DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bireysel myofibers büyük, çok organize sinsityal hücrelerdir. Kas birkaç hücre kültürü modeli vardır; Ancak, bu modeller tam olgun myofibers içine ayırt yok onların ana sınırlama olarak var. Örneğin, C2C12 ve L6 hücre çizgileri farelerde ve sıçanlarda, sırası ile 1-4 elde edilir. Serum açlık koşullarında, tek çekirdekli "miyoblast gibi" hücreler çoğalması ateşkes hücre döngüsü çekilmesi geçmesi ve sarkomer ile çok çekirdekli hücreler oluşturan Miyojenik programa girmek, miyotüplerinin olarak anılacaktır. Uzun süreli kültür koşulları ile miyotüpleri kasılma özellikler gösterebilir ve kültürde "seğirme". İnsan hücre hatları da hemen 5 tespit edilmiştir. Bu ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına ek olarak, tek çekirdekli miyoblastlar kas ve miyotüpler oluşturacak serum açlık benzer koşullar altında izole edilebilir. Bu hücre hatları ve birincil miyoblast kültürleri çok kullanımı vardırful bu plasmidler ile transfekte ya da virüs ile transduse ve temel hücre biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir, çünkü. Miyotüpler oluşturmak için uyarılan Ancak, bu hücreler, hatta, olgun kas örgütün belirgin özelliklerinden birçoğu yoksundur. Özellikle, miyotüpleri bireysel olgun myofibers çok daha küçüktür ve myofibers normal şeklini yoksundur. Kritik, miyotüpleri enine (T) tübüller eksikliği, myoplasm boyunca verimli Ca 2+ serbest bırakılması için gerekli membranöz ağ.

Birincil miyoblast veya myojenik hücre hatlarına alternatif bir yöntem olgun myofibers kullanarak gerektirir. Transgenesis etiketli proteinlerin ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir, ancak bu yöntem pahalı ve zaman alıcı bir iştir. Fare kas in vivo elektroporasyon hızı ve güvenilirliği 6-10 için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır.

In vivo elektroporasyon ve myofibers ha etkin izolasyon yöntemleriFare fleksör digitorum brevis (FDB) kas 6 için optimize oldum. Yöntemler hali hazırda tamamlanmış ve plazmidlerden in vivo ifadenin uyarılması için minimal invaziv girmektedir. Bu yaklaşım artık sarcolemma 6,7 lazer bozulması sonrasında görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri ile kombine edilir. Floresan boyalar ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu kombinasyonu, olgun myofibers hücre, biyolojik işlemleri izlemek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada yöntemleri kuralları onayladı Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Northwestern Üniversitesi Feinberg School (IACUC) etik uygun olarak yapıldı. Tüm çabalar acıyı en aza indirmek için yapılmıştır.

Fare Flexor Digitorum Brevis in vivo Elektroporasyon (FDB) kas Bundle 1. Deney Prosedürü

  1. Memeli hücrelerinde eksprese ettiği bilinen bir promoteri kullanılarak in vivo ifadesi için plazmidler tasarım (örneğin, sitomegalovirüs, CMV) ya da kas (örneğin, kas kreatin kinaz, MCK) 6,7. Büyük plazmidler daha düşük seviyelerde ifade edebilir. CMV promoteri yoğun 6,7 kullanılmıştır.
  2. E. plazmidleri arıtın E. coli, üretici talimatlarına göre endotoksin serbest koşulları kullanılarak hazırlanabilir. 5 ug plazmid / ul - 2 steril, endotoksin serbest TE tamponu içinde plazmid çözülür.
  3. Seyreltik bir concentratio plasmiti bölmeyinSteril endotoksin serbest TE (2 ug / ml) 10 ul DNA 20 ug n steril mikrosantrifüj tüpü içine enjeksiyon başına tampon. Enjeksiyon başına bir kısım hazırlayın.
  4. 8 adet nihai yoğunluk, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın, steril fosfat tamponlu salin ile 1x hyaluronidaz stok - (- / PBS) ile seyreltilir. Kısım steril bir mikrosantrifüj tüpe enjeksiyon başına seyreltilmiş hiyalüronidaz 10 ul.
  5. Sedasyon ve kuyruk veya ayak sıkışmasını yanıt vermeyen kadar% 2.5 izofluran kullanarak fare anestezisi. Normal vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısıtma yastığı veya ısıtma masasına sırt üstü yatırıldı pozisyonda hayvan yerleştirin.
  6. Bir hazırlık teknik, iğne buradan kaynaklanan ve dışarı doğru yayılan kullanarak bir povidon iyodin fırçalama ve alkol bir alternatif uygulaması ile üç kez fare ayak desteği temizleyin. Bu teknik, patojen giriş en aza indirerek, bir aseptik durumda iğne sitesine sahiptir.
  7. Th Kapkaççı enjektederi ve steril bir 1 ml şırınga ile kas arasındaki 1x hiyaluronidaz çözeltisi (2 mg / ml = 8 birim) 10 ul e fare. Hyaluronidaz myofibers içine plasmidin daha verimli bir giriş izin vermek için hücre dışı matris bileşenleri sindirir. Topuk üssünde girin ve ayak parmakları doğru iğne ilerlemek. Iğne çekilir yavaş yavaş sıvı bırakın. Deri altına enjeksiyon sitesi genişletmek ve pembe açmak başlayacaktır.
  8. Tekrarlayın 1.6 ve kontralateral ayak üzerinde 1.7 adımları yineleyin.
  9. Anestezi ayırın ve tekrar kafese fareyi koyun. Fare tam anestezi kurtarmak için izin verin.
  10. 2 saat bekleyin.
  11. , Anestezi ve ayak sterilizasyon prosedürleri tekrarlayın 1.5 ve 1.6 adımları tekrarlayın.
  12. Hyaluronidase ile aynı şekilde ayak tabanı içine seyreltildi plazmid DNA enjekte edilir. Maksimum hacmi 20 ul veya daha az olduğundan emin olun. Çift plazmid ekspresyon için 20 ve en fazla hacimde her plazmid 20 ug enjekte# 181; l veya daha az.
  13. Kontralateral ayak tabanı üzerinde plazmid enjeksiyonu tekrarlayın veya kontrol enjeksiyonlar için kontralateral ayak kullanın.
  14. Başlangıçta enjekte edildi yürüyerek uzak ince forseps ile altını kas cildi kaldırın ve ayak iyileşmek-ayak hattına dik bir pozisyonda ayak yakınında cilt topları ile biri 27 G iğne yerleştirin. İkinci steril 27 G iğne alın ve topuk deri yoluyla yatay olarak yerleştirin. Yer iğneler dışında her ~ diğer 1 cm paralel.
  15. Iğneler birbirine temas etmeyecek emin paralel iğnelere timsah kelepçeleri, kelepçe elektrotlar kullanarak. Kil modelleme kullanımı yerine kelepçeler güvence altına alabilirsiniz.
  16. Bir elektrik stimülatörü elektrotları bağlayın.
  17. 100 V / cm, 1 Hz, 20 baklagiller, süresi 20 milisaniye / her uygulayarak kas Electroporate. Ayak stimülasyonu ile seğirme olabilir.
  18. Gerekirse kontralateral ayak stimülasyon işlemi tekrarlayın.
  19. Iğneler çıkarın. Povidon iyot ile ovulur Kapkaççı silin.
  20. Anestezi kapatın. Kurtarma kafes ve monitör aktivite fare dönün. Beklendiği gibi işlem yapılmıştır ise, hayvan 30 dakika içinde normal ambulasyon kazanması ve enjeksiyon öncesi davranışından ambulasyon veya aktivite düzeyi arasında fark göstermelidir. Bu nedenle, hiçbir işlem sonrası analjezikler ihtiyaç vardır. Kurtarma üzerine, vivaryum hayvan dönün.
    Not: Protein ifadesi, elektroporasyon sonra kadar erken olarak 48 saat analiz edilebilir. 14 gün elektroporasyon 10 sonra - Bununla birlikte, elektroporasyon sonra daha tam iyileşme sağlamak için, biz 7 tecrit ve myofibers çalışma tercih ederim. İfade 4 hafta sonra, elektroporasyon sürece analiz edilebilir.

Fleksör Digitorum Brevis (FDB) Elyaf İzolasyonu 2. Deney Prosedürü

  1. Çözülme kollajenaz. Her bir paket için FDB 12 oyuklu doku kültürü plakası, iki kuyu hazırlar. Birinde de 1 m eklemekÖnceden ısıtılmış Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı artı sığır serum albümini (DMEM + BSA) ve l de önceden ısıtılmış Ringers Çözeltisinin 1 ml. Ayrıca, çanak Sylgard 35 mm 1x Ringer solüsyonu taze 10 ml ekleyin.
  2. Ölümü sağlamak için servikal dislokasyon veya başka bir yöntemle takip CO 2 veya anestezik gaz soluma yoluyla hayvan kurban.
  3. Temiz bir jilet kullanarak ayak bileği eklemi üzerinde arka ayakları çıkarın ve çanak Sylgard 35 mm 1x Zil çözeltide daldırın.
  4. Tek ayak sıkı Pin, 5 parmak uçları her yoluyla ve ayak bileğinde 30 G iğne ile Sylgard çanak üzerine, tek yukarı bakacak.
  5. Ayak bileğinde başlayan, dikkatli nick, düz ayak doğru saç çizgisi boyunca ayak tarafı yukarı derinin altında kas cilt snip. Ayağın diğer tarafta tekrarlayın.
  6. Ince forseps ile ayak bileği üssünde cilt tutan, topuk boyunca cildi kesti.
  7. Cildi KaldırmaCilde olarak değil nick kas doğru makas gelin forseps ile flep. Cildi etkili kaldırarak, altta yatan bağ dokusu snip.
  8. FDB kas demeti kemikten tendon ücretsiz topuk büyük tendonu kesilmiş kaldırın. Forseps ile tendonu tutarak dikkatle makasla FDB bağlı herhangi bir bağ dokusu kaldırarak büyük beyaz tendon gelen FDB paket teşrih. Düzgün yapılırsa paket kolayca bireysel basamak önde gelen parlak beyaz tendonları ortaya yatan tendonların kapalı kaldıracak. Ayak paket kurtararak ayak yakınında tendon FDB kesin.
  9. Iyi içeren DMEM + BSA bütün kas demeti koyun.
  10. Kontralateral ayak üzerinde tekrarlayın.
  11. Bir kez tüm FDB kasları her kuyuya içeren DMEM + BSA ve kas kollajenaz 100 ul ekleyin izole edilmiştir.
  12. Sindirim öncesinde bir ters flüoresan mikroskop elektroporasyon başarısını kontrol edin. Yapılan properl Eğery,% 90 transfeksiyon randımanının yukarı doğru elde edilebilir.
  13. Yaklaşık olarak 1 saat süre ile,% 10 CO2 nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. Kuluçka süresi hastalık modeli ve arka plan ve kolajenaz partisine bağlı olarak değişebilir.
  14. 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde de ihtiva eden tek Ringers çözeltisi FDB paket aktarın.
  15. 1 ml pipet kullanarak Ringer çözeltisi ile iyi FDB paket Karışım. Paket kolaylıkla pipet geçebilir şekilde temiz bir jilet ile pipet ucu kesilir. Yavaşça paket kaçırmak ve bahşiş paralel aşağı izin kas (~ 15 kez) çiğnemek. Bozulmamış lifler Ringer Çözüm içine kapalı düşecek. Lifler kolayca paket dökmez zaman kollajenaz çözüm geri kas yerleştirin.
  16. Plaka başına çanak ~ 500 ul izole lifleri Plate.
  17. Kas 15 dakika boyunca oyuk sindirimi izin verin.
  18. Yineleyin 2.15 adımları2.17 kadar paket boyutu düşene kadar ve liflerin çoğunluğu demetinin (2-3 kat genellikle toplam) ayrışmış edilir. Bir kez kas kolayca 1 ml pipet ucu geçer ayrışmış.
  19. Lifler 15 dakika en az çanak eklemek olsun. Taze Ringers çözüm zaman kısıtlamaları bağlı kalan kollajenaz sulandırmak için plakaya eklenebilir veya değiştirilebilir.
    Not: fiberler şimdi görüntüleme için hazırız.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak lazer kaynaklı Membran Hasar Görselleştirme 3. Deneysel Prosedürü

  1. Yük lifler 2,5 uM, 300 ul Ringer çözeltisi içinde FM 4-64 boya FM 1-43 ile görüntüleme hemen önce. Genellikle, izolasyondan sonra görüntü lifleri 15 dakika 2 saat. Ancak, lifler 24 saat sonrası izolasyon kadar görüntülü olabilir.
  2. UV lazer ve 60X / 63X objektif ile donatılmış bir konfokal mikroskop cam alt çanak yerleştirin.
  3. Bir fiber bulun. Lif sıkıca tutturulmuş olduğundan emin olunmikroskop tabanını dokunarak çanak. Ayrışma sürecinde zarar görmüş lifler hariç. Hasarlı lifler kıvırmak zar kabarcıklar, FM boya alımı yüksek düzeyde içeren veya yoğun bükülebilir.
  4. Fiber membran hasarına neden için, çekirdeklerin net bir alana sahip görüntüleme penceresinin ortasında sarcolemma yerleştirin. Sarcolemma son derece keskin şekilde FM boya kanalını kullanarak sarcolemma odaklanın.
  5. FM 4-64 kanalı kullanan sarcolemma ROI çapraz saç yerleştirin.
  6. 3 sn (~ 350 nm alanı x 350 nm) için% 80 güçte bir 1 piksel noktası ışın tedavisi. FM boya yaralanma yerinde hücreye girer. Güç ve zaman artırmak veya hakaret alanını azaltmak için ayarlanabilir.
  7. , Hasar anındaki hasar öncesi her 2 sn sonrası hasar, en fazla 5 dakika süreyle daha sonra her 10 saniyede bir lif görüntüler yakalayın. Zamanlama ihtiyaca göre ayarlanabilir. Bireysel görüntüleri Görüntü J. zaman atlamalı filmleri dönüştürülebilir
  8. Adımları tekrarlayınTabak başına en fazla 3 lifleri üzerinde 3.7 ile 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporasyon verimli fleksör digitorum brevis (FDB) kas demeti (Şekil 1A) içine saflaştırılmış plazmid DNA tanıtır minimal invaziv bir tekniktir. Yedi gün transfeksiyon floresan etiketli protein izole myofibers (Şekil 1B) görüntülenmiştir yazı. İzole edilmiş lifler, daha sonra kaplama ve konfokal mikroskop görüntüleme için hazırlanır. Fiberler, lazer kaynaklı yaralanmalara maruz bırakılabilir. FM boya membran zararının alan tespit etmek için kullanılabilir (Şekil 1C)

Sindirim sürecinde myofibers az sayıda (beyaz ok) (Şekil 2A) yaralandı olabilir. Hasarlı myofibers sarcolemma (siyah ok) membran blebbing mevcut tarafından tespit edilebilir. Hasar görmüş lifli fazla deney için uygun değildir ve kullanılmamalıdır. Ifadesi o gösteren Temsilcisi konfokal görüntülerİzole myofibers Şekil 2B içinde fa floresan füzyon proteini. CMV promoterinin kullanılması myofibers optimal protein ifadesini yönlendirir. DIC görüntüleme optimal elyaf gösterir. FM 4-64 düşük seviyelerde önce hasara (Şekil 2C) zar bir miktarda mevcuttur.

Leica SP 5 konfokal mikroskop görüntülü FM 4-64 yüklü bir myofiber Temsilcisi görüntü. Sarcolemma görüntüsü (beyaz kutu) ve YG crosshair (beyaz x) alanında merkezli myonuclei yoksun bir alanda (Şekil 3, orta) içinde sarcolemma gevrek, floresan kenarında hizalanır. Çekirdekler onlar FM boya analizi sonrası görüntüleme etkileyebilir olarak kaçınılır. Membran hasarı üzerine, FM boya minimal (sağ Şekil 3) Normal myofibers girer. Membran tamir kusurlu kas lifleri, lazer kaynaklı hasar üzerine FM boya alımı düzeylerinde artış gösterecektir.

-together.within-page = "1"> figür 1
In vivo elektroporasyon ve Lazer hasar Protokol Şekil 1 şematik (A). Hyaluronidaz anestezi altında farenin ayak tabanı içine enjekte edilmektedir. Plazmid DNA, daha sonra enjekte edilir ve gerilim uygulanır. (B) Yedi gün sonrası enjeksiyon, fleksör digitorum brevis (FDB) bundle (beyaz ok orta panel) arkasında maruz kalan tendonları (siyah ok) bırakarak footpad izole edilir. (C) Fiberler plakalanır ve lazer kaynaklı hasarın canlı myofibers üzerinde gerçekleştirilir. Sol Panel, ölçek 50 mikron. Sağ paneli, ölçek 5 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3551fig2.jpg "/>
Floresan Tagged Proteinler ifade Şekil 2. İzole Myofibers. Yedi gün sonra elektroporasyon, protein ifadesi myofiber boyunca tespit edilir. (A) farklı zar kabanr (siyah ok) ve membran aksamalar (beyaz ok) ile kullanılamaz myofibers az sayıda izolasyon prosedürü sonuçları. Ölçek 5 um. (B) sağlıklı myofiber temsili görüntüsü. Eşit aralıklı sarkomer DIC görüntüleme (solda) görselleştirilmektedir. Bir myofiber ifade anneksin A6 GFP (merkez panel) ile etiketlenmiş. Önce hasar (sağ panel) minimal FM boya sinyali vardır. Ölçek 5 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Lazer Şekil 3. hizalanmasıFM-pozitif sarcolemma üzerinde crosshairs. Sarcolemma ilgi bölge görüş alanı içinde ortalanır. Sarcolemma büyütülür (beyaz noktalı kutu) ve YG crosshairs çekirdekleri (orta panel) yoksun bir alanda sarcolemma keskin FM-pozitif kenarında hizalanır. Hasar üzerine, FM boya yaralanma yerinde (sağ panel, beyaz ok) girer. Ölçek 5 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo olarak, floresan etiketli proteinler çalışma elektroporasyon kullanımı ideal sadakatle kas tüm hücre yapısını taklit Uygun bir hüre hattı modellerinin olmaması ile kas çalışma için uygundur. Bu protokol lazer yaralama sonra protein lokalizasyonu ve translokasyon ayrıntılı görüntüleme sağlamak için elektroporasyon ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanımını açıklar. Bu yöntem hücre iskeleti yeniden, insan ticareti ve füzyon gibi diğer hücresel süreçleri incelemek için adapte edilebilir.

FDB kas demeti ifade plazmid olan myofibers% 90 kadar, bu protokolü kullanılarak, bu önce ve myofiber ayrışma sonrasında floresans mikroskobu ile kolaylıkla görülebilir. Enjeksiyon yerinde yakın gözlenen yüksek ifadesi ile ifade gradyan genellikle vardır. Çünkü ifade gradyanı değişen protein ekspresyonunun etkisi fro izlenebilirma tek deney. Tüm transfeksiyon yöntemleri ile de, bu yaklaşım aşırı ekspresyonu ile ilgili konularda ile sınırlıdır. Özellikle, yüksek seviyede ifade ile, protein topaklanma meydana gelebilir. Bizim tecrübelerimize göre, MCherry floresan etiket (örneğin 7'de Şekil 4) çözünürlük ve protein alanlarının keskinliğini azaltarak gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) etiketi daha toplanmayı göstermektedir. Ayrıca, mTurquise2 ve Venüs floresan etiketleri hem yeterli floresan ifadesini göstermektedir. Ancak, her iki protein eGFP daha az parlak.

Bu yöntem, test farmasötik maddeler ve hücre yaralanması da dahil olmak üzere, çeşitli koşullar altında görüntü oturma myofibers için kullanılabilir. Biz sarkolemma bozacak lazer yaralanması kullanılır, ancak diğer yaralı işlemleri, bu yöntem için adapte edilebilir. Bu amaçla membranın oluşumu da olabilir cam boncuklar haddeleme ile oluşturulan ozmotik şok gibi membran hasar tarafından oluşturulan kabarcıklarındeğerlendirilmiştir elektropore myofibers 11,12 kullanılması. Lazer yaralama, yazın ve lazerin güç yanı sıra objektif bir membran lezyonu 13,14 oluşturmak için gerekli süreyi etkiler. Ayrıca, tampon içinde dış tamponlar, özellikle kalsiyum konsantrasyonu ve FM boya onarım işlemini 13,15 etkileyecektir. Bu metodoloji, hem Nikon ve Leica konfokal görüntüleme sistemleri üzerinde test edilmiştir ve her iki teknik gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. FM 4-64 yeşil floresan protein 7 deney için uygundur. Diğerleri FM 1-43 olumsuz bu boya 13,15,16 uygulanmasını sınırlamaktadır 610 nm, 470 nm ve az emisyon zirvesinde bir uyarım zirve ile fosfolipid tahsil bağlayan bir başka lipofilik boya kullandık. Photobleaching ve fototoksisite nedeniyle aşırı görüntüleme olası sonuçlarıdır. Görüntülü maruz kalma süresi, görüntü frekans ve kanal sayısına arasındaki uygun dengeyi Belirlenmesikolayca bu etkilerini azaltmak için manipüle parametrelerdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Herhangi bir çıkar çatışması vardır.

Acknowledgements

Bu çalışma NS047726, NS072027 ve AR052646 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
  2. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  3. Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
  5. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
  6. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. (2009).
  7. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
  8. Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
  9. Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
  10. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
  11. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
  12. Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
  13. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  14. Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
  15. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
  16. Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics