Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. J. Vis. Exp. (125), e53557, doi:10.3791/53557 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glioblastom (GBM), cerrahi, kemoterapötik ve radyasyon tedavisine rağmen son derece kötü klinik prognoz taşımaya devam etmektedir. Çevreleyen beyin parankim içine progresif tümör invazyonu, kalıcı bir terapötik zorluğu temsil eder. GBM için anti-migrasyon terapileri geliştirmek için, kontrollü deneyler için fizyolojik açıdan alakalı bir arka plan sağlayan model sistemleri esastır. Burada, cerrahi rezeksiyon sırasında elde edilen insan GBM dokusundan dilim kültürleri üretmek için bir protokol sunmaktayız. Bu kültürler, hayvan ksenograftları ya da tek hücreli kültürler aracılığıyla pasifleştirilmeden ex vivo denemeye izin verir. Ayrıca, tümör hücrelerinin migratör davranışını nicel olarak incelemek ve terapötiklerle ilişkili tepkiyi incelemek için hücre izlemeyle birlikte konvansiyonel mikroskopi taramalı zaman atlamalı lazer taramasını tarif ediyoruz. Dilimler, cerrahi doku ediniminden 90 dakika sonra tekrarlanabilir bir şekilde üretilir. Retroviral aracılı fluoresan hücre laBeling, konfokal görüntüleme ve tümör hücresi migrasyon analizleri daha sonra kültürden iki hafta içinde tamamlanır. İnsan GBM'sinde artan göç davranışıyla ilişkili genetik faktörleri ortaya çıkarmak için bu dilim kültürlerini başarıyla kullandık. Ayrıca, modelin göç karşıtı tedavilere yanıt olarak hastaya özgü varyasyonu saptama yeteneğini doğrulamış bulunuyoruz. İleriye doğru ilerleyerek, insan GBM dilim kültürleri kişiselleştirilmiş nöro-onkolojik terapiyi ilerletmek için terapötik ajanlara tümör hassasiyetinin hızlı ex vivo değerlendirmesi için çekici bir platformdur.

Introduction

Glioblastomun (GBM) laboratuvar çalışması, insan hastalığının gerekli patolojik özelliklerini, yani tümör hücresi migrasyonu ve istilasını sadakatle tekrarlayan model eksikliği nedeniyle engellenmektedir. 2D ve 3D in vitro invazyon testlerinin yanı sıra 3B kemirgen dilim kültür modelleri ile karşılaştırmalı çalışmalar, bu iki bağlamda mekanik olarak birbirinden farklı hücresel göç programlarını ortaya çıkarmıştır, bu bulgular 2D sistemlerinden insan hastalığına 1 , 2 , 3'e çevrilebilirliği potansiyel olarak sınırlayıcıdır. Burada tarif edilen organotipik tümör dilim kültürü ve görüntüleme paradigması, cerrahi rezeksiyonla elde edilen ex vivo insan tümör dokusu dilimleri içindeki tümör hücresi göçünün incelenmesine izin verir. Böylece, cerrahi olarak rezeke edilen tümör dokusunun dilim kültürleri, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile birleştiğinde yerli halktaki tümör hücresi göçünü incelemek için bir platform oluştururlarDoku eritme veya kültür pasajı olmaksızın mikro ortam.

İnsan tümörü ksenograftlarından, retroviral kaynaklı tümörlerden ve tümör invazyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5'i çalışmak için hücresel bindirmelerden üretilen GBM'nin kemirgen beyin dilim kültürü modellerini kullanan geniş literatür var. Yakın geçmişte, birkaç grup organotipik dilim kültürlerinin üretimini doğrudan insan GBM dokusundan 6 , 7 , 8 , 9 , 10'dan anlattı. Bununla birlikte, dilimleme tekniği ve kültür ortamı ile ilgili yayınlanmış protokoller arasında belirgin bir farklılık var. Ayrıca, organotipik dilim kültürlerinin kullanımı, hücre sinyalindeki değişiklikleri içeren statik deneysel son noktalara odaklanmıştırNg, çoğalma ve ölüm. Burada tarif edilen protokol, zamana bağlı lokal tarama konfokal mikroskobu ile dinamik tümör hücresi davranışlarının zaman çözümlemeli gözlemini dahil ederek önceki dilim kültürü paradigmalarını genişletir. Arası 11 ve tümör içi, 12 yeni keşfi, insan GBM'de 13 genetik çeşitlilik tümör hücre davranışları ve tedavi tümör yanıtı üzerindeki etkileri ile bu heterojenite bağlama öneminin altını çizmektedir. Burada, bir insan kanser dokusundan doğrudan dilim kültürlerinin kullanımı için, yakın zamanda gerçek zamanlı olarak tümör hücresi göçünü görselleştirmek için aerodinamik ve tekrarlanabilir bir protokol bildirdik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hasta doku örneklerinin toplanmasından önce, onaylanmış bir Kurumsal Değerlendirme Kurulu (IRB) protokolü uyarınca her bir hastadan bilgilendirilmiş onam alınmalıdır. Bu protokolün yazarları, Colorado Hastanesi ve Inova Fairfax Hastanesi'nde onaylanmış IRB protokolleri altında tanımlanan çalışmalar için onay aldı. Bu dilim kültürlerinden toplanan veriler, hasta bakım kararlarını yönlendirmek için kullanılmamıştır.

1. Ön dilimleme Hazırlığı

  1. Tümör rezeksiyonu ve doku toplanması planlanan gün önce "doku işleme" medyası ve "dilim kültür bakımı" medyası hazırlayın (veya 2 hafta içinde önceden üretilmiş medyadan yararlanın). Doku işleme ortamı oluşturmak için 5 mL Penisilin-Streptomisin çözeltisi (10,000 U / mL) ve 5 mL İM HEPES'den 500 mL yüksek-Glukoz DMEM'e ekleyin.
  2. Nöronal ortamın ( örn. , Neurobasal) zemini kullanarak 250 mL'lik dilim kültürü bakım ortamı hazırlayınSel fenol kırmızısı. Bu ortamı 10 mM HEPES, 1x B-27 takviyesi, 400 uM L-glutamin, 600 uM L-alanil-L-glutamin dipeptid, 60 U / mL penisilin, 60 μg / mL streptomisin ve 6 U / mL nistatin ilave edin.
  3. Tüm ortamları en fazla 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.

2. Gün Cerrahi: Doku Edinimi

  1. Doku alımı günü, otoklavlanmış cam eşyalar ve steril bir tekniği laminer bir akış davlumbazı kullanarak doku işleme ortamında düşük erime sıcaklığına sahip agarozların% 1'i ve% 2'si (ağırlıkça / hacimce%) 50 - 100 mL hazırlayın. Her iki agaroz konsantrasyonunun, tümör dokusu kıvamında öngörülemeyen değişimi karşılaması için ihtiyaç vardır.
  2. Hafif bir kaynama gözlenene kadar, bir mikrodalga fırını kullanarak agaroz süspansiyonunu ısıtın. Kullanıma kadar sıvı halde kalmasını sağlamak için agaroz çözeltisini 37 ° C su banyosuna yerleştirin.
  3. 6-yuvalı plakanın her kuyucuğuna 1 mL dilim kültürü bakım ortamı yerleştirin.
  4. Steril kullanınForseps her boşluğa boş PTFE kültür ekleri yerleştirin. Plakayı, nemlendirilmiş, su ile kaplanmış, 37 ° C'de muhafaza edilen% 5 CO 2 atmosferi ile doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
  5. Laminer akış kaputunda steril bir Pasteur pipeti kullanarak, tümör dokusu edinmeden önce yaklaşık 15 ila 30 dakika boyunca buz soğukluğunda doku işleme ortamı içeren bir şişeye% 95 O 2 /% 5 CO 2 gazı karışımı kabarcıklandırın. Aşırı oksijenli ortam kullanımı, işlem sırasında toplu dokuda hipoksiyi en aza indirir.
  6. Ameliyathane ve dilimleme tesisi arasında doku nakletmek için supra-oksijenlenmiş buz soğukluğunda işleme ortamı 20 mL alikotları içeren etiketli 50 mL konik tüpler (izole edilecek bireysel tümör bölgeleri için yeterli sayıda) hazırlayın.
  7. Nöroşirürjörle birlikte, ameliyat öncesi, örnek alımı için tümör bölgeyi planlayın. Hastanın klinik tahmini üzerinde gösterildiği gibi kontrast arttırıcı bir tümör bölgesi seçinG (T1 post-gadolinyum manyetik rezonans görüntüleme (MRI) dizileri). Önceki tecrübeler, bu alanın nekrotik dokuya kıyasla canlı tümör dokusu ürettiğini önermektedir.
    NOT: Çevredeki (peritümoral) beyaz cevherden dilimler oluşturulmaya çalışılmıştır; Bununla birlikte, arka plan otofloresansı ve azalmış tümör hücre yoğunluğu, bu dilimlerin deneysel kullanımını sınırladı.
  8. Tümör rezeksiyonunun başlangıcına doğru tümör dokusu elde edin. Kapsamlı bipolar kotere maruz kalan tümör dokularının toplanmasını önleyerek, termal yaralanmaya sekonder doku yaşayabilirliğini tehlikeye atabilirsiniz. Adımsal tümör rezeksiyonu sırasında elde edilen doku örnekleri, uzun bloklardaki rezeksiyonlardan elde edilen dokuya kıyasla, canlılığın arttığını göstermektedir. Bu gözlem, cerrahi rezeksiyon ve edinim için uzatılmış zamanın bir sonucu olarak kan akımının farklı tümör dokusu yoksunluğu ile ilişkili olabilir.
  9. İsterseniz, numuneleri izole etmek için tümör dokusunu ayrı konik tüplere etiketleyin ve saklayın.Farklı tümör bölgelerinden. ( Yani, yüzeysel veya derin tümör dokusu). İntraoperatif cerrahi navigasyon mevcut olduğunda / olduğunda kesin doku yerleri kaydedilebilir.

3. Dilim Kültür Hazırlığı

NOT: Bu protokol yeni tespit edilmemiş insan dokusunun kullanılmasını gerektirir. Tüm numunelerin bulaşıcı olduğu kabul edilir ve evrensel kan yoluyla patojenler protokollerine göre ele alınmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman her zaman giyilmelidir. Forceps ve scalpels kullanımdan önce 15 dakika UV ışığına maruz bırakılmalıdır. Kullanım esnasında, araçlara% 7 etanol (EtOH) püskürterek, sıvı kullanılmadan önce buharlaşmaya bırakılmalıdır. Dilimleme işlemi, filtrelenmiş hava ile yatay bir laminer akış başlığı kullanılarak yarı steril bir şekilde yapılır.

  1. Tümörlü doku parçalarını buz gibi soğuk işlem ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Tümör dokusunu yıkamak ve yapışık kırmızı kan hücrelerini en aza indirmek için,Petri kabındaki ortamı üç kez hafifçe değiş tokuş etmek ve atmak için bir pipet kullanın.
  2. Bir bisturi kullanarak, tümör parçalarını dikdörtgen kutu şekillerine kesin. Doku parçalarını yaklaşık 3 mm x 3 mm x 10 mm e kadar kesin. Bağlı damarları dikkatli bir şekilde ince forsepsle eksizyon veya nazikçe çekerek çıkarın.
  3. 5 - 7 mL 37 ° C agaroz pipetle küçük bir küp şeklinde (~ 2 cm 3 ) plastik katıştırma kalıbına pipetleyin. Kullanmadan önce agaroz çözeltisinin sıcaklığının steril bir termometre ile 37 ° C'den yüksek olmamasını onaylayın.
  4. Agaroz buz banyosunda yaklaşık 1 dakika bekletin.
  5. 2-4 tümör dokusu "şeritleri" dikey olarak uzun eksenli agaroza yerleştirin.
    NOT: Doku şeritleri katılaşmadan önce agarozda "batar" eğiliminde olacaktır. Bu komplikasyondan kaçınmak için, agaroz daha da katılaşana kadar doku şeridini dikey yönde tutun.
  6. Agaroz kalıbı içeren dokuyu buzda 2 - 5 mi tutunN sağlamlaştırmayı kolaylaştırmak için.
  7. Kalıptan buz çıkarın ve formun kenarlarını bir neşterle keserek hafifçe agaroz bloğu çıkarın. Agarozu kırabilen blok üzerine aşırı kuvvet uygulamayın.
  8. Agaroz bloğu vibratome numune plakasına yapıştırmak için cıva serı bir damla cyanoacrylate tutkalı kullanın. Tutkal yaklaşık 1-2 dakika ayarlayın.
  9. Vibrasyonlu rezervuarı, örnek plakasına yapıştırılmış agaroz bloğu batırmak için buz gibi işlem ortamı ile doldurun.
  10. Dilimleme sırasında, kesilmiş steril bir plastik pipet yardımıyla vibratome haznesine köpük% 95 O 2 /% 5 CO 2 karışımı.
  11. Vibrasyonlu dilim kalınlığını 300 - 350 μm olarak ayarlayın.
  12. Bıçak ilerleme hızını ve bıçak genliğini doku tutarlılığına göre ayarlayın. "Sert" GBM dokusu, daha yavaş bıçak ilerleme hızları ve daha yüksek genlik gerektirir. Tam bıçak hızı ve amplitüd ayarları, vibratome özelliklerine göre değişir.
  13. Doku parçalarını paslanmaz çelik mikro spatula kullanarak buz soğukluğunda işleme maddesi ile Petri kabına aktarın.
  14. PTFE insertleri ve inkübatörden dengelenmiş dilim kültür ortamı içeren 6 yuvalı plakalar elde edin (bölüm 2, adım 4'te hazırlandığı gibi).
  15. Paslanmaz çelik mikro spatula kullanarak plak dokusu dilimleri. Hafifçe spatula üzerindeki dilimi itmek için "sıvı dalgası" üretmek için küçük, ince bir kıl fırça kullanarak dokunun doğrudan temasını ve manipülasyonunu en aza indirin. A.Ve kültür ekine ekleyin.
    NOT: Doku kültürü ekinin üstüne eklenen işleme ortamının miktarını en aza indirin. Dilimlerin kaymasına neden olan aşırı miktarda ortam aktarılırsa, ortamı çıkarmak için steril bir Pasteur pipeti kullanın.
  16. Tümör dilimlerini içeren 6 yuvalı plakları,% 5 CO 2 atmosferi ile 37 ° C'de muhafaza edilen inkübatöre geri döndürün.
    NOT: Tüm gömme ve dilimleme protokolü ameliyathanedeki tümör dokusunun alınmasından 90 dakika sonra tamamlanmalıdır.

4. Dilim Kültürü Bakımı

  1. 12-24 saat sonra, steril bir forseps ile her bir ekleme jantını kavrayarak dilim kültürlerini aktarın ve taze dilim kültürü bakım ortamı içeren plakalara aktarın. Kesit kültürü bakım medyasının, her bir oyuğa aliquoted olduğundan emin olun, enkapsatörde en az 15 dakika ekler aktarmadan önce dengeye getirin.
  2. Eklemeleri yeni dengelenmiş dilim cul'u ile yeni 6 yuvalı plakalara taşıyınHer 48 saatte bir medya hazırlayın.
  3. Arzu edildiğinde, biyokimyasal testlerde ( örn. ELISA) derhal kullanılmak üzere bir pipetle eski dilim kültür ortamına bölünmüş veya gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de dondurulmalıdır.

5. Retrovirüsü ifade eden Yeşil Floresan Protein Yoluyla Tümör Hücre Etiketleme

NOT: Tümör hücresi migrasyonunun analizi için zaman atlamalı mikroskopi, dilim kültürü içindeki hücrelerin sabit, uzun vadeli flüoresan etiketlemesini gerektirir. Retrovirüs kullanımı, seçici olarak bölünen hücrelere enfekte olduğundan, dilim içerisinde bulunan mikroglia veya diğer hücre tiplerine kıyasla, tümör hücresi popülasyonu içindeki floresan etiketlemeyi zenginleştirdiği için önerilir. Enfeksiyonun Standardizasyon 10 4 CFU bir virüs titre / uL hücre göçünün izleme ve analiz için yeterli yeşil floresan protein ifadesi ile göstermektedir. Artan viral titre, seçici olmayan virüsün ( örn., Adenovirüs, lentivirüs) veya otTüm hücreleri etiketleme araçları, göç esnasında net hücre sınırlarının tanımlanmasını engelleyebilir ve bu nedenle de analizleri karmaşık hale getirebilir. Alternatif floresan markörlerinin kullanımı gerektiği gibi kullanılabilir ve optimize edilebilir.

  1. Ya standart protokoller 5, 14 ile ya da ticari olarak temin edilebilen bir kaynaktan tümör dilimleri bulaşmasına retrovirüs elde edin. Viral süpernatanı, 10 4 CFU / μL'lik bir viral titreye ulaşmak için tamamlanmamış nöronal ortam içine uygun hacim ekleyerek inceltin.
  2. Kültürden 7-10 gün arasında 5-10 μL virüs (10 4 CFU / μL) ile ilgili tümör dilim kültürlerini enfekte edin. Virüs, her doku diliminin yüzeyine nazikçe damlatılarak yerleştirilir. Dilim ekin yüzeyi üzerinde yüzen eklenen süpernatant hacmini azaltın. İnkübatöre dilim kültürleri içeren plakaları geri getirin.
  3. Etiketli tümör hücreleri için dilimleri, 24 saat sonra başlayarak değerlendirin Viral enfeksiyon (bkz. Bölüm 6). Bu zaman gecikmesi, viral birleşmeye ve flüoresans gen ifade kinetiğine bağlı olarak değişecektir. Burada kullanılan viral yapılar için standart bir epifluoresan mikroskopu ile sağlam flüoresan sinyali izlemek için 72 saat gerekiyordu.
    NOT: Nadiren, dilimler, viral olarak işaretlenmiş hücrelerin ağırlıklı olarak periferik dağılımını gösterir ve bu da konfokal görüntülemeyi zorlaştırabilir. Bu komplikasyondan kaçınmak için, dilim boyunca dilim kalınlığını ve kalınlık değişimini azaltmaya çalışın. Dilim kültürü merkezin yakınında daha kalın bir bölgeye sahipse, bu, yeterli miktarda besleyici içeri girmesini engelleyebilir, böylelikle aktif olarak bölünen tümör hücrelerinin popülasyonunu sınırlayabilir. Bu komplikasyonun taranması için nitel bir analiz, dilim kültür ortamına bir tetrazolyum boya reaktifinin ( yani MTT) eklenmesidir. Reaktif ekledikten sonra maviye dönüşmeyen dilim alanları, metabolik aktivite eksikliği ve dilim sağlığını tehlikeye attığını gösterir.
Le "> 6. Tüm Hücre Göçünün Geçici Tekli Foton Lazer Taramalı Konfokal Görüntüleme

NOT: Başarılı bir bilgi iletimi yapıldıktan ve kültürün sağlığı teyit edildiğinde, kontrol koşulları altında hücreler görüntülenebilir ve ardından muamele koşulları altında eşit bir görüntüleme süreci izlenebilir. Bu protokolü kullanarak, hücreler başarıyla görüntülendi ve her koşulda 12 saat boyunca izlendi. Bununla birlikte, daha kısa veya daha uzun görüntüleme ve çevresel manipülasyon periyotları da bilgilendirici olabilir.

  1. Mikroskop Yükleme
    1. Görüntülemeden önce, bir cam alt tabağa 1 mL taze dilim ortam yerleştirin.
    2. Cam alt çanağındaki ortamın 15 dakika süreyle kuluçka makinesinde dengeye getirilmesine izin verin.
      NOT: floresan konjuge lektinler (mikroglia etiketleme için, yani Isolectin IB 4) veya ligand konjuge kuantum noktaları olarak bu nokta çözünür işaretleme maddeleri, 'de, hücrenin tanımlanmasına yönelik dilim kültür ortamına ilave edilebilirGörüntüleme sırasında ular alt popülasyonlar.
    3. Görüntülemek üzere inserti, laminer bir akış davlumbazında steril forseps kullanarak cam alttan bir tabaka aktarın. Çanağı mikroskop sahnesine nakledin.
    4. Kesilmiş mikroskop sahne üstü inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO 2 atmosferinde dilim kültürlerini koruyun. (Daha uzun görüntüleme deneyleri için özellikle önemlidir) aşırı ortam buharlaşmayı önlemek için varsa inkübasyon odası steril H2O nemlendirme kullanmaktadır.
    5. Uzun çalışma mesafesi 10X hava hedefi ve tek foton ve / veya çoklu foton için lazer uyarımına sahip bir konfokal mikroskop kullanın.
      NOT: Mikroskop objektif lensinin yeterli çalışma mesafesi sağladığından emin olun. Sahne üstü kuluçka makinesi, cam taban çanağı ve doku kültürü eklemesinin yüksekliğinin bir sonucu olarak, uzun çalışma mesafesi hedefleri önemlidir.
    6. Cam alt plakayı sabitleyin, plastik Petri kabı kapağını çıkarın ve bir gaz-Geçirgen membran.
  2. Görüntü edinme
    1. Dilimi görsel olarak incelemek için mikroskop kullanın ve dilim kenarı ile merkez arasında flüoresan etiketli tümör hücrelerinde yeterli yoğunlukta uygun bir alan bulun. Görüntüleme sırasında doku kaymalarının duyarlılığının artması nedeniyle dilimin kenarında görüntüleme alanlarından kaçının. Bu kaymayı sınırlandırmak için doku dilimi harpları kullanılabilir.
    2. Görüntüleme yazılımının çok boyutlu analiz modunda, resimlenecek tüm pozisyonların görünür floresan hücresel sinyali içerdiği şekilde, ilk (alttaki) ve son (üstteki) Z-yığını sınırlarını ayarlamak için kullanın. 10 μm'lik sabit bir Z adımıyla dilimin 150-200 μm boyunca görüntüleme, hücre yollarını izlemek için yeterli çözünürlük sağlamıştır (bu, tek tek görüntüleme ihtiyaçları için ayarlanabilir).
    3. Mikroskopta motorlu bir aşama varsa, her bir Z-yığını edinimi için yeterli zamana izin verin. Satın almalar arasındaki zaman aralığını eşit olarak ayarlayınPozisyon başına tarama süresi x görüntü pozisyonları sayısı ( yani, görüntülemiş tümör bölgeleri).
      NOT: Yeşil ve kırmızı fluoroforların eşzamanlı olarak uyartılması için, aynı anda 488 nm ve 633 nm uyarım ile bir çift hatlı lazer çizgi tarama programı kullanın. Seçilen lazer uyarımının dalga boyu, ifade edilen bireysel fluoresan proteinlerine göre değişir.
    4. Görüntülenen tümör bölgeler arasında üniform lazer gücü ve konfokal iğne deliği ayarı yapın. Fototoksisiteyi sınırlandırmak için tümör hücresi cisimlerini ve işlemlerini açık bir şekilde sınırlamak için gereken en düşük lazer gücü ayarından yararlanın. Belirli görüntüleme parametre birimleri ( yani güç ve konfokal iğne deliği ayarları) mikroskop ve lazer kaynak özelliklerine göre değişir.
    5. Amaça doğru ilerleyen odak düzlemlerinde 2-3 "tampon" Z-yığını basamakları ekleyerek potansiyel ortam buharlaşmasını telafi edin. Bu, dokunun Z-yığını edinimi aralığından uzak durmasını etkili bir şekilde engellerDikey düzlemdeki iyonlar.

7. Görüntü Post-İşleme ve Tümör Hücre Takip

NOT: Birçok konfokal görüntüleme sistemi, tescilli görüntü işleme yazılımı ile donatılmıştır. Aşağıda ele alınan işleme adımları, yazılım platformları arasında gerçekleştirilebilen genel bir protokolü içermektedir. Açık kaynaklı platformlar NIH ImageJ ve MTrackJ 15 için özel talimatlar verilecek.

  1. Z-yığın dosyasını açın. ImageJ'de "Görüntü → Yığınlar → Z Projesi" seçeneğini tıklayın. Dahil etmek için ilk ve son Z yığınını seçti ve projeksiyon türü olarak "Maksimum Yoğunluk" ı seçti. Sonuç, maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) olarak adlandırılan bir işleme. Görüntülenen her bölgede yakalanan Z yığını görüntülerinin her bir kümesinden bir MIP oluşturun.
  2. Bir zaman serisi oluşturmak için her bölgeden MIP'leri bitiştirin. "Görüntü → Yığınlar → Yığın Görüntüler" i tıklayın.
  3. Manuel olarak konumu belirleyinTümör hücresi cisminin görsel olarak belirlenmiş merkez noktasını seçerek hücre gövdesinin "centroid" inin. Bu işlem, MTrackJ'nin ("NIH ImageJ için bir açık kaynak eklentisi") "add" izi işlevini kullanarak hücre gövdesini tıklatarak gerçekleştirilir.
  4. Görüntü serisinin her karesinde hücre gövdesi konumunu sınırlamak için tıklayın. Bu, her hücre için benzersiz bir "parça" oluşturur. Ardından sonraki hücrenin hücre gövdesi konumlarını işaretleyin. Tüm hücre geçiş yolları izlenene kadar bu işlemi tekrarlayın.
  5. Belirli bir tümör mikro bölgesinde bir hücre popülasyonu izlendiğinde, MTrackJ'nin "ölçü" fonksiyonunu kullanarak tüm hücre izi koordinatlarını verin. Dosyayı .xls biçimi olarak kaydedin, böylece ham veriler elektronik tablo veya kullanıcı tarafından oluşturulan yazılım kullanılarak analiz edilebilir.
  6. Taşıma hızının türetilmesi, yönlendirilmesi ve diğer geçiş işlemlerini içeren niceliksel analizler yapmak için bir hücrenin taşıma izindeki her bir nokta için kaydedilen koordinatları kullanınÖlçütler, Parker ve ark. 16'da açıklandığı gibi.
    NOT: Hesaplanan tüm mesafeler ve hızlar gerçek değerlerin altında tahmin edilmektedir. Bu, maksimum yoğunluk projeksiyonlarının oluşturulması yoluyla üç boyutlu görüntülerin (ve göç yollarının) iki boyutlu verilere dönüştürülmesinde doğar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Grubumuz ilk GBM rezeksiyonu yapılan 50'den fazla hastadan başarıyla dilim kültürleri üretmiştir. Bu dilim nesil, kültür, retroviral etiketleme, görüntüleme ve göç analizi protokolü tekrarlanabilir bir iş akışına dönüştürülmüştür ( Şekil 1 ). Kritik olarak, bu organotipik GBM dilimleri, kültürde 15 güne kadar patolojik özelliklerin ve mikroglianın korunması da dahil olmak üzere kültür boyunca kaynaklanan tümör dokusu ile uyuşma sergilediğini gösterir ( Şekil 2 ). Buna ek olarak, mikro çevre değişikliklerine tümör tepkisinin fonksiyonel analizlerini yapmak için bu sistemi kullandık. Fizyolojik bütünlüğü metrik olarak, GBM kesit kültürleri, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF), in vivo 17 bolca GBM mikro-ortam içinde meydana gelen bir işlemin üretimini ölçerek hipoksi (% 1 O 2) nasıl karşılık incelenmiştir"18. Dilim kültürlerini hipoksik koşullara yerleştirerek, dilimler hızlı bir fizyolojik tepki gösterdi ve medyaya VEGF salımını sağladığını gösterdik ( Şekil 3 ).

Tümör hücresi göçünün niteliksel ve niceliksel yönlerini değerlendirmek için, ayrıntılı göç haritaları üretmek için zaman atlamalı görüntüleri kullandık. Bu haritalar tümör nüfusun dinamik göç davranışının statik görüntülenmesini sağlayan, tümör mikro-bölgeler (1 mm 2) sınırları içinde izlenen tüm GBM hücreleri ayırmak. Her bir hücre için, tümör bölgeleri, tümör numuneleri ve tedaviye yanıt olarak göç parametrelerindeki değişikliklerin araştırılmasına izin verilerek, göç hızının ve yöneliminin nicel ölçümleri (hücre yer değiştirmesi / kat edilen mesafe) hesaplandı ( Şekil 4 ).

Hücre etiketleme ve görüntüleme protokol desBurada kürlenen, yerli tümör mikro ortamı boyunca göç sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yeterli uzaysal ve zamansal çözünürlük sağlar. Dilim kültürü içinde morfolojik olarak farklı hareketli tümör hücreleri ve mikroglial karışımı gözlemledik ( Şekil 5A ). Tümör hücresi hareketi, bir "aranma ve patlama" işlemi ile karakterize edildi; bu işlem, bir statik hücreden filopodinin tekrar tekrar çıkarıldığı ve geri çekildiğini ve bunu takiben kısa bir süre verimli hareket ettiğini gösteriyordu. Görüntüleme dilim bölgeleri yaklaşık her 10 dakikada bir de hücre bölünmesine uğramış tümör hücrelerinin zaman atlamalı görüntülerini kaydetmek için yeterli zamansal çözünürlük sağlamıştır. Bu bölünen hücreler, göçten durakladılar, mitozu tamamladılar ve kızı hücreleri, 3 saatlik bir zaman diliminde tümüyle gecikmeden yeniden başlatıldı ( Şekil 5D ). Aksine, mikroglia, komşu tümör hücrelerinden daha düşük yönlü, daha yüksek ve daha tutarlı bir hızda göç eder,Nispeten verimsiz göçünü göstermektedir ( Şekil 5C, 5E-G ). Bu tür gözlemler, tedaviye hasta veya hücreye spesifik cevapların altında yatan biyolojiyi anlamak için önemli olabilir.

Son olarak, tümör hücrelerinin 16 artan bir şekilde göç potansiyeli olan epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), genomik amplifikasyonunun bir korelasyon da dahil olmak üzere, popülasyon düzeyinde hücre göçü parametreleri gösterilmiştir hastadan hastaya değiştiği için bu protokolü kullanılmıştır. Buna ek olarak, anti-invaziv ilaç olan gefitinib ile tedavi öncesi ve sonrası tümör dilimlerinin zaman-lapse mikroskopisi, EGFR ile amplifiye edilmiş tümör dilimlerine özgü migrasyonda önemli bir düşüş gösterdi 16 .

Şekil 1
Şekil 1: Human GBM Organotipik Dilim Kültürü Enfeksiyonu, Görüntüleme ve Hücre Geçiş Analizi İş Akışı. Tümör dokusu intraoperatif navigasyon ekipmanı vasıtasıyla belli bir bölgeye lokalizedir. Dilimleme sonrası bir hafta, ZsGreen eksprese eden retrovirüs, dilim kültürlerine eklenerek mitotik açıdan aktif tümör hücreleri etiketlenir. Enfeksiyondan 3 gün sonra, konfokal görüntüleme için dilimler hazırlanır. 3D görüntüleme verileri, hücre göç yolu izlemesi, tümör hücresi göç haritalarının oluşturulması ve tümör hücresi göç parametrelerinin hesabı için 2D görüntülere post-işlenir. Bu rakamın bazı bölümleri aslen Parker ve arkadaşları, 2013, 16 yılında yayınlanan ve Oxford University Press izni ile yeniden üretildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.


Şekil 2. İnsan GBM Organotipik Dilimleri Ex Vivo Kültür boyunca Histolojik Özellikleri Korurlar . ( A ) T1 kontrastlı MR görüntü dizileri lokalize etmek ve doku ediniminin bölge (lerini) belgelemek için kullanıldı (ok). ( B ) A'da vurgulanan bölgeden elde edilen dokudan üretilen bir dilim kültüründen kültürün 8. günündeki başlangıç ​​verici dokunun (OR) ve dilimlerin H & E boyaması. ( C ) İn vivo olarak GBM'nin mikro ortamsal patolojik ve hücresel özellikleri muhafaza edilir Dilim kültürü boyunca. (I, II) Düşük (üstte) ve yüksek (alttaki) büyütmede, mikroglia / makrofaj işaretleyicisi olan CD68 için immünohistokimya, 15 günlük kültürden sonra dilimlerde mikroglial kalıcılık sergilemektedir. Dilim kültürünün 4. gününde H & E boyaması, psödopallizasyon nekrozu, bir patoHem düşük (iii) hem de yüksek (iv) büyütmede GBM'nin mantıksal özelliği. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: İnsan GBM dilim kültürleri, hipoksiye tepki olarak VEGF'yi salgılarlar. ( A ) Deney, aynı tümör bölgesinden üretilen 3 benzer boyutlu tümör dilimi içeren bireysel kültür eklerini kullandı. Dilimler normal okside 12 saat süreyle tutuldu, ardından her aralıktan önce yeni medya eklenerek iki 12 saatlik hipoksi aralıkları uygulandı. ( B ) iki temsil edici tümörden üretilen dilim kültürlerinden alınan ELISA ile ölçülen medyaya VEGF sekresyonu (ortalama ± standart sapma),Hipoksiyi normoksiya göre daha düşüktür (p <0.05). ( C ) 4 farklı tümörden alınan dilim kültürlerinin birleştirilmiş analizi, ardışık 12 saatlik hipoksi aralıklarından sonra normoksiya göre VEGF salınımını artırdı (p <0.05). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: Tümör Hücre Yolu İzi Verisi, Hücre Hızının ve Yönünün Nicel Saptanmasına İzin Vermektedir. ( A ) 1 yönlü tümör hücreleri, düz bir vektör boyunca mükemmel verimi temsil ederken, daha düşük yönlü olanlar bu şemada 16 gösterildiği gibi verimsiz kıvrımlı yollarla ilgilidir. Oxford Üniversitesi'nden izin alınmak üzere basıldıBasın. ( B ) Temsil edilen yol izi verisinin analizi ("düşük" çözünürlük ~ 55 dakika hücre izleme aralıkları), hız ve yönelmedeki hücresel değişkenliği göstermektedir. ( C ) Hücre popülasyonu boyunca göç davranışını görselleştirmek için her bir hücre izi için yönelime karşı göç hızı gösterilir (her bir nokta tek bir hücreyi temsil eder). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5: GBM dilim kültürleri içindeki mikroglia, yüksek göç hızı ve tümör hücrelerine göre düşük yönelim ile karakterize edilir. ( A ) Seçici olarak ZsGreen retrovirüsünü ve bir İzoelektin-I ile işaretlenmiş mikroglia eksprese eden tümör hücrelerini çoğaltmak B 4 -647 konjugatı temsili bir dilim kültürünün temsili bir tümör mikro-bölgesi içinde karışmaktadır. ( BC ) Aynı tümör mikro bölgesinde tek tek izlenen GBM ( B ) ve mikroglia ( C ) yolları uyuşmayan göç davranışlarını göstermektedir. Ölçek çubukları = 200 μm. ( D ) Aktif olarak göç eden bir tümör hücresi duraklıyor, süreçlerini geri çekiyor (ok başı), hücre bölünmesine uğruyor ve iki kızı hücresi karşıt yönde (oklar) uzağa göç ediyor. Ölçek çubukları = 50 μm. ( E ve F ) Microglia, aynı bölgedeki tümör hücrelere kıyasla artmış göç hızını (p <0.0001) ve yönelimi azalttığını (p <0.0001) göstermektedir. (G) Hız ve yönsellik temelli tümör ve mikroglial hücrelerin dağılımı, iki hücre popülasyonunun eşsiz göç fenotiplerini gösterir.Et = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan kanser dokusundan alınmış organotipik dilim kültürleri, klinik öncesi translasyonel deneyler için cazip ve az kullanılan bir platform sağlar. Tümör hücrelerinin doğal tümör mikro ortamındaki göç, çoğalma ve hücre ölümüne ilişkin nüfus düzeyindeki davranışlarının anlaşılması eksiktir. Kritik olarak, hücre davranışı seviyesinde dinamik, zamanla çözülmüş biçimde terapiye tümör tepkisinin incelenmesi, yeni tedavi direnci mekanizmalarına ışık tutabilir. İnsan tümör dilimi kültürleri, insan hastalık süreci ile mevcut ex vivo ve in vivo modelleme teknikleri arasında bir bağ oluşturur 19 . Son zamanlarda, EGFR, amplifikasyon ve 16 sinyal ile ilgili hücre göçü davranışı ilk kez ölçülebilir arası tümör varyasyonları için rapor GBM, taşıma incelemek için bir yöntem olarak burada açıklanan tekniği doğrulandı. Bu çalışma aynı zamanda patinin testi için dilim kültür modelini kullandıGBM 16 için olası bir anti-invaziv tedavi olarak, EGFR inhibitörü olan gefitinib'in nt'a spesifik etkililiği.

Doku dilimleme, retroviral enfeksiyon, görüntüleme ve görüntü analizi paradigması sırasında sık görülen tuzaklardan birkaçı yukarıda tartışılmıştır. Bununla birlikte, retroviral enfeksiyon protokolü daha fazla dikkat gerektirmektedir. Hastadan hastaya varyasyon göz önüne alındığında, her dilim içindeki viral olarak işaretlenmiş tümör hücrelerinin yoğunluğunun titrasyonu zorlaşabilir. Yetersiz hücre sayısı viral yapı ile etiketlenmişse, etiketli tümör hücrelerinin istenilen konsantrasyonu elde edilinceye kadar günde her dilimin yüzeyine ilave 5-10 uL'lik retino-ziral süpernatant alikotları ekleyin. Birincil dilim kültürlerinde, çoğalmakta olan hücrelerin yüzdesi genel olarak dönüştürülmüş hücre çizgilerindekinden daha düşük olduğundan herhangi bir zaman noktasında retroviral katılmaya izin verilen hücrelerin alt kümesini sınırlar. Alternatif olarak, çok fazla hücre etiketlenmişse, accHücre migrasyon yollarının sınırlandırılması, daha düşük bir etkili titre edinmek için viral süpernatanın nöronal medya ile seyreltilmesi. Tümörle ilişkili mikroglia, etiketli hücrelerin yaklaşık% 1'lik bir frekansında retrovirüs ifade eden flüoresan proteini dahil etmiştir. Görüntüleme sonrası veri analizleri için bir mikroglia bağlayıcı lektin kullanılarak ayrı analiz için bu hücreleri görsel olarak izole ettik ( Şekil 5 ).

Besin maddesi verme, hücre-hücre etkileşimleri ve ekstrasellüler matriksin özelliklerini içeren tümör mikro ortamı, GBM 20 patogenezinde rol oynar. Doğrudan insan GBM dilim kültürleri, insan tümörü mikro çevresinin yakın bir özetini verirken, küçük hayvan modelleri veya yayılmış hücre kültürü içerisinde geçit verme ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, dilim kültürleri, hücre-hücresi ve hücre-ECM etkileşimlerini korurken, numuneler boyunca besin maddeleri için üniform bir erişim sağlar. Var azaltarakTümörler içinde ortaya çıktığı bilinen besleyicilere hücresel olarak erişen iations, biz, popülasyon düzeyinde tümör hücresi davranışları ( yani göç) arasındaki iç farklılıklara ışık tutan kültürlerde gözlenen farklılıklar önermekteyiz. Bununla birlikte, insan tümörlerinden üretilen dilim kültürlerinde toplanan verilerin yorumlanması, doğal ve inter-tümöral heterojenite nedeniyle karmaşıktır. Kritik olarak, insan tümörü dilim kültürlerinin ex vivo bakımı sırasında ortaya çıkabilecek potansiyel genetik ve epigenetik kaymaları karakterize etmek için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Faz I / II klinik araştırmalara paralel olarak insan tümör dilimi kültürlerinin kullanılması, dilim parametrelerini hasta klinik sonuçlarıyla ilişkilendirmek için umut verici bir stratejidir. Onkolojik terapiyi kişiselleştirmek için dilim kültürleri kullanılmadan önce bu potansiyel prediktif / prognostik parametrelerin doğrulanması gereklidir. Çalışmalarımız ve başkalarının çalışmalarımız, biyolojik belirteç doğrulamasının fizibilitesini göstermektedir <sup sınıfı = "xref"> 21, hem de GBM 9, 16 kesit kültürlerinde terapötik maddelerin hızlı ex vivo testi. Akciğer 22 , kolon 22 , baş ve boyun 23 , göğüs 24 ve prostat kanseri 25 dokuları kullanan benzer insan dilimi kültür teknikleri, bu yaklaşımın insan kanserleri arasında genelleştirilebileceğini önermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

Burada açıklanan dil kültürü konfokal görüntüleme protokolüne teknik uzmanlıkları ve katkıları için Dr. Lee Niswander ve Dr. Rada Massarwa'ya teşekkür etmek istiyoruz. Dr. Kalen Dionne, beyin tümörü doku dilimleme ve kültür parametrelerinin optimize edilmesine ilişkin uzmanlık sağlayan ek teşekkürler sayesinde teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose  Invitrogen (Gibco) 11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red Invitrogen (Gibco) 12349-015
B-27 Supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15140-122
GlutaMAX Supplement Invitrogen (Gibco) 35050-061
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
HEPES (1 M) Invitrogen (Gibco) 15630-080
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638-20ML 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen (Gibco) 16520-050 Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher (Molecular Probes) I32450 Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector Clonetech 632520
Retro-X Concentrator  Clonetech 31455 Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector Clonetech 631530 part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells Clonetech 631530 part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) Sigma-Aldrich Z105899 Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) Polysciences, Inc. 18646A-1 Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas Fisher Scientific S50823 Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher Scientific  08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) Fisher Scientific 17-989-001 Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome Leica Biosystems VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert  EMD Millipore PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes  MatTek P35G-1.5-20-C Sleeve 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm
LSM 510 Confocal Micoscope Zeiss LSM 510 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator PeCON Germany (Discontinued) Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
  2. Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
  3. Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
  4. Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
  5. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
  6. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
  7. Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
  8. Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
  9. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
  10. Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
  11. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
  12. Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
  13. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
  14. Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
  15. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
  16. Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
  17. Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
  18. Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
  19. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  20. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
  21. Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
  22. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 8352-8356 (2010).
  23. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
  24. Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
  25. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics