DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Individuele myovezels zijn groot, zeer georganiseerde syncytieel cellen. Er zijn enkele celkweek modellen voor spier; echter, deze modellen hebben als belangrijkste beperking dat ze niet volledig differentiëren tot rijpe myovezels. Zo worden de C2C12 en L6 cellijnen afgeleid van respectievelijk 1-4 muizen en ratten. Onder omstandigheden van serum honger, de mononucleaire "myoblast-achtige" cellen ophouden proliferatie ondergaan celcyclus terugtrekking, en treedt in de myogene programma vormen meerkernige cellen met sarcomeren, aangeduid als myotubes. Bij langdurige kweekomstandigheden, kan myotubes contractiele eigenschappen vertonen en "twitch" in de cultuur. Humane cellijnen zijn nu ook vastgesteld 5. Naast deze geïmmortaliseerde cellijnen, mononucleaire myoblasten kan worden geïsoleerd uit spieren en onder vergelijkbare omstandigheden serumuithongering zal myotuben vormen. Deze cellijnen en primaire myoblasten culturen zeer gebruikenful omdat ze kunnen worden getransfecteerd met plasmiden of getransduceerd met virussen en gebruikt fundamentele celbiologische processen te bestuderen. Echter, deze cellen, zelfs wanneer aangezet tot myotubes vormen missen veel van de opvallende kenmerken van volwassen spieren organisatie. Specifiek myotubes veel kleiner dan individuele spiervezels volwassen en niet de normale vorm van myovezels. Kritisch, myotubes missen dwarsrichting (T) buisjes, de vliezig netwerk vereist voor efficiënte Ca2 + afgifte gehele myoplasm.

Een alternatieve methode om de primaire myoblast of myogenic cellijnen met zich meebrengt met volwassen myovezels. Transgenese kunnen worden toegepast om expressie van gemerkte eiwitten vast te stellen, maar deze methode is kostbaar en tijdrovend. In vivo elektroporatie van muizenspier ontstaan ​​als voorkeursmethode voor de snelheid en betrouwbaarheid 6-10.

Werkwijzen voor in vivo elektroporatie en efficiënte isolatie van myofibers have is geoptimaliseerd voor de muis flexor digitorum brevis (FDB) spier 6. De werkwijzen kunnen gemakkelijk worden voltooid en minimaal invasieve induceren in vivo expressie vanaf plasmiden. Deze aanpak wordt nu gecombineerd met beeldvormende methoden hoge resolutie inclusief beeldvorming na laser verstoring van de sarcolemma 6,7. De combinatie van fluorescente kleurstoffen en expressie van fluorescent gelabelde eiwitten kunnen worden gebruikt om celbiologische processen volwassen spiervezels volgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De methoden die in dit onderzoek werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurde richtlijnen. Alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren.

