DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Enskilda myofibers är stora, mycket organiserade syncytial celler. Det finns några cellkulturmodeller för muskel; men dessa modeller har som stor begränsning att de inte till fullo differentieras till mogna myofibers. Till exempel är de C2C12 och L6-cellinjer härledda från möss och råttor, respektive 1-4. Under förhållanden med serumsvält, de mononukleära "myoblast liknande" celler upphör proliferation, genomgår cellcykeltillbakadragande, och gå in i myogenic programmet bildar flerkärniga celler med sarkomerer, kallad myotuber. Med längre odlingsbetingelser kan myotuber uppvisar kontraktila egenskaper och "rycka" i kultur. Humana cellinjer har nu också inrättats 5. Förutom dessa immortaliserade cellinjer, kan mononukleära myoblaster isoleras från muskel och under liknande betingelser i serumsvält kommer att bilda myotuber. Dessa cellinjer och primära myoblast kulturer är mycket användaFul eftersom de kan transfekteras med plasmider eller transduceras med virus och användes för att studera grundläggande cellbiologiska processer. Dessa celler, även när förmås att bilda myotuber, saknar många av de framträdande dragen i mogen muskel organisation. Specifikt myotuber är mycket mindre än enskilda mogna myofibers och saknar den normala formen av myofibers. Kritiskt, myotuber saknar tvär (T-) tubuli, den membran nätverk som krävs för effektiv Ca2 + frisättning hela myoplasm.

En alternativ metod för att primär myoblast eller myogena cellinjer innebär användning av mogna myofibers. Transgenes kan användas för att fastställa expression av märkta proteiner, men denna metod är kostsam och tidskrävande. In vivo-elektroporation av mus muskel har framträtt som ett föredraget förfarande för dess hastighet och tillförlitlighet 6-10.

Metoder för in vivo elektroporering och effektiv isolering av myofibers have optimerats för musen flexor digitorum brevis (FDB) muskel 6. Metoderna kan fyllas lätt och är minimalt invasiva att inducera in vivo expression från plasmider. Detta tillvägagångssätt kombineras nu med hög upplösning avbildningsmetoder inklusive avbildning efter laser avbrott i sarcolemma 6,7. Kombinationen av fluorescerande färgämnen och expression av fluorescensmärkta proteiner kan användas för att övervaka cellbiologiska processer i mogna myofibers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metoderna i denna studie genomfördes i etiska enlighet med Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkände riktlinjer. Alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet.

1. Försöksförfarande för in vivo elektroporering av Flexor digitorum Brevis (FDB) Muscle Bundle i mus

  1. Design plasmider för in vivo expression med hjälp av en promotor känt att uttrycka i däggdjursceller (t.ex. cytomegalovirus, CMV) eller muskel (t.ex. Muscle kreatin kinas, MCK) 6,7. Större plasmider kan uttrycka på lägre nivåer. CMV-promotorn har använts i stor utsträckning 6,7.
  2. Rena plasmider från E. coli med hjälp av endotoxin fria förhållanden per tillverkarens anvisningar. Lös upp plasmiden i sterilt, endotoxinfritt TE-buffert vid två - 5 | j, g plasmid / il.
  3. Späd och delprov plasmiden till en concentration 20 ng DNA i 10 pl sterilt endotoxinfritt TE (2 ug / ul) buffert per injektion i en steril mikrocentrifugrör. Förbered en portion per injektion.
  4. Späd stam av hyaluronidas till 1x med steril fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (PBS - / -), vilket gav en slutlig koncentration av 8 enheter. Alikvotera 10 ul av utspätt hyaluronidas per injektion i ett sterilt mikrocentrifugrör.
  5. Söva musen med 2,5% isofluran tills nedsövd och okänslig för svans eller tå nypa. Placera djuret i ryggläge på en värmedyna eller uppvärmningsbord för att upprätthålla normal kroppstemperatur.
  6. Rengör trampdynan på musen med en alternerande applicering av en povidonjod scrub och alkohol tre gånger med en prep teknik som härrör från nålen platsen och strålar utåt. Denna teknik håller nålen platsen i en aseptisk tillstånd, vilket minimerar patogen introduktion.
  7. Injicera trampdynan av the mus med 10 ul av 1 x hyaluronidas lösning (2 mg / ml = 8 enheter) mellan huden och muskeln med användning av en steril 1 ml spruta. Hyaluronidas smälter komponenter i den extracellulära matrisen för att möjliggöra en effektivare införande av plasmiden i myofibers. Ange vid foten av hälen och främja nålen mot tårna. Släpp långsamt vätskan när nålen dras tillbaka. Injektionsstället under huden kommer att expandera och börjar bli rosa.
  8. Upprepa steg 1,6 och 1,7 på den kontralaterala foten.
  9. Koppla anestesi och placera musen tillbaka i buren. Låt musen för att återhämta sig helt från anestesi.
  10. Vänta 2 h.
  11. Upprepa anesthetizing och fot steriliseringsprocedurer, steg 1,5 och 1,6.
  12. Injicera utspädda plasmid-DNA in i trampdynan på samma sätt som den hyaluronidas. Försäkra dig om att den maximala volymen är 20 l eller mindre. För dubbla plasmid uttryck injicera 20 mikrogram av varje plasmid med en maximal volym på 20 &# 181; l eller mindre.
  13. Upprepa plasmid injektion på den kontratrampdynan eller använd kontra foten för kontrollinjektioner.
  14. På foten som ursprungligen injicerades, lyft huden bort från den understrykning muskeln med fin pincett och placera en 27 G nål genom bollar av huden i närheten av tårna i ett läge vinkelrätt mot läka-tå linje hos foten. Ta en andra steril 27 G-nål och placera den horisontellt genom huden på hälen. Placera nålar parallella med varandra ~ 1 cm från varandra.
  15. Använda krokodilklämmor, klämelektroderna till de parallella nålar och se till att nålarna inte i kontakt med varandra. Användningen av modellera kan säkra klämmorna på plats.
  16. Anslut elektroderna till en elektrisk stimulator.
  17. Elektroporera muskeln genom att tillämpa 20 pulser, 20 ms i längd / vardera vid 1 Hz, 100 V / cm. Tårna kan rycka med stimulering.
  18. Upprepa stimuleringsproceduren på den kontra foten om det behövs.
  19. Ta bort nålar. Torka trampdynan med povidonjod scrub.
  20. Stäng av anestesi. Återgå musen till återhämtning buren och övervaka aktiviteten. Om förfarandet genomfördes som förväntat, bör djuret återfå normal förflyttningar inom 30 minuter och uppvisar ingen skillnad i förflyttningar eller aktivitetsnivå från pre-injektion beteende. Därför behövs inga efter förfarande analgetika. Vid återhämtning, tillbaka djuret till terrariet.
    Obs: Protein uttryck kan analyseras så tidigt som 48 timmar efter elektroporering. Men för att ge mer fullständig återhämtning efter elektroporering, föredrar vi isolering och undersökning av myofibers 7 - 14 dagar efter elektroporering 10. Uttryckning kan analyseras så länge som 4 veckor efter elektroporering.

2. Experimentell Förfarande för isolering av Flexor digitorum Brevis (FDB) Fibrer

  1. Tina kollagenas. För varje FDB bunt förbereda två brunnar i en 12-brunnars vävnadsodlingsplatta. I en väl till 1 ml förvärmda Dulbeccos modifierade Eagles Media plus bovint serumalbumin (DMEM + BSA) och i den andra väl tillsätts 1 ml av förvärmd Ringers lösning. Dessutom till färska 10 ml 1x Ringers lösning på de 35 mm Sylgard skålen.
  2. Offra djuret genom CO 2 eller anestesigas inhalering, följt av cervikal dislokation eller annan metod för att säkerställa döden.
  3. Ta bakfötterna ovanför fotleden med en ren rakblad och dränka i 1x Ringers lösning i 35 mm Sylgard skålen.
  4. Pin en fot tight, tunga uppåt på Sylgard skålen med 30 G nålar genom vart och ett av de 5 tå tips och vid ankeln.
  5. Börjar vid ankeln, knipsa huden rakt upp på sidan av foten längs hårfästet mot tårna, noga med att inte nick muskeln under huden. Upprepa på den andra sidan av foten.
  6. Håll huden vid basen av fotleden med fin pincett, skära in i huden över hälen.
  7. Lyfta hudenflaxa med pincett, peka din sax mot huden för att inte nick muskeln. Klipp den underliggande bindväv, effektivt ta bort huden.
  8. För att ta bort FDB muskeln bunten skär den stora senan på hälen för att frigöra sena från benet. Håll senan med pincett, dissekera FDB bunt från den stora vita senan noggrant ta bort alla bindväv fäst FDB med en sax. Om det görs på rätt sätt bunten kommer lätt lyfta av de underliggande senor avslöjar ljusa vita senor som leder till de enskilda siffrorna. Skär FDB på senor i närheten av tårna befria bunten från foten.
  9. Placera hela muskeln knippet i brunnen innehållande DMEM + BSA.
  10. Upprepa på den kontra foten.
  11. När alla FDB muskler är isolerade, tillsätt 100 | il av kollagenas till varje brunn innehållande DMEM + BSA och muskel.
  12. Kontrollera framgång elektroporering på ett inverterat fluorescerande mikroskop före matsmältningen. Om gjort properly, uppemot 90% transfektionseffektivitet kan uppnås.
  13. Inkubera plattan i en fuktad, 37 ° C inkubator vid 10% CO2 under ca 1 timme. Inkubationstiden kan variera beroende på sjukdomsmodell och bakgrunden och massor av kollagenas.
  14. Efter 1 timme, töm FDB bunt till brunnen innehållande endast Ringers lösning.
  15. Mal sönder FDB bunt i brunnen med Ringers lösning med hjälp av en 1 ml pipett. Klipp änden av pipettspetsen med en ren rakblad så att bunten lätt kan passera genom pipettspetsen. Triturera försiktigt muskeln (~ 15 gånger) låta knippet att passera upp och ner parallellt med spetsen. Intakta fibrer kommer att falla ut i Ringers lösning. När fibrer inte lätt faller av bunten, placera muscle back i kollagenas lösning.
  16. Platta isolerade fibrerna på skålen ~ 500 l per platta.
  17. Låt muskeln att smälta i brunnen under 15 minuter.
  18. Upprepa steg 2,15till 2,17 tills knippet minskar i storlek och huvuddelen av fibrerna dissocieras från knippet (vanligen totalt 2-3 gånger). När skiljas muskeln passerar lätt genom en 1 ml pipettspets.
  19. Låt fibrer fästa till skålen i minst 15 minuter. Färsk Ringers lösning kan tillsättas till plattan för att späda rest kollagenas eller ändras beroende på tidsbrist.
    Obs: Fibrer är nu redo för avbildning.

3. Experimentellt förfarande för visualisering av Laser-inducerad membranskada med hjälp av konfokalmikroskopi

  1. Last fibrer omedelbart före avbildning med 300 pl 2,5 iM FM 1-43 av FM 4-64 färgämnet i Ringers lösning. Generellt bild fibrer 15 min till 2 timmar efter isolering. Emellertid kan fibrerna avbildas upp till 24 h efter isolering.
  2. Placera glaset nedre skålen på en konfokalmikroskop utrustad med en UV-laser och en 60X / 63X mål.
  3. Leta upp en fiber. Se till att fibern är ordentligt fastsatttill skålen genom att trycka på mikroskopbasen. Uteslut fibrer som skadats i dissociation processen. Skadade fibrer kan innehålla membran blebs, upptagnings höga halter av FM färgämne, curl eller böja intensivt.
  4. För att inducera membranskada på fibern, placera sarcolemma i mitten av bildfönstret med ett fält fri från kärnor. Fokus på sarcolemma med FM färgämnet kanalen så att sarcolemma är mycket vass.
  5. Placera ROI hårkorset på sarcolemma utnyttja FM 4-64 kanalen.
  6. Bestråla en 1 pixel punkt vid 80% effekt för 3 sekunder (~ 350 nm x 350 nm område). FM-färgämne kommer in i cellen vid platsen för skadan. Effekt och tid kan justeras för att öka eller minska området för insult.
  7. Ta bilder av fibern innan skada, vid tidpunkten för skadan, varje 2 sek efter skada, därefter var 10 sekund i upp till 5 minuter. Timing kan justeras beroende på behov. Enskilda bilder kan omvandlas till tidsförlopp filmer i Image J.
  8. Upprepa steg3.3 genom 3.7 på upp till 3 fibrer per fat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporation är en minimalt invasiv teknik som effektivt introducerar renad plasmid-DNA i flexor digitorum brevis (FDB) muskelknippet (Figur 1A). Sju dagar efter transfektion fluorescerande taggade proteinet visualiseras i isolerade myofibers (figur 1B). Isolerade fibrer stryks sedan och förberedd för avbildning på en konfokalmikroskop. Fibrer kan utsättas för laserinducerad skada. FM-färgämne kan användas för att identifiera platsen för membranskada (Figur 1C)

Under kokningsprocessen, kan ett litet antal myofibers skadas (vit pil) (Figur 2A). Skadade myofibers kan identifieras genom membranblåsbildning närvarande vid sarcolemma (svart pil). Den skadade fiber är inte lämplig för ytterligare experimente och bör inte användas. Representativa konfokala bilder som visar uttrycket ofa fluorescerande fusionsprotein i de isolerade myofibers figur 2B. Utnyttjande av CMV-promotorn driver en optimal proteinexpression i myofibers. DIC avbildning visar en optimal fiber. FM 4-64 är närvarande vid membranet vid låga nivåer före skada (figur 2C).

Representativ bild av en myofiber laddad med FM 4-64 avbildas på en Leica SP 5 konfokalmikroskop. Sarcolemma är centrerad i synfältet (vita rutorna) och ROI hårkors (vit x) är inriktad på den skarpa, fluorescerande kanten av sarcolemma i ett område som saknar myonuclei (Figur 3, mitten). Kärnor undvikas eftersom de kan påverka FM färgämne analys efter avbildning. Vid membranskada, FM färgämne in minimalt normala myofibers (Figur 3, höger). Muskelfibrer defekta i membran reparation kommer att visa förhöjda nivåer av FM färgämnesupptag på laserinducerad skador.

-together.within-page = "1"> Figur 1
Figur 1. Schematisk av in vivo elektroporation och Laser Damage protokoll. (A) Hyaluronidase sprutas in i trampdynan hos en sövd mus. Plasmid-DNA injiceras sedan och spänning appliceras. (B) Sju dagar efter injektionen, flexor digitorum brevis (FDB) bunt (vit pil mitten panel) isoleras från trampdynan lämnar bakom exponerade senor (svart pil). (C) Fibrer stryks och laserinducerad skada utförs på levande myofibers. Vänster panel, skala 50 pm. Högra panelen skala 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3551fig2.jpg "/>
Figur 2. Enstaka Myofibers uttrycker fluorescerande taggade proteiner. Sju dagar efter elektroporering, är proteinuttryck detekteras hela myofiber. (A) isoleringsförfarandet resulterar i ett litet antal oanvändbara myofibers med distinkta membranblåsbildning (svart pil) och membranstörningar (vit pil). Skala 5 um. (B) representant bild av en frisk myofiber. Jämnt fördelade sarkomerer visualiseras i DIC imaging (vänster). En myofiber uttrycker annexin A6 taggade med GFP (center panel). Det är minimal FM färgsignal före skador (högra panelen). Skala 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Anpassning av laserCrosshairs på FM-positiva sarcolemma. Regionen ränta på sarcolemma är centrerad i synfältet. Sarcolemma förstoras (vit streckad box) och ROI hårkors anpassats till kraftiga FM-positiva kanten av sarcolemma i ett område som saknar kärnor (center panel). Vid skador, går FM färgämnet vid skadeplatsen (högra panelen, vit pil). Skala 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Användningen av elektroporering för att studera fluorescerande märkta proteiner in vivo är idealiskt lämpad för att studera muskeln med tanke på frånvaron av lämplig cellinje modeller som troget replikerar hela cellstrukturen hos muskeln. Detta protokoll beskriver användningen av elektroporering och högupplösta konfokalmikroskopi att ge detaljerad avbildning av protein lokalisering och translokation efter laser sårskada. Denna metod kan anpassas för att studera andra cellulära processer, inklusive cytoskelettet omorganisation, trafficking, och fusion.

Med användning av detta protokoll, upp till 90% av myofibers inom FDB muskelknippet uttryck plasmiden, och detta kan ses med lätthet genom fluorescensmikroskopi både före och efter myofiber dissociation. Det är typiskt en gradient av uttryck med högre uttryck observer närmare till injektionsstället. På grund av gradienten yttrandefrihet, kan effekten av att variera proteinuttryck följas tillbakama enda experiment. Som med alla transfektionsmetoder, är detta tillvägagångssätt begränsas av frågor som rör uttryck. Noterbart med hög nivå uttryck kan proteinaggregation uppstå. Enligt vår erfarenhet visar mCherry fluorescerande taggen mer aggregering än den förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) taggen minska upplösningen och skärpan hos proteindomäner (exempelvis se fig 4 i 7). Dessutom, mTurquise2 och Venus fluorescerande taggar båda visar tillräcklig fluorescens uttryck. Men båda proteinerna är mindre ljus än EGFP.

Denna metod kan användas för att avbilda levande myofibers under olika villkor inklusive tester farmaceutiska medel och cell sårskada. Vi använde laserskada att störa sarcolemma, men andra såra processer kan anpassas till denna metod. För detta ändamål blebs bildning av membranet skapas genom osmotisk chock samt membranskada inducerad genom valsglaspärlor kan även varautvärderas med användning av electroporated myofibers 11,12. För laser sårskada, kommer typen och kraften i laser, liksom målet att påverka hur lång tid det tar att skapa en membran lesion 13,14. Dessutom kommer externa buffertar, särskilt koncentrationen av kalcium och FM färgämne i bufferten påverka reparationsprocessen 13,15. Denna metod har testats på både Nikon och Leica konfokala bildsystem och båda är i stånd att utföra tekniken. FM 4-64 är väl lämpad för experiment med grönt fluorescerande protein 7. Andra har använt FM 1-43, en annan lipofil färgämne som binder negativt laddade fosfolipider med en excitationstopp vid 470 nm och emissionstopp vid 610 nm, vilket begränsar tillämpningen av detta färgämne 13,15,16. Fotoblekning och fototoxicitet är både möjliga utfall på grund av över avbildning. Fastställande av lämplig balans mellan exponeringstid, bildfrekvens och antal kanaler avbildasär parametrar lätt manipuleras för att minska dessa effekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga intressekonflikter.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag NS047726, NS072027 och AR052646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
  2. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  3. Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
  5. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
  6. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. (2009).
  7. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
  8. Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
  9. Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
  10. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
  11. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
  12. Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
  13. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  14. Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
  15. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
  16. Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics