Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Biology

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Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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Abstract

Introduction

Miofibre individuali sono grandi, le cellule sinciziale altamente organizzati. Ci sono alcuni modelli di coltura cellulare per il muscolo; tuttavia, questi modelli hanno come principale limitazione che non fanno differenza completamente in fibre muscolari mature. Ad esempio, le linee cellulari C2C12 e L6 sono derivati ​​da topi e ratti, rispettivamente 1-4. In condizioni di deprivazione di siero, i mononucleari cellule "mioblasti-like" cessano proliferazione, subiscono il ritiro del ciclo cellulare, ed entrano nel programma miogenico che formano le cellule multinucleate con sarcomeri, indicati come miotubi. Con condizioni di coltura prolungata, miotubi possono esibire proprietà contrattili e "contrazione", nella cultura. Linee cellulari umane hanno ormai stati istituiti 5. In aggiunta a queste linee cellulari immortalizzate, mioblasti mononucleate possono essere isolate dal muscolo e sotto le condizioni simili di deprivazione di siero formeranno miotubi. Queste linee cellulari e colture di mioblasti primari sono altamente usoFul perché possono essere trasfettate con plasmidi o trasdotte con virus e usate per studiare processi biologici cellulari di base. Tuttavia, queste cellule, anche se indotto a formare miotubi, mancano molte delle caratteristiche salienti di organizzazione muscolo maturo. In particolare, miotubi sono molto più piccoli singole fibre muscolari mature e non hanno la forma normale di miofibre. Criticamente, miotubi mancano trasversali (T-) tubuli, la rete membranosa richiesta per il rilascio del Ca 2+ efficiente in tutto il mioplasma.

Un metodo alternativo per mioblasti primaria o linee cellulari miogeniche comporta usando fibre muscolari mature. Transgenesi può essere impiegato per stabilire espressione delle proteine ​​tag, ma questo metodo è costoso e richiede tempo. In vivo elettroporazione di muscoli del mouse è emerso come un metodo preferito per la sua velocità e affidabilità 6-10.

Metodi per elettroporazione in vivo e l'isolamento efficace di miofibre have stato ottimizzato per il mouse flessore brevis (FDB) muscolare 6. I metodi possono essere completate rapidamente e sono minimamente invasiva per indurre espressione vivo da plasmidi. Questo approccio è ora combinata con metodi di imaging ad alta risoluzione tra cui l'imaging dopo interruzione del laser del 6,7 sarcolemma. La combinazione di coloranti fluorescenti e espressione di proteine ​​marcate fluorescenza può essere utilizzata per monitorare cellulari processi biologici miofibre mature.

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Protocol

I metodi in questo studio sono stati eseguiti in conformità con l'etica Feinberg School of Medicine della Northwestern University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) le linee guida approvate. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze.

Procedura sperimentale 1. per elettroporazione in vivo del flessore Brevis (FDB) Muscle Bundle in mouse

  1. Plasmidi di progettazione per l'espressione in vivo utilizzando un promotore saputo esprimere in cellule di mammifero (ad esempio, citomegalovirus, CMV) o nel muscolo (ad esempio, Muscolo Creatina chinasi, MCK) 6,7. Plasmidi più grandi possono esprimere a livelli inferiori. Il promotore CMV è stato ampiamente utilizzato 6,7.
  2. Purificare plasmidi da E. coli utilizzando condizioni di libero endotossine le istruzioni del produttore. Sciogliere il plasmide in sterili, endotossine tampone TE libero a 2-5 mg plasmide / ml.
  3. Diluire e un'aliquota il plasmide di una concentration di 20 mg di DNA in 10 ml di endotossine sterile libero TE (2 mg / mL) tampone per iniezione in una provetta sterile. Preparare un'aliquota per iniezione.
  4. Diluire lo stock di ialuronidasi a 1x con sterile tampone fosfato senza calcio e magnesio (PBS - / -), dando una concentrazione finale di 8 unità. Aliquota 10 ml di ialuronidasi diluito per iniezione in una provetta sterile.
  5. Anestetizzare il mouse utilizzando 2,5% isoflurano fino sedato e non risponde per la coda o pizzicare punta. Posto l'animale in posizione supina su una piastra elettrica o una tabella di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea normale.
  6. Pulire la zampa del mouse con un programma alternato di uno scrub povidone iodio e alcol tre volte utilizzando una tecnica di preparazione proveniente dal sito di ago e irradia verso l'esterno. Questa tecnica mantiene il sito ago in una condizione asettica, minimizzando introduzione patogeno.
  7. Iniettare zampa di the mouse con 10 microlitri della soluzione 1x ialuronidasi (2 mg / ml = 8 unità) tra la pelle e il muscolo utilizzando una siringa sterile da 1 ml. Ialuronidasi digerisce componenti della matrice extracellulare per permettere l'ingresso più efficiente del plasmide in miofibre. Invio alla base del tallone e far avanzare l'ago verso le dita. Rilasciare lentamente il liquido mentre l'ago viene retratto. Il sito di iniezione sotto la pelle si espanderà e inizia a diventare rosa.
  8. Ripetere i punti 1.6 e 1.7 sul piede controlaterale.
  9. Scollegare il anestesia e posizionare il mouse avanti nella gabbia. Lasciare che il mouse per riprendersi completamente dall'anestesia.
  10. Attendere 2 ore.
  11. Ripetere le procedure di sterilizzazione e anestetizzante piede, punti 1.5 e 1.6.
  12. Iniettare il DNA plasmidico diluita nella zampa nello stesso modo come la ialuronidasi. Assicurarsi che il volume massimo è di 20 ml o meno. Per l'espressione dual plasmide iniettare 20 ug di ciascun plasmide con un volume massimo di 20 &# 181; l o meno.
  13. Ripetere l'iniezione plasmide sulla zampa controlaterale o utilizzare il piede controlaterale per le iniezioni di controllo.
  14. Sul piede che è stato inizialmente iniettato, sollevare la pelle dal muscolo sottolineare con pinza sottile e mettere un ago 27 G attraverso le sfere di pelle vicino le dita in posizione perpendicolare alla linea di guarire-punta del piede. Prendete un secondo sterili 27 ago G e posizionarlo in orizzontale attraverso la pelle sul tallone. Inserire aghi paralleli tra loro ~ 1 cm di distanza.
  15. Utilizzando i morsetti a coccodrillo, elettrodi morsetto agli aghi paralleli assicurandosi gli aghi non siano a contatto tra loro. L'uso della modellazione argilla può garantire i morsetti in posizione.
  16. Collegare gli elettrodi di uno stimolatore elettrico.
  17. Elettroporazione il muscolo applicando 20 impulsi, 20 msec di durata / ciascuno, a 1 Hz, 100 V / cm. Le dita possono contrarsi con la stimolazione.
  18. Ripetere la procedura di stimolazione sul piede controlaterale, se necessario.
  19. Rimuovere gli aghi. Pulire la zampa con iodio povidone macchia.
  20. Spegnere l'anestesia. Ritorna il mouse per la gabbia di recupero e monitorare l'attività. Se la procedura è stata condotta come previsto, l'animale deve riprendere il normale deambulazione entro 30 minuti e mostra alcuna differenza di deambulazione o un'attività livello dal comportamento pre-iniezione. Pertanto, sono necessari analgesici post-procedura. Il recupero, rispedire l'animale verso il vivaio.
    Nota: l'espressione della proteina può essere saggiato fin da 48 ore dopo l'elettroporazione. Tuttavia, per consentire il recupero più completo dopo l'elettroporazione, noi preferiamo l'isolamento e lo studio di miofibre 7 - 14 giorni dopo l'elettroporazione 10. Espressione può essere saggiato fintanto 4 settimane dopo l'elettroporazione.

Procedura sperimentale per 2. Isolamento delle flessore Brevis (FDB) Fibre

  1. Collagenasi disgelo. Per ogni pacchetto FDB allestire due pozzetti in una piastra di coltura tissutale 12-bene. In un bene aggiungere 1 ml di pre-riscaldato Modified Eagles media Dulbecco più Bovine Serum Albumin (DMEM + BSA) e nell'altra ben aggiungere 1 ml di pre-riscaldato soluzione Ringer. Inoltre, aggiungere freschi 10 ml di soluzione 1x Ringers ai 35 mm Sylgard piatto.
  2. Sacrifica l'animale attraverso CO 2 o inalazione di gas anestetico, seguita da dislocazione cervicale o un altro metodo per assicurare la morte.
  3. Rimuovere le zampe posteriori sopra la caviglia con una lama di rasoio pulito e immergere in soluzione 1x Ringers nei 35 mm Sylgard piatto.
  4. Pin un piede stretto, unico rivolto verso l'alto, sul piatto Sylgard con 30 aghi da G a ciascuna delle punte 5 punta e alla caviglia.
  5. Partendo alla caviglia, tagliare la pelle verso l'alto il lato del piede lungo l'attaccatura dei capelli verso le dita dei piedi, attenzione a non intaccare il muscolo sotto la pelle. Ripetere sull'altro lato del piede.
  6. Tenendo la pelle alla base della caviglia con una pinza sottile, tagliare la pelle attraverso il tallone.
  7. Sollevamento la pellepatta con una pinza, puntare le forbici verso la pelle per non nick il muscolo. Tagliare il tessuto connettivo sottostante, rimuovere efficacemente la pelle.
  8. Per rimuovere il fascio muscolare FDB tagliare il grande tendine del tallone per liberare il tendine dall'osso. Tenendo il tendine con una pinza, sezionare il fascio FDB dal grande tendine bianco rimuovere accuratamente qualsiasi tessuto connettivo attaccato al FDB con le forbici. Se fatto correttamente il bundle sarà facile sollevare dei tendini sottostanti rivelano tendini bianchi brillanti che portano alle singole cifre. Tagliare la FDB ai tendini vicino le dita liberando il fascio dal piede.
  9. Posizionare l'intero fascio muscolare nel pozzo contenente DMEM + BSA.
  10. Ripetere sul piede controlaterale.
  11. Una volta che tutti i muscoli FDB sono isolate, aggiungere 100 ml di collagenasi in ciascun pozzetto contenente DMEM + BSA e muscoli.
  12. Controllare il successo di elettroporazione con un microscopio a fluorescenza invertito prima della digestione. Se properl fattoy, verso l'alto di 90% efficienza di trasfezione possono essere raggiunti.
  13. Incubare la piastra in una umidificata, 37 ° C incubatore a 10% CO 2 per circa 1 ora. Il tempo di incubazione può variare a seconda del modello di malattia e lo sfondo e la sorte di collagenasi.
  14. Dopo 1 ora, trasferire accuratamente il fascio FDB al pozzetto contenente unica soluzione di Ringer.
  15. Triturare il fascio FDB nel pozzo con la soluzione Ringers con una pipetta 1 ml. Tagliare la fine della punta della pipetta con una lama di rasoio pulito in modo che il pacchetto può passare facilmente attraverso la punta della pipetta. Triturare delicatamente il muscolo (~ 15 volte) permettendo al fascio di passare su e giù parallelamente alla punta. Fibre intatte cadranno nella soluzione Ringers. Quando le fibre non facilmente cadere il fagotto, posizionare il muscolo posteriore in soluzione di collagenasi.
  16. Piastra le fibre isolate sul piatto ~ 500 microlitri per piastra.
  17. Lasciare il muscolo per digerire nel pozzo per 15 min.
  18. Ripetere i punti 2.152.17 fino a fascio diminuisce dimensioni e la maggior parte delle fibre sono dissociato dal fascio (di solito un totale di 2-3 volte). Una volta dissociato il muscolo passa facilmente attraverso un puntale 1 ml.
  19. Lasciate che le fibre si attaccano al piatto per un minimo di 15 min. Soluzione fresca Ringers può essere aggiunta alla piastra per diluire collagenasi residuo o cambiata a seconda vincoli di tempo.
    Nota: Le fibre sono ora pronti per l'imaging.

Procedura sperimentale 3. per la visualizzazione di laser-indotta danni della membrana utilizzando Microscopia confocale

  1. Fibre carico immediatamente prima di imaging con 300 ml di 2,5 micron FM 1-43 di FM 4-64 colorante in soluzione di Ringer. In generale, le fibre di immagine 15 minuti a 2 ore dopo l'isolamento. Tuttavia, le fibre possono essere esposte fino a 24 ore dopo l'isolamento.
  2. Porre la capsula fondo di vetro su un microscopio confocale equipaggiato con un laser UV e un obiettivo 60X / 63X.
  3. Individuare una fibra. Assicurarsi che la fibra è saldamente collegatoal piatto toccando la base del microscopio. Escludere le fibre che sono stati danneggiati nel processo di dissociazione. Le fibre danneggiate possono contenere blebs membrana, alti livelli di assorbimento di colorante FM, ricciolo o piegare intensamente.
  4. Per indurre danni membrana sulla fibra, posizionare il sarcolemma al centro della finestra di esposizione con un campo libero di nuclei. Focus sul sarcolemma utilizzando il canale FM tintura in modo tale che il sarcolemma è estremamente tagliente.
  5. Posizionare i capelli ROI croce sul sarcolemma utilizzando il canale FM 4-64.
  6. Irradiare un punto di 1 pixel alla potenza di 80% per 3 secondi (~ 350 nm x 350 zona nm). Colorante FM entrerà nella cella nel sito di lesione. Potenza e ora possono essere modificate per aumentare o diminuire l'area di insulto.
  7. Cattura immagini della fibra prima danni, al momento del danno, ogni post-danni 2 sec, quindi ogni 10 sec per 5 min. Timing può essere regolata a seconda delle necessità. Le singole immagini possono essere convertite in filmati time-lapse in Image J.
  8. Ripetere i passaggi3.3 attraverso 3.7 su un massimo di 3 fibre per piatto.

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Representative Results

Elettroporazione è una tecnica minimamente invasiva che introduce efficacemente purificato plasmide DNA nel flessore brevis (FDB) fascio muscolare (Figura 1A). Sette giorni dopo la transfezione fluorescently proteina tag viene visualizzato nella miofibre isolate (Figura 1B). Fibre isolate sono poi placcati e preparate per l'imaging su un microscopio confocale. Le fibre possono essere sottoposti a lesione indotta da laser. Colorante FM può essere utilizzato per identificare il sito del danno alla membrana (Figura 1C)

Durante il processo di digestione, un piccolo numero di miofibre può essere ferito (freccia bianca) (Figura 2A). Miofibre danneggiati possono essere identificati da membrana blebbing presenti al sarcolemma (freccia nera). La fibra danneggiato non è adatto per l'ulteriore sperimentazione e non deve essere utilizzato. Rappresentante immagini confocali mostrano l'espressione ofa proteina di fusione fluorescenti all'interno delle fibre muscolari isolate Figura 2B. Utilizzo del promotore CMV spinge l'espressione della proteina ottimale in miofibre. Imaging DIC mostra una fibra ottimale. FM 4-64 è presente sulla membrana a bassi livelli precedenti danni (Figura 2C).

Immagine rappresentativa di una myofiber carico di FM 4-64 ripreso su un microscopio confocale Leica SP 5. Sarcolemma è centrato nel campo visivo (caselle bianche) e il ROI mirino (bianco x) è allineato sul bordo croccante, fluorescente del sarcolemma in una zona priva di myonuclei (figura 3, al centro). I nuclei sono evitati in quanto possono influenzare il colorante FM analisi post imaging. Al danno di membrana, colorante FM entra minimamente miofibre normali (Figura 3, a destra). Le fibre muscolari difettose nella riparazione della membrana mostrerà aumento dei livelli di FM colorante assorbimento di un danno-indotta da laser.

-together.within-page = "1"> Figura 1
Figura 1. Schema di elettroporazione in vivo e Laser Damage Protocol. (A) Ialuronidasi viene iniettato nella zampa di un mouse anestetizzato. DNA plasmidico è quindi iniettato e la tensione è applicata. (B) Sette giorni dopo l'iniezione, il brevis flessore (FDB) fascio (freccia bianca pannello centrale) è isolato dalla zampa lasciando dietro di tendini esposti (freccia nera). (C) Le fibre sono placcati e danno indotta da laser viene eseguito su fibre muscolari in tensione. Pannello di sinistra, scala 50 micron. Pannello destro, scala a 5 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Isolati myofibers Esprimere fluorescenza proteine ​​Tagged. Sette giorni dopo l'elettroporazione, l'espressione della proteina viene rilevato in tutto il myofiber. (A) I isolamento procedura comporta un piccolo numero di fibre muscolari inutilizzabili con blebbing distinta membrana (freccia nera) e le interruzioni di membrana (freccia bianca). Scala 5 micron. (B) Immagine rappresentativa di un myofiber sano. Sarcomeri equidistanti vengono visualizzati in DIC immagini (a sinistra). Un myofiber esprimendo annessina A6 etichettato con GFP (diagramma centrale). Vi è minimo segnale colorante FM prima di danno (pannello di destra). Scala 5 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Allineamento del laserCrosshairs sul Sarcolemma FM-positive. La regione di interesse sul sarcolemma è centrata all'interno del campo di vista. Sarcolemma viene ingrandita (scatola bianca tratteggiata) e mirino ROI allineato sul bordo FM-positivo tagliente del sarcolemma in una zona priva di nuclei (diagramma centrale). Al danno, colorante FM entra nel sito di lesione (pannello di destra, freccia bianca). Scala 5 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'utilizzo di elettroporazione per studiare le proteine ​​fluorescenti tag in vivo è ideale per lo studio del muscolo in assenza di opportuni modelli di linee cellulari che riproducono fedelmente l'intera struttura cellulare del muscolo. Questo protocollo descrive l'utilizzo di elettroporazione e ad alta risoluzione microscopia confocale a fornire immagini dettagliate di localizzazione delle proteine ​​e la traslocazione dopo ferimento laser. Questo metodo può essere adattato per studiare altri processi cellulari tra cui riorganizzazione del citoscheletro, il traffico, e la fusione.

Usando questo protocollo, fino al 90% delle miofibre all'interno FDB fascio muscolare plasmide espresso, e questo può essere visto facilmente mediante microscopia a fluorescenza prima e dopo miofibre dissociazione. Vi è in genere un gradiente di espressione con una maggiore espressione osservato più vicino al sito di iniezione. A causa del gradiente di espressione, l'effetto della variazione dell'espressione proteica può essere monitorato froma singolo esperimento. Come con tutti i metodi di trasfezione, questo approccio è limitato da questioni legate alla sovraespressione. In particolare, con l'espressione di alto livello, può verificarsi aggregazione proteica. Nella nostra esperienza, l'etichetta fluorescente mCherry dimostra più aggregazione di tag proteina fluorescente verde rafforzata (eGFP) ridurre la risoluzione e la nitidezza di domini di proteine ​​(per esempio vedi figura 4 a 7). Inoltre, i tag fluorescenti mTurquise2 e Venere entrambi mostrano espressione di fluorescenza sufficiente. Tuttavia, entrambe le proteine ​​sono meno brillante rispetto eGFP.

Questo metodo può essere usato per miofibre viventi immagine sotto una varietà di condizioni tra cui agenti test farmaceutici e ferimento cellulare. Abbiamo usato lesioni laser per distruggere il sarcolemma, ma altri processi ferendone potrebbe essere adattato a questo metodo. A tal fine, la formazione di membrane vescichette creato da shock osmotico e lesioni della membrana indotta da laminazione perle di vetro possono anche esserevalutato utilizzando fibre muscolari elettroporate 11,12. Per ferimento laser, il tipo e la potenza del laser, così come l'obiettivo influenzeranno la lunghezza del tempo necessario per creare una lesione membrane 13,14. Inoltre, tamponi esterni, in particolare la concentrazione di calcio e colorante FM all'interno buffer influenzeranno il processo di riparazione 13,15. Questa metodologia è stata testata su entrambi i sistemi di imaging confocale Nikon e Leica ed entrambi sono in grado di eseguire la tecnica. FM 4-64 è particolarmente adatto per la sperimentazione con proteina fluorescente verde 7. Altri hanno utilizzato FM 1-43, un altro colorante lipofilo che lega caricato negativamente fosfolipidi con un picco di eccitazione a 470 nm ed emissione picco a 610 nm, che limita l'applicazione di questo colorante 13,15,16. Photobleaching e fototossicità sono entrambi possibili risultati a causa di un eccesso di imaging. Determinazione del giusto equilibrio tra il tempo di esposizione, la frequenza immagine e numero di canali ripresosono parametri facilmente manipolati per ridurre questi effetti.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede NS047726, NS072027, e AR052646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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