1. Experimentele Procedure voor in vivo Elektroporatie van de Flexor digitorum Brevis (FDB) Muscle Bundle in Mouse

  1. Ontwerp plasmiden voor in vivo expressie met behulp van een promotor waarvan bekend expressie in zoogdiercellen (bijvoorbeeld, cytomegalovirus, CMV) of spier (bijvoorbeeld spier creatine kinase, MCK) 6,7. Grotere plasmiden kan uitdrukken op lagere niveaus. De CMV promoter is uitgebreid 6,7 toegepast.
  2. Zuiver plasmiden uit E. coli gebruiken endotoxine-vrije omstandigheden volgens de instructies van de fabrikant. Los het plasmide in steriele, endotoxine-vrij TE-buffer bij 2 - 5 ug plasmide / ul.
  3. Verdun en aliquot het plasmide een concentration van 20 ug DNA in 10 ui steriel endotoxine vrije TE (2 ug / ul) buffer per injectie in een steriele microcentrifugebuis. Bereid één portie per injectie.
  4. Verdun de voorraad van hyaluronidase tot 1x met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS - / -) wat een eindconcentratie van 8 eenheden. Aliquot 10 pi verdund hyaluronidase per injectie in een steriele microcentrifugebuis.
  5. Verdoven van de muis met behulp van 2,5% isofluraan totdat verdoofd en niet reageert op de staart of teen knijpen. Plaats het dier in liggende positie op een verwarmingselement of verwarmen tabel normale lichaamstemperatuur.
  6. Reinig de voetzool van de muis met een afwisselende toepassing van een povidonjood scrub en alcohol driemaal met een prep techniek afkomstig van de naald zelf en straalt naar buiten. Deze techniek houdt de naald site in een aseptische toestand, het minimaliseren van pathogeen introductie.
  7. Injecteer de voetzool van the muis met 10 gl van de 1 x hyaluronidase-oplossing (2 mg / ml = 8 eenheden) tussen de huid en de spier met een steriele 1 ml spuit. Hyaluronidase verteert componenten van de extracellulaire matrix efficiëntere intrede van plasmide in myovezels mogelijk. Voer bij de basis van de hiel en vooraf de naald naar de tenen. Langzaam de vloeistof los als de naald wordt teruggetrokken. De injectie onder de huid zal uitbreiden en beginnen om roze te zetten.
  8. Herhaal de stappen 1,6 en 1,7 op de contralaterale voet.
  9. Koppel de anesthesie en plaats de muis terug in de kooi. Laat de muis om volledig te herstellen van anesthesie.
  10. Wacht 2 uur.
  11. Herhaal de verlamming en de voet sterilisatie procedures, stappen 1.5 en 1.6.
  12. Injecteer de verdunde plasmide DNA in de voetzool op dezelfde manier als de hyaluronidase. Zorg ervoor dat het maximale volume is 20 ul of minder. Voor dubbele plasmide expressie injecteer 20 pg van elk plasmide met een maximaal volume van 20 &# 181; l of minder.
  13. Herhaal het plasmide injectie in de contralaterale voetzolen of gebruik de contralaterale voet control injecties.
  14. Op de voet de aanvankelijk geïnjecteerd, til de huid van het onderstrepen spier fijne pincet en plaats een 27 G naald door de bal van de huid bij de tenen in een positie loodrecht op het genezen teen lijn van de voet. Neem een ​​tweede steriele 27 G naald en plaats het horizontaal door de huid op de hiel. Plaats naalden evenwijdig aan elkaar ~ 1 cm.
  15. Met behulp van alligator klemmen, klem elektroden op de parallelle naalden zorg ervoor dat de naalden niet met elkaar in contact. Het gebruik van boetseerklei kan de klemmen vast te zetten.
  16. Sluit elektroden een elektrische stimulator.
  17. Electroporate de spier door toepassing van 20 pulsen, 20 msec duur / elke op 1 Hz bij 100 V / cm. De tenen kan trillen met stimulatie.
  18. Herhaal de stimulatieprocedure aan de contralaterale voet indien nodig.
  19. Naalden te verwijderen. Veeg de voetzool met povidonjood scrub.
  20. Schakel de anesthesie. Zet de muis om het herstel kooi en controleren activiteit. Als de procedure werd uitgevoerd zoals verwacht, dient het dier normaal ambulant weer binnen 30 min en vertonen geen verschil in ambulation of activiteitsniveau van pre-injectie gedrag. Daarom zijn geen post-procedure analgetica nodig. Na herstel, de terugkeer van de dieren aan het terrarium.
    Opmerking: Eiwit expressie kan worden geanalyseerd al 48 uur na elektroporatie. Echter, om meer volledig herstel na elektroporatie toestaan, geven we de voorkeur isolatie en studie van myovezels 7-14 dagen na elektroporatie 10. Expressie kan zolang 4 weken na elektroporatie worden getest.

2. Experimentele procedure voor isolatie van de Flexor digitorum Brevis (FDB) Vezels

  1. Dooi collagenase. Voor elke FDB bundel bereiden twee putten in een 12-well weefselkweek plaat. In een goed voeg 1 ml voorverwarmde Dulbecco's gemodificeerd Eagles Media plus runderserumalbumine (DMEM + BSA) en in de andere goed voeg 1 ml voorverwarmde Ringers oplossing. Bovendien, voeg verse 10 ml 1x Ringers oplossing om de 35 mm Sylgard schaal.
  2. Offer het dier door middel van CO 2 of verdovend gas inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie of een andere methode om de dood te verzekeren.
  3. Verwijder de achterste voet boven het enkelgewricht met een schone scheermesje en dompel in 1x Ringers oplossing in de 35 mm Sylgard schotel.
  4. Pins een voet strak, tong naar boven, op de Sylgard schotel met 30 G naalden door elk van de 5 tenen tips en bij de enkel.
  5. Te beginnen bij de enkel, knip de huid recht omhoog de zijkant van de voet langs de haarlijn in de richting van de tenen, voorzichtig niet te nick de spier onder de huid. Herhaal aan de andere kant van de voet.
  6. Houd de huid aan de basis van de enkel met een fijne tang, snijd de huid over de hiel.
  7. Het opheffen van de huidflap met een pincet, richt je schaar in de richting van de huid om niet nick de spier. Knip het onderliggende bindweefsel, effectief verwijderen van de huid.
  8. Voor het verwijderen van de FDB spier bundel snijd de grote pees aan de hiel om de pees van het bot te bevrijden. Houdt de pees met een tang, ontleden de FDB bundel van de grote witte pees zorgvuldig verwijderen van bindweefsel bevestigd aan de FDB met een schaar. Indien goed uitgevoerd de bundel zal gemakkelijk tillen van de onderliggende pezen onthullen van helder wit pezen die leidt naar de individuele cijfers. Snijd de FDB aan de pezen in de buurt van de tenen te bevrijden van de bundel van de voet.
  9. Plaats de hele spier bundel in de put met DMEM + BSA.
  10. Herhaal dit aan de contralaterale voet.
  11. Zodra alle FDB spieren geïsoleerd, voeg 100 ul van collagenase aan elk putje met DMEM + BSA en spieren.
  12. Controleer het succes van elektroporatie op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan digestie. Als gedaan properly, ruim 90% transfectie efficiëntie kan worden bereikt.
  13. Incubeer de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator bij 10% CO2 gedurende ongeveer 1 uur. De incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de ziekte van het model en de achtergrond en het lot van collagenase.
  14. Na 1 uur voorzichtig de FDB bundel te dragen aan het putje met enige Ringers oplossing.
  15. Vermaal de FDB bundel in de put met Ringers oplossing met behulp van een pipet 1 ml. Snijd het uiteinde van de pipetpunt met een schoon scheermesje zodat de bundel gemakkelijk passeren de pipetpunt. Zachtjes vermaal de spier (~ 15 maal), waardoor de bundel om te laten liggen en parallel tot de top. Intact vezels zal vallen in de Ringers Solution. Wanneer vezels niet gemakkelijk vallen de bundel, plaatst de spier terug in collagenase oplossing.
  16. Plaat de geïsoleerde vezels op de schotel ~ 500 ul per plaat.
  17. Laat de spier te verteren in de put gedurende 15 min.
  18. Herhaal de stappen 2,152,17 totdat de bundel kleiner wordt en de meeste vezels gescheiden van de bundel (meestal in totaal 2-3 keer). Eenmaal los van de spieren gemakkelijk gaat door een 1 ml pipet tip.
  19. Laat vezels hechten aan de schaal minimaal 15 min. Verse Ringers oplossing kan worden toegevoegd aan de plaat residuele collagenase verdunnen of veranderd afhankelijk tijdsdruk.
    Opmerking: Vezels zijn nu klaar voor beeldvorming.

3. Experimentele procedure voor de visualisatie van de Laser-induced Membraan Schade met confocale microscopie

  1. Load vezels onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming met 300 ul 2,5 uM FM 1-43 van FM 4-64 kleurstof in Ringers oplossing. In het algemeen, het vezels 15 min tot 2 uur na isolatie. Echter, kunnen vezels worden afgebeeld tot 24 uur na isolatie.
  2. Plaats de glazen bodem schotel op een confocale microscoop uitgerust met een UV laser en een 60X / 63x objectief.
  3. Zoek een vezel. Zorg ervoor dat de vezels stevig bevestigdom de schotel door de microscoop basis tikken. Uitsluiten vezels die werden beschadigd in de dissociatie proces. Beschadigde vezels kunnen membraan blebs, opname een hoog niveau van FM kleurstof, krul bevatten of buigen intens.
  4. Om membraanschade op de vezel veroorzaken, plaatst de sarcolemma in het midden van het afbeeldingsvenster met een veld duidelijke kernen. Focus op de sarcolemma gebruik van de FM-kleurstof-kanaal, zodanig dat de sarcolemma is zeer scherp.
  5. Plaats de ROI kruis haren op de sarcolemma gebruik van de FM-kanaal 4-64.
  6. Bestralen een 1 pixel punt op 80% vermogen voor 3 sec (~ 350 nm x 350 nm gebied). FM kleurstof de cel binnengaan op de plaats van verwonding. Kracht en kan worden ingesteld hoger of gebied van insult verminderen.
  7. Beelden vastleggen van de vezel voordat schade bij de schade, elke 2 seconden na beschadiging, vervolgens elke 10 sec tot 5 min. Timing kan worden aangepast afhankelijk van de behoefte. Individuele beelden kunnen worden omgezet in time-lapse filmpjes in Afbeelding J.
  8. Herhaal stap3,3 tot 3,7 op maximaal 3 vezels per gerecht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporatie is een minimaal invasieve techniek die efficiënt introduceert gezuiverd plasmide-DNA in het flexor digitorum brevis (FDB) spierbundel (Figuur 1A). Zeven dagen na transfectie fluorescent gelabeld eiwit wordt gevisualiseerd in geïsoleerde myovezels (Figuur 1B). Geïsoleerde vezels worden daarna uitgeplaat en voorbereid voor weergave op een confocale microscoop. Vezels kunnen worden blootgesteld aan laser geïnduceerde verwonding. FM kleurstof kan worden toegepast om de plaats van membraanschade identificeren (Figuur 1C)

Tijdens het verteringsproces, kan een klein aantal spiervezels worden verwond (witte pijl) (Figuur 2A). Beschadigde spiervezels kan worden geïdentificeerd door het membraan blebbing bij het sarcolemma (zwarte pijl). De beschadigde vezel is niet geschikt voor verdere experimenten en mogen niet worden gebruikt. Vertegenwoordiger confocale beelden die de expressie ofa fluorescerende fusie-eiwit in de geïsoleerde myovezels figuur 2B. Benutting van de CMV-promotor drijft optimale eiwit expressie in myovezels. DIC imaging toont een optimale vezel. FM 4-64 is aanwezig op het membraan bij lage niveaus vóór beschadiging (figuur 2C).

Representatief beeld van een myofiber geladen met FM 4-64 afgebeeld op een Leica SP 5 confocale microscoop. De sarcolemma het midden van het gezichtsveld (witte vakjes) en ROI crosshair (witte x) is afgestemd op noemen fluorescerende rand van de sarcolemma in een gebied zonder myonuclei (Figuur 3, midden). Kernen worden vermeden omdat ze FM kleurstof analyse na beeldvorming kan beïnvloeden. Bij membraan schade, FM kleurstof minimaal komt normaal myovezels (figuur 3, rechts). Spiervezels defect in membraan herstel zal vertonen verhoogde niveaus van FM kleurstofopname upon-laser-geïnduceerde schade.

-together.within-page = "1"> Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van in vivo Elektroporatie en Laser Damage Protocol. (A) hyaluronidase wordt geïnjecteerd in de voetzool van een verdoofde muis. Plasmide-DNA wordt vervolgens geïnjecteerd en spanning. (B) Zeven dagen na de injectie, de flexor digitorum brevis (FDB) bundel (witte pijl middelste paneel) is geïsoleerd van de voetzool achterlatend blootgesteld pezen (zwarte pijl). (C) Fibers uitgeplaat en laser-geïnduceerde schade wordt uitgevoerd op levende myovezels. Linkerpaneel, schaal 50 micrometer. Rechter paneel, schaal 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3551fig2.jpg "/>
Figuur 2. Geïsoleerde myovezels Uiting fluorescent gemerkte eiwitten. Zeven dagen na de elektroporatie, wordt eiwitexpressie gedetecteerd gedurende de myofiber. (A) De isolatie procedure resulteert in een klein aantal onbruikbare myovezels met verschillende membraan blebbing (zwarte pijl) en membraan verstoringen (witte pijl). Scale 5 urn. (B) representatief beeld van een gezonde myofiber. Gelijkmatig verdeeld sarcomeres gevisualiseerd in DIC imaging (links). Een myofiber uiten annexine A6 gelabeld met GFP (midden paneel). Er is minimaal FM kleurstof signaal voorafgaand aan de schade (rechter paneel). Schaal 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Alignment van LaserCrosshairs op de FM-positieve sarcolemma. Is het gebied van de rente op de sarcolemma gecentreerd binnen het gezichtsveld. De sarcolemma wordt vergroot (wit gestippelde doos) en ROI vizier gericht op de sterke FM-positieve rand van de sarcolemma in een gebied verstoken van kernen (midden paneel). Bij schade, FM kleurstof komt op de plaats van de schade (rechter paneel, witte pijl). Schaal 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gebruik van elektroporatie fluorescent gemerkte eiwitten te bestuderen in vivo is bij uitstek geschikt voor de studie van spieren vanwege het ontbreken van geschikte cellijn modellen repliceren de gehele celstructuur van spieren. Dit protocol beschrijft het gebruik van elektroporatie en hoge-resolutie confocale microscopie gedetailleerde beeldvorming van eiwit lokalisatie en translocatie after laser verwonding. Deze methode kan worden aangepast aan andere cellulaire processen waaronder cytoskelet reorganisatie, handel en fusion bestuderen.

Met behulp van dit protocol, tot 90% van spiervezels binnen de FDB spier bundel express plasmide, en dit kan gemakkelijk worden gezien door fluorescentiemicroscopie zowel vóór als na myofiber dissociatie. Er is kenmerkend een gradiënt van expressie met hogere expressie waargenomen dichter bij de injectieplaats. Door het verloop van expressie, kan het effect van het variëren eiwitexpressie fro gecontroleerdma enkel experiment. Zoals bij alle transfectiewerkwijzen Deze benadering wordt beperkt door kwesties met betrekking tot overexpressie. Met name met een hoog niveau expressie kunnen eiwit aggregatie voorkomen. In onze ervaring, de mCherry fluorescent label toont meer dan de aggregatie versterkt groen fluorescerend eiwit (eGFP) tag verminderen van de resolutie en scherpte van eiwit domeinen (bijvoorbeeld zie figuur 4 in 7). Daarnaast mTurquise2 en Venus fluorescerende labels beide aantonen voldoende fluorescentie expressie. Echter, beide eiwitten zijn minder fel dan eGFP.

Deze methode kan worden gebruikt om het levende spiervezels onder verschillende omstandigheden waaronder testen farmaceutische middelen en cellen verwonden. We gebruiken laser schade voor de sarcolemma verstoren, maar andere verwonding werkwijzen kunnen worden aangepast aan deze methode. Daartoe vorming van membraan blebs door osmotische shock en membraan schade geïnduceerd door walsen glaskralen kan ookgeëvalueerd met behulp van geëlektroporeerd myovezels 11,12. Voor laser verwonding, de aard en kracht van de laser, alsmede het doel de tijd die nodig is om een membraan laesie 13,14 creëren beïnvloeden. Bovendien zullen externe buffers bijzonder de concentratie van calcium en FM kleurstof in de buffer het reparatieproces 13,15 beïnvloeden. Deze methode werd getest op zowel Nikon en Leica confocale beeldvormende systemen en beide zijn in staat zijn de techniek. FM 4-64 is geschikt voor experimenten met groen fluorescerend eiwit 7. Anderen hebben FM 1-43, een lipofiele kleurstof die negatief bij een excitatie piek bij 470 nm en emissie piek bindt geladen fosfolipiden bij 610 nm, die de toepassing van deze kleurstof 13,15,16 beperkt gebruikt. Fotobleken en fototoxiciteit zijn beide mogelijke uitkomsten als gevolg van over-imaging. Het bepalen van de juiste balans tussen blootstelling tijd, beeldfrequentie en het aantal kanalen in beeld gebrachtparameters zijn gemakkelijk te manipuleren om deze effecten te verminderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent NS047726, NS072027 en AR052646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
  2. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  3. Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
  5. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
  6. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. (2009).
  7. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
  8. Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
  9. Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
  10. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
  11. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
  12. Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
  13. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  14. Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
  15. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
  16. Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics