पूरा पर्वत विच्छेदन और वयस्क माउस कोक्लीअ के immunofluorescence

1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

हम तीन बरकरार कर्णावत बदल जाता है (एपेक्स, मध्य, और आधार) के रूप में कोर्टी वयस्क अंग को अलग-थलग करने के लिए एक तरीका मौजूद है। हम यह भी fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ immunostaining के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन। एक साथ इन तकनीकों कोक्लीअ में पाया बालों की कोशिकाओं, समर्थन कोशिकाओं, और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561, doi:10.3791/53561 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

लौकिक हड्डी के भीतर निहित भीतरी कान की सर्पिल के आकार कोक्लीअ, कोर्टी, स्तनधारियों में श्रवण संवेदी अंत अंग का अंग घरों। कोक्लीअ tonotopically का आयोजन किया है और आमतौर पर शिखर, मध्य में बांटा गया है, और बेसल सुप्रीम 1 में आधार और कम आवृत्ति का पता लगाने में उच्च आवृत्ति ध्वनि पता लगाने के साथ अलग आवृत्ति क्षेत्रों के लिए इसी बदल जाता है। बालों की कोशिकाओं, Corti के अंग के mechanosensory कोशिकाओं, चूहों 2,3 में लगभग 6 मिमी लंबी है जो कोक्लीअ की लंबाई चलाते हैं। इन कोशिकाओं को केंद्रीय श्रवण संरचनाओं द्वारा कार्रवाई की जाती है कि तंत्रिका संकेतों में, तरल पदार्थ से भरे झिल्लीदार भूलभुलैया के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं, जो ध्वनि तरंगों के यांत्रिक ऊर्जा में परिवर्तित। यहाँ वर्णित तकनीक (उम्र के एक सप्ताह से वयस्कता को लेकर नमूने के लिए) कोक्लीअ का कड़ा हो जाना के बाद Corti के अंग के पूरे आरोह को तैयार करने के लिए एक विधि के पूरा हो गया है प्रदान करता है। हम यह भी immunosta के लिए एक तरीका मौजूद हैपूरे ining कर्णावत ऊतक मुहिम शुरू की। कर्णावत पूरे mounts सभी बाल कोशिकाओं के दृश्य और उनके प्राकृतिक स्थानिक व्यवस्था में समर्थन कोशिकाओं के आसपास के लिए महत्वपूर्ण हैं और confocal माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ तीन आयामों में विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं।

डीआरएस। हंस Engstrom और हार्लो Ades मूल रूप से वे तेजी से सूक्ष्म विश्लेषण 4 के लिए Corti के अंग से कम बरकरार खंडों संरक्षण, ठीक करने और स्तनधारियों की एक किस्म से तरल में डूबे हुए calcified cochleae काटना करने के लिए एक तकनीक विस्तृत 1966 में एक पूरे माउंट कर्णावत विच्छेदन विधि का वर्णन किया। एक unfixed, calcified चूहे कोक्लीअ के विच्छेदन भी एक अनुदेशात्मक वीडियो 5 में सचित्र कर दिया गया है। डीआरएस। बारबरा Bohne और वाशिंगटन विश्वविद्यालय के गैरी हार्डिंग इस विधि के लिए कई महत्वपूर्ण संशोधन किए गए। कर्णावत पूरे माउंट विधि के अपने संस्करण में, लौकिक हड्डी, decalcified था प्लास्टिक में एम्बेडेड, और पांच आधा बदल जाता है या दस क्वार्टर बदल जाता है dissec थेटेड 6.7। कि प्लास्टिक एम्बेडिंग 8 की आवश्यकता नहीं थी इसलिए डॉ चार्ल्स Liberman और Eaton पीबॉडी प्रयोगशालाओं, मैसाचुसेट्स आँख और कान दुर्बलता में सहयोगियों, इस तकनीक को संशोधित। तकनीक के आगे संशोधन यहाँ प्रस्तुत विच्छेदन विधि सूचित जो सेंट जूड बच्चों अनुसंधान अस्पताल 9-12 पर डॉ जियान Zuo की लैब में हुई। हम पूरा शिखर, मध्य, और बेसल बदल जाता है की अलगाव की अनुमति देता है जो Bohne और Liberman से कोर्टी के अंग के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए एक अलग रणनीति का उपयोग करें। इस प्रकार विच्छेदित ऊतक बड़ा और विच्छेदन या immunostaining प्रक्रिया के दौरान खो दिया है या क्षतिग्रस्त होने की संभावना कम होती है। इसके अलावा, मौजूदा विधि शिखर टिप या एक आवृत्ति क्षेत्र की पहचान करने के लिए बेसल हुक से दूरी की माप की सुविधा।

कई प्रयोगशालाओं कर्णावत ऊतक के immunostaining प्रदर्शन हालांकि इस विधि शुरु हुआ है, जहां यह स्पष्ट नहीं है। नतीजतन buffe रोकने के लिए विभिन्न व्यंजनों देखते हैंरुपये और व्यक्तिगत प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है कि एंटीबॉडी ऊष्मायन बफ़र्स। यहाँ, हम श्रवण क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए लागू है कि fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ immunostaining के लिए एक तरीका मौजूद है।

कोक्लीअ के जटिल आकार, Corti के अंग के नाजुक संरचना, और बोनी झालर ऊतकीय और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक चुनौती प्रदान करते हैं। तकनीक की एक किस्म वर्तमान में इन कठिन सुविधाओं से जूझना पड़ा और कोर्टी, अपने फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक तकनीक के अंग के भीतर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए सुनवाई के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मामूली संशोधन के साथ, संभावित क्षेत्र में इस्तेमाल अन्य मॉडल जीवों की विविधता से cochleae भीतर महत्वपूर्ण संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वयस्क माउस कोक्लीअ के पूरे माउंट विच्छेदन के लिए अनुमति देता है और।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं मेडिसिन के दक्षिणी इलिनोइस विश्वविद्यालय के स्कूल में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

लौकिक हड्डियों के 1. निष्कर्षण

  1. माउस खोपड़ी 13 के आधार में लौकिक हड्डियों को पहचानें और मानक पैटर्न संदंश का उपयोग कपाल नसों दूर परिमार्जन।
  2. समझाया कोक्लीअ बेदखल करने के लिए कान का कैप्सूल की नोक पर और नीचे पीछे अर्धवृत्ताकार नहर पर सामने हाथ प्रेस के अंगूठे के साथ मानक पैटर्न संदंश रखें।
  3. मैन्युअल अंगूठे और तर्जनी के साथ या 10.5 सेमी ठीक कैंची का उपयोग करके खोपड़ी से लौकिक हड्डी के नीचे आधा मुक्त।

2. लौकिक हड्डियों पोस्ट तय

  1. 10 मिमी फॉस्फेट बफर खारा में पतला 500 μl 4% paraformaldehyde (पीएफए) (पीबीएस) 7.4 पीएच और incub - 250 युक्त 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में लौकिक हड्डियों की जगह20 घंटा - 2 के लिए आरटी पर खा लिया।
    नोट: गोल या अंडाकार खिड़की में पीएफए ​​के शिखर टोपी या इंजेक्शन की कोई उद्घाटन की जरूरत है। कांच की शीशियों में एक 16% एकाग्रता में खरीदा जा सकता है कि मेथनॉल मुक्त, अति शुद्ध, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रेड पीएफए ​​का उपयोग करना चाहिये। एक शीशी खोली और एक पतला हो जाने के बाद एक 4:% समाधान कर रही है, पीबीएस में 4 (कुछ एंटीबॉडी को बर्दाश्त कर सकते हैं लघु निर्धारण और दूसरों की आवश्यकता 4 सी में जमा हो जाती है, जब वह अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हे ​​/ एन (हे / एन) नियतन)।

3. अम्लो व्दारा कैल्सियम लौकिक हड्डियों

  1. निर्धारण के बाद, एक विंदुक का उपयोग पीएफए ​​हटाने और 120 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), थोड़ा अधिक से अधिक 2 मिलीलीटर के साथ बदलें। ट्यूब बंद होने पर हवा के बुलबुले को रोकने के लिए पूरे 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को भरने के लिए सुनिश्चित करें।
    1. तुरंत विकैल्सीभवन यदि नहीं, तो 4 सी पर 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 और दुकान के नमूनों के साथ पीएफए ​​की जगह
      नोट: निर्धारण के बाद, लौकिक हड्डियों variab के लिए भंडारित किया जा सकताLe एंटीजन के आधार पर विकैल्सीकरण जांच की जा रही है समय से पहले के बराबर है।
  2. अंत ओवर के अंत रोटेटर पर प्लेस ट्यूब और आरटी पर 4 rpm पर बारी बारी से। एक विंदुक का उपयोग दैनिक EDTA समाधान बदलें। विकैल्सीकरण की लंबाई के नमूने की उम्र और विच्छेदन कर रही वैज्ञानिक की पसंद पर निर्भर करता है।
    1. ऊष्मायन समय के लिए निम्न दिशानिर्देशों का उपयोग EDTA में लौकिक हड्डियों सेते हैं:
      8 P15 के लिए नमूने प्रसव के बाद दिन (पी) के लिए: 2-4 घंटा; P21 के लिए नमूने P15 के लिए: हे / एन; P30 के लिए नमूने P21 के लिए: 2 हे / एन; 3 या अधिक हे / एन: P30 से अधिक उम्र के नमूने लिए।
      नोट: विकैल्सीकरण बार उपयोगकर्ताओं को 'वरीयता के अधीन हैं और जरूरत के रूप में बढ़ाया जा सकता है। विकैल्सीकरण समय के बारे में 8 घंटे के अलावा, एक दिन में दो बार EDTA समाधान बदलकर कम किया जा सकता है। प्रदूषण को रोकने के लिए अब से 3 दिनों के लिए विकैल्सीभवन जब कुछ प्रयोगशालाओं EDTA समाधान करने के लिए 1% पीएफए ​​जोड़ें।
  3. नमूना पर्याप्त रूप से decalcified जाता है तो ओ लौकिक हड्डियों जगह निर्धारित करने के लिएना सिलिकॉन विच्छेदन पकवान इलास्टोमेर में लिपटे और धीरे घोंघा के आकार कोक्लीअ पर संदंश दबाएँ। ऊतक spongey है, तो विकैल्सीकरण पूरा हो गया है।
  4. विकैल्सीकरण पूरा हो गया है एक बार, एक पिपेट का उपयोग EDTA हटाने और 10 मिमी पीबीएस 7.4 पीएच के 500 -1000 μl जोड़ें। तैयार है जब तक 4 सी पर स्टोर नमूने टुकड़े करना।

4. सिलिकॉन elastomer लेपित विच्छेदन डिश बनाएं

  1. आधार और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सिलिकॉन elastomer encapsulant किट का इलाज एजेंट का मिश्रण है और अच्छी तरह मिक्स।
  2. समाधान काला है जब तक पाउडर लकड़ी का कोयला के 3 बड़े चम्मच और मिश्रण अच्छी तरह से - लगभग 2 जोड़ें।
    नोट: तरल स्याही या तरल लकड़ी का कोयला समाधान के साथ मिश्रण नहीं होगा और नहीं किया जा सकता। सिलिकॉन elastomer encapsulant किट 4.2 कदम लोप होने की अनुमति देता है, काले रंग में खरीदा जा सकता है।
  3. कोट करने के लिए पर्याप्त नीचे भरने, 60 मिमी कांच या प्लास्टिक पेट्री डिश में समाधान डालो। बू हैंbbles मौजूद हैं, सतह पर हवा के साथ कश। स्थापित करने के लिए आरटी पर कम से कम 24 घंटा खड़े हैं।
    नोट: सिलिकॉन elastomer लेपित व्यंजन साल के लिए बार-बार इस्तेमाल किया जा सकता है। इस सिलिकॉन elastomer दरार करने के लिए कारण होगा लेकिन, जैसा कि सफाई के लिए इथेनॉल का उपयोग नहीं करते।

(P7 और पुराने नमूने के लिए) कोक्लीअ 5. पूरा पर्वत विच्छेदन

  1. मध्य / शिखर बदल जाता है से बेसल बारी अलग करें
    1. 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 से दो-तिहाई पूरा भरा एक सिलिकॉन elastomer लेपित विच्छेदन डिश में एक decalcified लौकिक हड्डी की जगह और निम्न चरणों के लिए एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    2. # 4 या 5 # सीधे जौहरी संदंश और 5 मिमी Vannas-Tubingen वसंत कैंची का उपयोग के साथ vestibular क्षेत्र में अस्थायी हड्डी पकड़ो, पक्षों के साथ और सुप्रीम ऊपर अतिरिक्त कान का कैप्सूल ऊतक दूर काटा।
    3. 2.5 मिमी Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, अंडाकार खिड़की में एक ब्लेड डालने और सर्पिल बंधन / पार्श्व के साथ कई छोटे कटौती करबेसल बारी की दीवार।
    4. 5 मिमी Vannas-Tubingen वसंत कैंची का प्रयोग, बस कट क्षेत्र में एक ब्लेड डालने और लौकिक हड्डी बाहर पर अन्य ब्लेड जगह है, अंडाकार खिड़की को औसत दर्जे का। इस कटौती के मध्य और शिखर बदल जाता है से बेसल बारी अलग करती है।
  2. बेसल बारी का पूरा विच्छेदन।
    1. 2.5 मिमी Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, बेसल बारी में तनाव जारी है और vestibular अंगों से अलग करने के लिए बेसल बारी नीचे में कटौती करने के modiolus से कनेक्ट कि सर्पिल नाड़ीग्रन्थि तंत्रिका तंतुओं में कटौती।
    2. 2.5 मिमी Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, Corti के अंग के ऊपर और नीचे दोनों से सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार को दूर करने के लिए छोटे कटौती की एक श्रृंखला बनाते हैं। ऊतक मार्गदर्शन करने के लिए # 4 या 5 # सीधे जौहरी संदंश का प्रयोग करें। सिलिकॉन elastomer लेपित विच्छेदन डिश के लिए सर्पिल नाड़ीग्रन्थि तंत्रिका तंतुओं पिन, लेकिन ऊतक आंसू जाएगा के रूप में इस क्षेत्र पर पकड़ नहीं है।
    3. पिछले चरणों, रेइस्स्नेर के membran से कुछ के दौरानई अक्सर हटा दिया जाएगा। किसी भी अभी भी बनी हुई है, तो # 4 या 5 # सीधे जौहरी संदंश के साथ रेइस्स्नेर झिल्ली समझ और Corti के अंग से दूर खींच।
      नोट: tectorial झिल्ली शायद ही दिखाई दे रहा है और आम तौर पर हटाने के लिए एक विशिष्ट कदम की आवश्यकता के बिना दूर तैरता है।
    4. अंत में करने के लिए संभव के रूप में फ्लैट बारी बनाने और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि के शेष एक्सोन लोभी द्वारा, विच्छेदित बेसल बारी हस्तांतरण करने के लिए # 4 या 5 # सीधे जौहरी संदंश का उपयोग करने के लिए, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि axons की मोटाई कम करने के लिए कई कटौती करने एक 48 अच्छी तरह से थाली (या चैम्बर स्लाइड) 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 से ~ 500 μl युक्त।
  3. अलग मध्यम और शिखर बदल जाता है
    1. कोक्लीअ, नीचे शिखर की ओर से शेष दो तिहाई रखें।
    2. 2.5 मिमी Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, इस्तेमाल बीच बारी बेसल बारी से जुड़े होने की जहां स्केला मीडिया में एक ब्लेड डालें, और वीं की सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार के साथ कई छोटे कटौती करई बीच बारी।
    3. 5 मिमी Vannas-Tubingen वसंत कैंची का प्रयोग, सिर्फ ब्लेड के शीर्ष पर रखा बीच बारी के साथ कटौती क्षेत्र में एक ब्लेड डालें, और शिखर सिरे से एक 90 के कोण पर, बोनी भूलभुलैया के बाहर पर अन्य ब्लेड जगह है। इस शिखर बारी से बीच बारी अलग करती है।
  4. बेसल बारी करने के लिए एक समान तरीके से बीच बारी का पूरा विच्छेदन (5.2.4 के लिए कदम 5.2.2 देखें)।
  5. शिखर बारी का पूरा विच्छेदन।
    1. 2.5 मिमी Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, शिखर बारी को शामिल किया गया है कि टोपी खुला। बेसल बारी करने के लिए एक समान तरीके से पूरा विच्छेदन (5.2.4 के लिए कदम 5.2.2 देखें)।
      नोट: विच्छेदित कर्णावत बदल जाता है immunostaining से पहले कई हफ्तों के लिए 4 सी में एक 48 अच्छी तरह से थाली (या चैम्बर स्लाइड) में 10 मिमी पीबीएस 7.4 पीएच में संग्रहित किया जा सकता है। पर बैक्टीरियल या फंगल विकास में परिणाम कर सकते हैं 3 सप्ताह - हालांकि पीबीएस अब 2 से लुप्त हो जाना और समय समय पर मंगाया जाने की जरूरत है और भंडारण होगाछवि की गुणवत्ता में कमी कर सकते हैं जो ऊतकों। हम undissected लौकिक हड्डियों के रूप में नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण सलाह देते हैं।

Fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ 6. Immunostaining

  1. विच्छेदन के बाद, 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 से ~ 500 μl में डूबे हुए एक 48 अच्छी तरह से थाली (या चैम्बर स्लाइड) में एक अलग अच्छी तरह से प्रत्येक कर्णावत बारी, दुकान। निम्न चरणों में से प्रत्येक के लिए कर्णावत बारी, तरल में डूब जाना चाहिए शीर्ष पर चल नहीं या अच्छी तरह से की ओर करने के लिए अटक गया।
    नोट: अच्छी तरह से प्रत्येक से तरल पदार्थ को हटाने, जब वह कर्णावत बदल जाता है खो देते हैं या विंदुक टिप में इसे चूसना करने के लिए आसान है। एक विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग कर एक 200 μl विंदुक टिप के साथ समाधान बदलने इसे रोकने में मदद मिलेगी।
  2. एक विंदुक का प्रयोग, प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस हटाने और जगह ~ 200 के साथ - / अवरुद्ध permeabilization समाधान (प्रति अच्छी तरह से 300 μl 1% ट्राइटन X-100, 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), और 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) 10 मिमी पीबीएस पी में पतलाएच 7.4)। एक 3 डी रोटेटर पर आरटी पर 1 घंटे सेते हैं।
    नोट: इस्तेमाल किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी एक बकरी की मेजबानी में बनाया गया था, तो एक माध्यमिक विरोधी बकरी एंटीबॉडी की जरूरत होगी और NGS के किसी भी कदम के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सामान्य घोड़े सीरम NGS के लिए एक स्थानापन्न के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. एक विंदुक का उपयोग अवरुद्ध / permeabilization समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के प्रति अच्छी तरह से ~ 100 μl के साथ की जगह (0.1% ट्राइटन X-100, 10 मिमी पीबीएस 7.4 पीएच में पतला 1% बीएसए, और 5% NGS)। प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने कारक भिन्न होता है। एक 3 डी रोटेटर पर 4 सी में हे / एन (कम से कम 14 घंटा) सेते हैं।
    नोट: एक से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है, तो सब सिर्फ प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी एक अलग मेजबान है कि यह सुनिश्चित करना, ऊष्मायन के लिए एक ही समाधान में जोड़ा जा सकता है।
  4. एक विंदुक का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और अच्छी तरह से प्रति ~ 500 μl में 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 से 3 washes प्रदर्शन करते हैं। प्रत्येक धोने के लिए एक 3 डी रोटेटर पर आरटी पर 5 मिनट की एक न्यूनतम incubates।
  5. पिछले पी हटायेबी एस एक विंदुक का उपयोग और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के प्रति अच्छी तरह से 100 ~ साथ μl की जगह धोने (0.1% ट्राइटन X-100, 10 मिमी पीबीएस 7.4 पीएच में पतला 1% बीएसए, और 5% NGS)। 500 या 1: 1000 प्रत्येक के लिए कमजोर पड़ने कारक fluorescently माध्यमिक एंटीबॉडी आम तौर पर 1 है चिह्नित। Fluorescently रक्षा प्रकाश से माध्यमिक एंटीबॉडी टैग किया करने के लिए एक ब्लैक बॉक्स में 48 अच्छी तरह से थाली रखें। एक 3 डी रोटेटर पर आरटी पर 3 घंटा - 2 सेते हैं।
    नोट: एक से अधिक माध्यमिक एंटीबॉडी की जरूरत है, वे ऊष्मायन के लिए एक ही समाधान में जोड़ा जा सकता है। पार लेबलिंग की कोई संभावना नहीं है सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए।, बकरी विरोधी खरगोश और चिकन विरोधी बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग)
  6. एक विंदुक का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और अच्छी तरह से प्रति ~ 500 μl में 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 से 3 washes प्रदर्शन करते हैं। एक 3 डी रोटेटर पर आरटी पर 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए प्रत्येक धोने सेते हैं। प्रकाश से बचाने के लिए एक ब्लैक बॉक्स में 48 अच्छी तरह से थाली रखें।
  7. एक विंदुक का उपयोग पिछले पीबीएस धोने निकालें और Hoec के प्रति अच्छी तरह ~ 100 μl के साथ की जगहनाभिक लेबल करने के लिए: HST 33342 (10 मिमी पीबीएस 7.4 पीएच में 2,000 1 पतला)। एक 3 डी रोटेटर पर आरटी पर 20 मिनट - 15 सेते हैं। प्रकाश से बचाने के लिए एक ब्लैक बॉक्स में 48 अच्छी तरह से थाली रखें। अब से 20 मिनट सेते हैं क्या नहीं।
  8. एक विंदुक का उपयोग Hoechst समाधान निकालें और अच्छी तरह से प्रति ~ 500 μl में 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 से 3 washes प्रदर्शन करते हैं। एक 3 डी रोटेटर पर आरटी पर 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए प्रत्येक धोने सेते हैं। प्रकाश से बचाने के लिए एक ब्लैक बॉक्स में 48 अच्छी तरह से थाली रखें।
  9. यदि आवश्यक हो तो सभी कदम कई घंटे तक, Hoechst ऊष्मायन छोड़कर बढ़ाया जा सकता है। किसी भी स्तर पर प्रतिक्रिया को थामने के लिए, बस 10mM पीबीएस pH7.4 की ~ 500 उल में नमूने डूब और प्रोटोकॉल घंटे या 1 को फिर से शुरू करने के लिए तैयार है जब तक 4 सी में 48 -अच्छी प्लेट (या चैम्बर स्लाइड) की दुकान - 2 दिन बाद ।

7. माउंट कर्णावत स्लाइड्स पर वर्षगांठ

  1. लेबल इस्तेमाल नमूना और एंटीबॉडी के बारे में उचित जानकारी के साथ स्लाइड।
  2. पिपेट बढ़ते मीडिया की ~ 50 μl प्रत्येक स्लाइड पर और सावधान रहना होगाबुलबुले को रोकने के लिए। किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए बढ़ते मीडिया युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  3. # 4 या 5 # सीधे जौहरी संदंश का प्रयोग, धीरे बढ़ते मीडिया में स्लाइड और जगह के लिए 48 अच्छी तरह से थाली से एक कर्णावत बारी हस्तांतरण करने के लिए सर्पिल नाड़ीग्रन्थि की एक्सोन समझ। स्लाइड प्रति माउंट एक कर्णावत बारी इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान प्रकाश जोखिम और photobleaching रोकने के लिए।
  4. कर्णावत बारी, मुड़ा मुड़, या एक हवाई बुलबुले के पास नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इन शर्तों के किसी भी पाए जाते हैं, तो उपयोग # 4 या 5 # सीधे जौहरी संदंश कर्णावत बारी स्थान बदलने के लिए।
  5. स्लाइड पर एक coverslip के एक छोर प्लेस और धीरे coverslip के गिर जाने के लिए जारी।
  6. कर्णावत बारी, मुड़ा मुड़, या एक हवाई बुलबुले के पास नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इन शर्तों के किसी भी पाए जाते हैं, तो धीरे कर्णावत बारी स्थान बदलने के लिए आगे और पीछे coverslip के लिए कदम।
  7. प्लेस स्लाइडइतना है कि एक स्लाइड फ़ोल्डर में वे फ्लैट करना। बढ़ते चलो मीडिया इलाज हे / आरटी पर एन (अंधेरे में रखने के लिए)
  8. स्पष्ट नेल पॉलिश और दुकान आरटी पर या -20 सी के साथ सील coverslips तक imaged। स्लाइड एक स्लाइड फ़ोल्डर या स्लाइड बॉक्स में संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: स्लाइड्स -20 सी या -80 सी और प्रतिदीप्ति पर लंबी अवधि संग्रहित किया जा सकता कई महीनों के लिए रखा जाएगा।
  9. Immunostaining प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग छवि स्लाइड। चमक और विपरीत समायोजन कोंफोकल विक्रेता द्वारा प्रदान की इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम तीन बरकरार कर्णावत बदल जाता है (एपेक्स, मध्य, और आधार) चित्रा 1 में प्रस्तुत कुंजी विच्छेदन कदम के साथ, calcified है कि कर्णावत के ऊतकों से ही Corti के अंग को अलग-थलग करने के लिए एक तरीका मौजूद है। विकास के पहले प्रसव के बाद सप्ताह के दौरान कड़ा हो जाना माउस कोक्लीअ अधूरा है और एक और अधिक सरल विच्छेदन विधि 13 में इस्तेमाल किया जा सकता है। Corti के अंग के P7 से कोक्लीअ और आँसू में बड़े चूहों के परिणाम और कतरन के साथ नवजात पूरे माउंट विच्छेदन विधि का उपयोग करना। सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार अब और अधिक मजबूती से जुड़ा हुआ है और क्षति के कारण के बिना दूर संवेदी उपकला से खुली नहीं किया जा सकता। इस प्रकार 'वयस्क' पूरे माउंट विच्छेदन विधि पी 6 से अधिक उम्र के नमूने के लिए की जरूरत है। हम विच्छेदित और बाल सेल और समर्थन सेल मार्कर (चित्रा 2) के साथ immunostained किया गया है कि एक P15 माउस कोक्लीअ के बीच बारी का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं। ऑप्टिकल पार वर्गों गएक भी पूरे माउंट तकनीक (चित्रा 3) के साथ प्राप्त किया।

कई समस्याओं पूरे माउंट विच्छेदन के दौरान उत्पन्न होती है या कर्णावत बढ़ते जब स्लाइड्स पर बदल जाता है सकते हैं। सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार को हटाने के दौरान बहुत अधिक या पर्याप्त नहीं काटने के बीच एक संकीर्ण खिड़की नहीं है। बाहरी बालों की कोशिकाओं की अंतिम पंक्ति के बगल में पाए जाते हैं कि कटौती विविध कोणों (चित्रा 4 ए) पर माउंट करने के लिए इस अंतिम पंक्ति में बालों की कोशिकाओं का कारण बन सकता है। बहुत बड़ी हैं कि कटौती कोर्टी (चित्रा 4 बी) के अंग के वर्गों को दूर कर सकते हैं। संदंश के साथ नमूना हैंडलिंग बहुत ख्याल रखता है और अक्सर संदंश खो गया है, जहां Corti के अंग (चित्रा 4C) में छेद कर रहे हैं। कर्णावत बदल जाता बढ़ते अंत में, जब Corti के अंग छवि (चित्रा 4D) obscures जो गुना कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा प्रोटोकॉल कदम 5.1.4 के बाद "वयस्क" के पूरा पर्वत विच्छेदन माउस कोक्लीअ। (ए) में 1. महत्वपूर्ण कदम, कोक्लीअ के बेसल बारी मध्य / शिखर बदल जाता है से अलग कर दिया, फिर भी अभी भी vestibular क्षेत्र से जुड़ा हुआ है। प्रोटोकॉल कदम 5.3.3, मध्य बारी शिखर बारी से अलग हो जाने के बाद (बी)। सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार निकाल दिया जाता है, जहां एक मध्यम बारी का पूरा विच्छेदन (सी) उदाहरण। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।

चित्र 2
मध्य 2. Confocal टुकड़ा छवि चित्राएक P15 माउस से पृथक कर दें। चार 20x छवियों पूरे बीच बारी के पुनर्निर्माण के लिए मढ़ा जाता है। (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) (मैजेंटा) एक गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयुक्त: (200 कमजोर पड़ने 1) बाल कोशिकाओं प्राथमिक एंटीबॉडी VIIa एक खरगोश विरोधी मायोसिन के साथ लेबल रहे हैं। (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) (हरा) एक गधा विरोधी बकरी एलेक्सा 568 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयुक्त: (500 कमजोर पड़ने 1) समर्थन कोशिकाओं एक बकरी विरोधी Sox2 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं। Hoechst (नीला) सभी नाभिक लेबल। छवि 405, 488, और 555 तरंग दैर्ध्य के साथ एक जीस एल एस एम 700 confocal खुर्दबीन का उपयोग कर लिया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
मध्य चित्रा 3. ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन पृथक मुड़ें एक 6 सप्ताह पुराने माउस से। (ए) xz विमान (ऊपर) में पूरे माउंट तैयारी (नीचे) और ऑप्टिकल पार अनुभाग के confocal टुकड़ा छवि। (बी) (ए) में शीर्ष पैनल की बढ़ाई बढ़ने से हटा दिया, क्रॉसहेयर साथ। (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) (मैजेंटा) एक गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा 647 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयुक्त: (200 कमजोर पड़ने 1) बाल कोशिकाओं प्राथमिक एंटीबॉडी VIIa एक खरगोश विरोधी मायोसिन के साथ लेबल रहे हैं। (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) (हरा) एक गधा विरोधी बकरी एलेक्सा 568 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयुक्त: (500 कमजोर पड़ने 1) समर्थन कोशिकाओं एक बकरी विरोधी Sox2 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं। छवि 405, 555, और 647 तरंग दैर्ध्य के साथ एक जीस एल एस एम 700 confocal खुर्दबीन का उपयोग कर लिया गया था। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
पूरा पर्वत विच्छेदन के दौरान उत्पन्न होती है या कर्णावत बढ़ते जब स्लाइड्स पर वर्षगांठ कर सकते हैं कि आंकड़ा समस्याओं 4. उदाहरण हैं। (ए) छवि के बाईं ओर, कर्णावत ऊतक के कई कारण अगले बाहरी बालों की कोशिकाओं की अंतिम पंक्ति को काट दिया गया इन कोशिकाओं को अलग अलग कोणों पर मुहिम शुरू की जाए। (बी) के छवि के बाईं ओर Corti के अंग का एक वर्ग कट गया है। (सी) के बीच में बाहरी बाल सेल क्षेत्र में मुक्का मारा एक छेद है छवि। (डी), Corti के अंग कई स्थानों में जोड़ रहा है। 8 सप्ताह पुरानी माउस cochleae - छवियाँ 4 से ले जाया गया। बालों की कोशिकाओं प्राथमिक एंटीबॉडी VIIa एक खरगोश विरोधी मायोसिन के साथ चिह्नित कर रहे हैं (1: 200 कमजोर पड़ने) एक बकरी विरोधी खरगोश के साथ संयुक्त एलेक्सा 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 1,000 कमजोर पड़ने) या एक गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 1,000 कमजोर पड़ने) (मैजेंटा)। सी बाहरी बाल सेल में(: 1,000 कमजोर पड़ने 1) (हरा) एक गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा 568 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयुक्त: (200 कमजोर पड़ने 1) LS एक बकरी विरोधी prestin प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं। छवियाँ, 405 से 488, और 555 एनएम तरंग दैर्ध्य एक Leica SP5 confocal खुर्दबीन का उपयोग कर लिया गया था। स्केल सलाखों: एबी में = 20 माइक्रोन; सीडी में = 40 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सफल पूरे माउंट विच्छेदन और immunostaining के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इन विधियों का भी प्रदर्शन कर रहे हैं हालांकि इससे पहले, कर्णावत ऊतक के उचित निर्धारण की जरूरत है। हम मेथनॉल मुक्त, अति शुद्ध, ईएम ग्रेड पीएफए ​​का उपयोग करना चाहिये। पीएफए ​​मेथनॉल और immunofluorescence की गुणवत्ता कम हो जाती है, जो एक अस्थिर पीएच के निशान हो सकता है पाउडर से बनाया है। अन्य समूहों को भी इसी तरह के विच्छेदन फॉर्मेल्डीहाइड 14-16 शामिल नहीं है कि संभव का उपयोग कर fixatives हैं कि पता चला है। निर्धारण की लंबाई भी महत्वपूर्ण है और एंटीबॉडी विशिष्ट है। दूसरों पीएफए ​​में सिर्फ 1 घंटा के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं, जबकि कुछ एंटीबॉडी (हालांकि यह दुर्लभ है), एक हे / एन निर्धारण बर्दाश्त कर सकते हैं। ऊतक बिखर जाता है के रूप में अंडर तय ऊतक विच्छेदन विधि के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है। हमारे अनुभव में एक 3 - 4 घंटा निर्धारण पर्याप्त निर्धारण प्रदान करता है और आमतौर पर सुनवाई के क्षेत्र में इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी के बहुमत के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है।

"jove_content> यह EDTA के प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि यह भी संभव है;। इस प्रकार कुछ एंटीबॉडी नवजात ऊतक में अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन नहीं P7 या निर्धारण के बाद decalcified था कि पुराने ऊतक में होगा, लौकिक हड्डियों समय की चर मात्रा से पहले के लिए भंडारित किया जा सकता कुछ एंटीजन निर्धारण के बाद सप्ताह के दिनों के भीतर विकैल्सीकरण और विच्छेदन की आवश्यकता होती है। दूसरों (विकैल्सीकरण पहले या बाद में या तो) साल के लिए भंडारित किया जा सकता है, जबकि एंटीजन के आधार पर विकैल्सीकरण immunostaining की गुणवत्ता में कमी के बिना, जांच की जा रही है। हम लौकिक हड्डियों के रूप में भंडारण के नमूनों की सिफारिश कारण कवक या बैक्टीरिया के साथ 48 अच्छी तरह से थाली और संभावित संक्रमण से भंडारण मीडिया (पीबीएस) के वाष्पीकरण के जोखिम के लिए। हम आम तौर पर immunostaining के लिए अग्रिम में पूरे माउंट विच्छेदन कम से कम एक सप्ताह से प्रदर्शन करते हैं।

एक बार तय की और decalcified, पूरे माउंट विच्छेदन तरल में डूबे हुए अस्थायी हड्डी के साथ किया जाता है। अतिरिक्त हड्डी और नरम निकाल रहा हैविच्छेदन में जल्दी भूलभुलैया आसपास के ऊतकों के ऊतकों के हेरफेर की सुविधा और महत्वपूर्ण संरचनाओं की एक कम छिप दृश्य प्रदान करके बाद के चरणों में सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार को हटाने में सहायता करेगा। पहले कुछ कदम प्रदर्शन करते हैं, संदंश vestibular क्षेत्र में ऊतक धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि बारी-बारी से अलग कर रहे हैं, एक बार यह कोर्टी या सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार के अंग पर संदंश रखने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके बजाय, संदंश बंद रखना और सिलिकॉन elastomer लेपित विच्छेदन डिश के लिए सर्पिल नाड़ीग्रन्थि तंत्रिका तंतुओं पिन। ऊतक आंसू जाएगा के रूप में इस क्षेत्र पर पकड़ नहीं है। सामान्य तौर पर, एक बार ऊतक लोभी, तीन जाता है में विभाजित किया गया है और खींच युद्धाभ्यास अक्सर Corti के अंग के लिए हानिकारक हैं और बचा जाना चाहिए जो अप्रत्याशित परिणाम पैदा कर सकता है। छोटे जानवरों (P7-P21) से ऊतक P21 से अधिक उम्र के जानवरों से ऊतकों की तुलना में अधिक क्षमा हो जाता है। बाल सेल डी के साथ इसके अलावा, कर्णावत नमूनेकाटना करने के लिए और अधिक कठिन Amage हैं। माउस शोर जोखिम मिला हो तो ऊतक विशेष रूप से नाजुक है। भले ही ऊतक के राज्य की, हम वर्तमान विच्छेदन तकनीकी रूप से मांग कर रहा है और प्रवीणता के लिए कई अभ्यास के प्रयास की आवश्यकता है।

Immunostaining के दौरान, यह प्रत्येक कर्णावत बारी शीर्ष पर चल नहीं, तरल में डूबे हुए या अच्छी तरह से की ओर करने के लिए अटक गया है कि महत्वपूर्ण है। इस ऊतक में ट्राइटन और एंटीबॉडी के अधिक पूर्ण प्रवेश की अनुमति देता है। अच्छी तरह से प्रत्येक से तरल पदार्थ को हटाने, जब वह कर्णावत बारी खो या विंदुक टिप में यह आकर्षित करने के लिए आसान है। एक विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग कर एक 200 μl विंदुक टिप के साथ समाधान बदलने इसे रोकने में मदद मिलेगी। धीरे धीरे तरल निकालने और कर्णावत बारी भी बंद हो जाता है, तो पिपेट टिप चाल। इसके अलावा एक स्वच्छ ट्यूब में अपशिष्ट समाधान pipetteting एक मोड़ गलती पिपेट में तैयार की जाती है तो इस कचरे ट्यूब खोजा जा सकता है के रूप में एक अच्छी रणनीति हो सकती है। बारी पिपेट टिप, टी में फंस जाता है तोवह टिप एक धार के साथ खुले में कटौती की जा सकती है, लेकिन यदि ऐसा होता है, तो अक्सर Corti के अंग क्षतिग्रस्त हो जाएगा।

मुसीबत शूटिंग immunostaining के लिए एंटीबॉडी, ऐसे प्रतिजन पुनर्प्राप्ति या संकेत वृद्धि के रूप में अतिरिक्त कदम से जोड़ा जा सकता है। कम पीएच और उच्च पीएच प्रतिजन खरीदा जा सकता है कि अनमास्किंग अभिकर्मकों कर रहे हैं। एक एंटीबॉडी यहाँ वर्णित विधि के साथ काम नहीं करता है, कोशिश करने के लिए पहले प्रोटोकॉल परिवर्तन इन प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तरीकों में से एक है। वैकल्पिक रूप से, एक संकेत बढ़ाने का उपयोग करें। माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेत बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि immunostaining के लिए पहले, या tyramide प्रवर्धन किट का उपयोग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान कर रहे हैं।

हम वर्तमान तकनीक के महत्व Corti के अंग के तीन आयामी संरचना को बनाए रखने के लिए और अंग के भीतर सभी कोशिकाओं कल्पना करने की क्षमता है। कोक्लीअ की पूरी लंबाई केवल तीन जाता है में विभाजित है अन्य इसी तरह की तकनीक, अर्थात् वें जबकिimmunostaining और इमेजिंग प्रक्रियाओं में पैंतरेबाज़ी करने के लिए नमूनों की संख्या बढ़ रही है, 10 टुकड़े 6-8 - ई Bohne और Liberman तरीकों, 5 में विभाजन की आवश्यकता होती है। कॉसग्रोव और Gratton द्वारा विकसित किया गया था कि कर्णावत पार्श्व दीवार विच्छेदन कौशल का एक समान स्तर की आवश्यकता है और decalcified ऊतकों में, साथ ही unfixed, ताजा ऊतक में संभव है, लेकिन Corti के अंग को अलग-थलग करने की प्रक्रिया में भाग छीन लिया और नष्ट हो जाता है पार्श्व दीवार 17। एक अन्य समूह बरकरार अंग छोड़ने सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार समझा और दूर Corti के अंग से छीन लिया गया है, जहां तीन सप्ताह पुरानी चूहों से unfixed, ताजा कर्णावत ऊतक में इसी तरह के विच्छेदन प्रदर्शन किया है। हालांकि यह केवल शिखर बारी 5 में हासिल की थी। दूर कोर्टी का अंग से सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार छीलने की विधि एक युवा माउस (<P7) 13 में तय ऊतक के विच्छेदन के लिए दिनचर्या है। हालांकि, निर्धारण एक के बाद चूहों पी 6 से अधिक उम्र के साथ हमारे अनुभव मेंडी विकैल्सीकरण, इस पैंतरेबाज़ी अक्सर एक अविश्वसनीय फैशन में Corti के अंग आँसू। इसके अलावा यहां वर्णित प्रक्रिया के मध्य और बेसल के अलगाव के रूप में अच्छी तरह से बदल जाता है की अनुमति देता है।

आयल एम्बेड करने के बाद प्राप्त cryosections और वर्गों भी आमतौर पर श्रवण क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। इन विधियों ऐसे हलकी लीक vascularis, रेइस्स्नेर की झिल्ली, और tectorial झिल्ली के रूप में अन्य संरचनाओं के दृश्य की अनुमति है, अभी तक प्रत्येक अनुभाग केवल प्रत्येक कर्णावत बदले में Corti के अंग के एक छोटे से क्षेत्र के दृश्य की अनुमति देता है। इस प्रकार सेक्शनिंग विधि के साथ इस तरह के सेल हानि या कोशिका विभाजन के रूप में एक मोज़ेक पैटर्न में होने वाली घटनाओं, जांच करने के लिए, 50 या अधिक स्लाइड दाग और कोक्लीअ की पूरी लंबाई पर कब्जा करने के imaged किया जा करने की जरूरत है। इसके विपरीत, पूरे माउंट विच्छेदन प्रोटोकॉल सिर्फ तीन टुकड़ों में कोर्टी के पूरे अंग तैयार करने का लाभ दिया है। कोर्टी का अंग की लंबाई वास्तुकला संरक्षण, इस टीईसी के लाभ के अलावाhnique सरलीकृत डेटा संग्रहण और भंडारण के लिए अनुमति देता है। पूरे माउंट विच्छेदन की एक सीमा है कि यह इस तरह के सर्पिल बंधन, हलकी लीक vascularis, रेइस्स्नेर की झिल्ली, और tectorial झिल्ली के रूप में संरचनाओं आसपास नष्ट कर देता है। एक और सीमा एक भी विच्छेदन के लिए तकनीकी कठिनाई और समय की लंबाई है। सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार हटाने जब इस वजह से त्रुटि के लिए Corti के अंग और छोटे से मार्जिन के नाजुक प्रकृति के ज्यादातर है। 30 मिनट - एक बार में महारत हासिल है, एक कोक्लीअ के पूरे माउंट विच्छेदन के बारे में 20 में किया जा सकता है।

ऊपर प्रोटोकॉल वयस्क माउस के लिए एक पूरे माउंट विच्छेदन विधि का वर्णन करते हुए, हम श्रवण क्षेत्र में इस्तेमाल अन्य मॉडल जीवों के लिए इस तकनीक को लागू करने की उम्मीद है। हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में चूहे कोक्लीअ के विच्छेदन के लिए इस तकनीक को संशोधित किया गया है। चूहे के बड़े कोक्लीअ अधिक घनी माउस से केल्सीकृत है कि एक मोटा कान का कैप्सूल में रखा जाता है। इस प्रकार लौकिक हड्डी ई जाना चाहिएबड़ी कैंची से xcised। EDTA के साथ निर्धारण और विकैल्सीकरण पहले, कान का कैप्सूल कर्णावत ऊतक के लिए बेहतर उपयोग की अनुमति के लिए कैंची से खोला जाना चाहिए। इसके अलावा विकैल्सीकरण प्रक्रिया लंबी है और नमूना की उम्र के आधार पर तीन सप्ताह तक का समय लग सकता है। पूरे माउंट विच्छेदन के लिए, बोनी भूलभुलैया का आकार तकनीक को प्रभावित करता है। चूहे कोक्लीअ की वृद्धि की आकार अलग-अलग कटौती के लिए त्रुटि के एक बड़े मार्जिन उपलब्ध कराने, सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार और Corti के अंग के बीच एक थोड़ा बड़ा दूरी प्रदान करता है। हालांकि, बड़े ऊतक नमूना के हेरफेर के लिए काबू करने के लिए और अधिक सामग्री प्रदान कर सकता है, जबकि यह भी सर्पिल बंध / पार्श्व दीवार की पूरी लंबाई को दूर करने के लिए कटौती की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है। हम अनुरूप संशोधनों चिनचिला, gerbil, और गिनी पिग से कोक्लीअ के विच्छेदन के लिए किया जा सकता है कि विश्वास करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard  pattern forceps Fine Science Tools 11000-12 can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14060-11 can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes MidSci AVSS2000 can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade Polysciences 18814 TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. 
PBS pH 7.4  Sigma P3813-10PAK can be purchased from other vendors
EDTA Fisher BP118-500 can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator Fisher 05-450-127 can be purchased from other vendors
60 mm petri dish Fisher 50-202-037 can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal Fisher AC134372500 can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope Zeiss Stemi 2000 can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps Fine Science Tools 11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors Fine Science Tools 15001-08 curved 
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors Fine Science Tools 15003-08 straight
48-well plates Fisher 08-772-52 can be purchased from other vendors
8-well chamber slides Fisher 1256518 can be purchased from other vendors
Triton X-100 Sigma X100-500 can be purchased from other vendors
BSA, fraction V Fisher BP1605 can be purchased from other vendors
NGS Vector labs S-1000 can be purchased from other vendors
NHS Vector labs S-2000 can be purchased from other vendors
3D rotator Midsci R3D-710 can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL Licor 929-97401
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media Life Technologies P36930 can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides Fisher 12-550-15 can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1 Fisher 12-548-B can be purchased from other vendors
clear nail polish Local drug store can be purchased from other vendors
cardboard slide folder Fisher 12-587-10 can be purchased from other vendors
plastic slide box Fisher 03-448-10 can be purchased from other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81, (3), 1305-1352 (2001).
  2. Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
  3. Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145, (1-2), 111-122 (2000).
  4. Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. Almqvist and Wiksell. (1966).
  5. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
  6. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109, (1-2), 34-45 (1997).
  7. Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. CRC Press. 171-187 (2001).
  8. Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
  9. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2), 781-785 (2008).
  10. Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30, (17), 5927-5936 (2010).
  11. Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31, (34), 12241-12250 (2011).
  12. Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32, (19), 6600-6610 (2012).
  13. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
  14. Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13, (5), 609-627 (2012).
  15. Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31, (33), 11855-11866 (2011).
  16. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27, (16), 4313-4325 (2007).
  17. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166, (5), 1465-1474 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics