שלבים 2.15ל2.17 עד החבילה יורדת בגודל וברוב הסיבים הם ניתקו מהחבילה (בדרך כלל בסך הכל 2-3 פעמים). ברגע שניתק את השריר עובר בקלות דרך קצה פיפטה 1 מיליליטר.
  19. בואו סיבים לצרף הצלחת למינימום של 15 דקות. פתרון Ringers טרי ניתן להוסיף לצלחת לדלל collagenase שייר או השתנה בהתאם לאילוצי זמן.
    הערה: סיבים מוכנים כעת להדמיה.

3. נוהל ניסיון להדמיה של נזק ממברנה מושרה לייזר באמצעות מיקרוסקופיה confocal

  1. סיבים טען מייד לפני הדמיה עם 300 μl של 2.5 מיקרומטר FM 1-43 של צבע 4-64 FM בפתרון אצבעות. בדרך כלל, סיבי תמונה 15 דקות לשעה 2 לאחר בידוד. עם זאת, ניתן הדמיה עד להודעה סיבי בידוד 24 שעות.
  2. מניחים את צלחת זכוכית התחתונה במיקרוסקופ confocal מצויד בליזר UV ואובייקטיבי 60X / 63X.
  3. אתר סיבים. ודא הסיבים מחובר היטבלמנה על ידי הקשה על בסיס מיקרוסקופ. תכלול סיבים שניזוקו בתהליך הניתוק. סיבים פגומים עשויים להכיל שלפוחיות קרום, רמות גבוהות של ספיגת צבע FM, סלסול או לכופף בעוצמה.
  4. כדי לגרום לניזק קרום בסיבים, מקם את sarcolemma במרכז חלון ההדמיה עם שדה ברור של גרעינים. להתמקד בsarcolemma באמצעות ערוץ הצבע FM כך שsarcolemma הוא חד ביותר.
  5. מניחים את שיער צלב ROI על sarcolemma ניצול ערוץ FM 4-64.
  6. מכשיר את נקודת פיקסל 1 בעצמה של 80% במשך 3 שניות (~ 350 x 350 ננומטר אזור ננומטר). צבע FM ייכנס לתא באתר של פציעה. כוח והזמן יכולים להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את האזור של עלבון.
  7. צלם תמונות של הסיבים לפני הנזק, בעת הפגיעה, כל הודעה נזק-2 שניות, ולאחר מכן כל 10 שניות עד 5 דקות. תזמון יכול להיות מותאם בהתאם לצורך. ניתן להמיר תמונות בודדות לסרטי זמן לשגות בתמונת ג '
  8. חזרו על שלבים3.3 דרך 3.7 על עד 3 סיבים לכל צלחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Electroporation הוא טכניקה פולשנית שיעילות מציגה פלסמיד דנ"א המטוהר לחבילת שריר (איור 1 א) brevis digitorum המכופף (FDB). שבעה ימים לאחר transfection fluorescently חלבון מתויג היא דמיין בmyofibers המבודד (איור 1). אז סיבים מבודדים הם מצופים ומוכנים להדמיה על מיקרוסקופ confocal. יכולים להיות נתונה לפגיעת סיבי לייזר מושרה. צבע FM יכול לשמש כדי לזהות את האתר של נזק קרום (איור 1 ג)

במהלך תהליך העיכול, מספר קטן של myofibers עלול להיפצע (איור 2 א) (חץ לבן). ניתן לזהות myofibers נפגע נוכחי blebbing הקרום בsarcolemma (החץ שחור). הסיבים פגומים אינם מתאימים לניסויים נוספים ולא אמור לשמש. תמונות confocal נציג מראים o הביטוי חלבון היתוך ניאון fa בתוך myofibers המבודד איור 2. ניצול של אמרגן CMV כונני ביטוי חלבון אופטימלי בmyofibers. ההדמיה דסק"ש תערוכות סיבים אופטימליים. FM 4-64 הוא כיום בקרום ברמות נמוכות לפני הנזק (איור 2 ג).

תמונה מייצגת של myofiber עמוס FM 4-64 צילם על Leica SP 5 מיקרוסקופ confocal. Sarcolemma מרוכז בשדה הראייה (קופסות הלבנות) וכוונת החזר על השקעה (x הלבן) מיושר בקצה הפריך, הניאון של sarcolemma באזור נטול myonuclei (איור 3, באמצע). גרעינים נמנעים כפי שהם יכולים להשפיע על פוסט ניתוח הדמיה צבע FM. על נזק קרום, צבע FM מינימאלי נכנס myofibers נורמלי (איור 3, מימין). סיבי שריר פגומים בתיקון הממברנה יהיה להציג רמות גבוהות של ספיגת צבע FM על נזק הנגרם לייזר.

-together.within עמודים = "1"> איור 1
איור 1. סכמטי של in vivo פרוטוקול נזק Electroporation והליזר. () Hyaluronidase מוזרק לתוך שודד של עכבר הרדים. פלסמיד דנ"א לאחר מכן הזריק והמתח חשמלי. לאחר הזרקה (ב) שבעה ימים, brevis digitorum המכופף (FDB) חבילה (פנל באמצע חץ לבן) מבודד משודד עוזבים גידים חשופים מאחור (חץ שחור). סיבים (C) הם מצופים ונזק הנגרם על-לייזר מבוצע על myofibers החי. לוח שמאלי, בקנה מידה 50 מיקרומטר. פנל ימני, בקנה מידה 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3551fig2.jpg "/>
2. Myofibers הדמות מבודד הבעת חלבונים מתויגים fluorescently. לאחר electroporation שבעה ימים, ביטוי חלבון מזוהה לאורך myofiber. (א) תוצאות הליך הבידוד במספר קטן של myofibers שמיש עם blebbing הברור קרום (חץ שחור) ושיבושי קרום (חץ לבן). היקף 5 מיקרומטר. תמונת נציג myofiber בריא (B). sarcomeres מחולק באופן שווה הם דמיינו בהדמיה דסק"ש (משמאל). Annexin myofiber להביע A6 מתויג עם GFP (פנל במרכז). יש אות מינימאלית FM צבע לפני נזק (פנל מימין). היקף 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
יישור איור 3. בליזרכוונת על sarcolemma FM-חיובי. האזור של עניין על sarcolemma מרוכז בתוך שדה הראייה. Sarcolemma מוגדל (תיבה מקווקוות לבנה) וכוונת ROI מיושרת על קצה FM החיובי החד של sarcolemma באזור נטול גרעינים (פנל במרכז). על הנזק, צבע FM נכנס באתר של פציעה (פנל מימין, חץ לבן). היקף 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש בelectroporation ללמוד חלבונים מתויגים fluorescently in vivo הוא אידיאלי לחקר שרירים בהיעדר המודלים שורת התאים המתאימים שנאמנות לשכפל את כל מבנה התא של שריר. פרוטוקול זה מתאר את הניצול של electroporation ומיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה כדי לספק הדמיה מפורטת של לוקליזציה החלבון וטרנסלוקציה לאחר פציעת לייזר. שיטה זו ניתן להתאים ללמוד תהליכים תאיים אחרים, כוללים ארגון מחדש שלד תא, סחר, והיתוך.

השימוש בפרוטוקול זה, עד 90% מmyofibers בתוך פלסמיד המפורש צרור שריר FDB, ואת זה ניתן לראות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ואחרי ניתוק myofiber. יש בדרך כלל שיפוע של ביטוי עם ביטוי גבוה יותר נצפה קרוב יותר לזריקה. בגלל השיפוע של ביטוי, את ההשפעה של ביטוי חלבון שונה יכולה להיות במעקב הלוך ושובניסוי יחיד ma. כמו בכל שיטות transfection, גישה זו היא מוגבלת על ידי נושאים הקשורים לביטוי יתר. יש לציין, עם ביטוי ברמה גבוהה, צבירת חלבון יכולה להתרחש. מניסיוננו, תג ניאון mCherry מדגים יותר מאשר צבירת תג חלבון פלואורסצנטי ירוק המשופר (eGFP) הפחתת רזולוציה וחדות של תחומים חלבון (לדוגמא ראה איור 4 ב -7). בנוסף, תגי ניאון mTurquise2 וונוס הן להפגין ביטוי הקרינה מספק. עם זאת, שני החלבונים הם פחות בהירים מeGFP.

שיטה זו יכולה לשמש כדי myofibers חיים תמונה תחת מגוון רחב של תנאים, כולל סוכני תרופות בדיקות ופציעתם של תאים. השתמשנו פציעת לייזר לשבש את sarcolemma, אבל תהליכים פצעו אחרים יכולים להיות מותאמים לשיטה זו. לשם כך, היווצרות קרום שלפוחיות שנוצרה על ידי הלם אוסמוטי, כמו גם פגיעת קרום המושרה על ידי גלגול חרוזי זכוכית יכול גם להיותהעריך ניצול myofibers electroporated 11,12. לפציעת לייזר, הסוג והעצמה של הלייזר, כמו גם המטרה ישפיעו על משך הזמן הדרוש ליצירת נגע קרום 13,14. יתר על כן, מאגרים חיצוניים, במיוחד הריכוז של סידן וצבען FM בתוך החיץ ישפיעו על תהליך התיקון 13,15. מתודולוגיה זו נבדקה בשתי מערכות ההדמיה confocal ניקון והיקה ושניהם מסוגלים לבצע את הטכניקה. FM 4-64 הוא גם מתאים לניסויים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק 7. אחרים השתמשו 1-43 FM, צבע lipophilic אחר שנקשר טעון שליליות פוספוליפידים עם שיא עירור ב 470 ננומטר שיא והפליטה ב610 ננומטר, אשר מגביל את היישום של צבע זה 13,15,16. Photobleaching וphototoxicity שניהם תוצאות אפשריות בשל הדמיה מעל. קביעת האיזון הראוי בין זמן החשיפה, תדירות תמונה ומספר ערוצי הדמיהפרמטרים מניפולציות בקלות להפחית את ההשפעות הללו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מעניקה NS047726, NS072027, וAR052646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
  2. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  3. Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
  5. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
  6. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. (2009).
  7. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
  8. Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
  9. Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
  10. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
  11. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
  12. Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
  13. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  14. Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
  15. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
  16. Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics