탈 아세틸 화 분석법은 시르 투 인 사이의 상호 작용 (SIRT2) 및 특정 단백질 기판을 해명

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

체외 탈 아세틸 분석 1.

  1. SIRT2의 정제
    1. 10 % FBS와 항생제 8 ML의 DMEM에서 배양하고 70 % 합류 다음날로 37 ° C, 5 % CO 2 조직 배양 인큐베이터에서 배양하는 HEK 293T 세포를 10㎝ 배양 플레이트를 준비한다.
    2. 다음 날, 공동 트랜 4 μg의 pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2-국기 (우리의 실험실에서 만든 lentivector), 4 μg의 pCMV- dR8.2 dvpr (포장 벡터) 0.5 μg의을 pCMV-VSV-G (봉투 벡터) 3 μL PEI / μg의 DNA의 비율 18 사용 폴리에틸렌 이민 (PEI).
    3. 12 시간 후 미디어를 변경합니다.
    4. 36-48 시간 후 상층 액을 수집합니다.
    5. 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 이물질을 제거합니다.
    6. 0.22 μm의 필터를 통해 여과 한 후, SIRT2의 렌티 바이러스 1 ml의 분취 량을 -80 ℃에서 보관하십시오.
    7. 바이러스를 사용하지 않는 경우에 녹여 얼음 SIRT2 렌티은 (는 -80 ° C에서 바이러스를 저장하는 것이 중요).
    8. 8 μg의 / ㎖의 폴리 브렌의 존재 렌티 1 ㎖로 80~90% 합류 된 HEK 293T 세포를 6 웰 플레이트를 감염시킨다.
    9. 다음 날 (24 시간)까지 37 ° C 배양기에서 바이러스에 감염된 세포를 놓습니다.
    10. 24 시간 후 배지를 교체합니다.
    11. 감염 후 48 시간은 형광 현미경으로 GFP를 양성 세포를 감지하여 감염의 효율성을 확인합니다.
    12. 감염 효율이 좋은 경우에 (적어도 40-50% 감염된 세포)은 배양 배지를 세포를 발현하는 안정적인 SIRT2 대한 선택이 μg의 / ml의 퓨로 마이신을 함유하는 배지를 교체한다.
      주 :이 약 2 주가 소요 및 배지를 3-4 일마다 변경된다. 비 감염된 세포는 SIRT2의 렌티 바이러스 성장을이 선택 기간에만 감염된 세포를 통해 죽는다.
    13. 을 정제를 시작하기 전에 10 % SDS-PAGE 겔상에서 총 단백질 40 μg의 실행 후 (1000 희석 1) 항 - 플래그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 플래그 - 태그 SIRT2 발현 분석ication 과정 (권장) 19, 20.
    14. 1 활성 SIRT2, 분할 세포를 정화하려면 안정적으로 국기 - SIRT2를 과발현 HEK 293T 세포의 충분한 요리를하기 위해 트립신 3 비율 (텐 10cm 요리 후속 실험에 대한 충분한 단백질의 정제를 수 있습니다).
      1. 상기 세포를 Trypsinize 배지를 제거하고 멸균 DPBS로 세포를 세척하여 잔류 혈청을 제거하기 위해. 천천히, 세포 단층을 포함 30 ~ 45 초 동안 상온에서 부화 0.25 % 트립신 - EDTA 용액 2.5 ml를 추가합니다. 세포가 분리 시작할 때까지 트립신 - EDTA 용액을 제거한 후, 37 ° C에서 품어. 그런 문화 매체를 추가하고 새로운 요리에 세포를 전송합니다.
    15. 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 트립신 처리하여 세포를 PBS로 두 번 세포를 씻어 수집, 배지를 제거합니다.
    16. 500 ㎕의 용해 완충액 (20 mM의 HEPES pH가 7.9, 18 mM의 KCl을 0.2 mM의 EGTA, 1.5 밀리미터의 MgCl 2를 Lyse 세포 펠렛, 프로테아제 억제제 칵테일과 일정한 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 1 μM TSA를 포함하여 20 % 글리세롤, 0.1 % NP-40).
    17. 새로운 튜브 15 4 ° C에서 최소 및 전송 상층 액 14,000 XG에 원심 분리기.
    18. 후술하는 바와 같이 아가 로스 비드를 결합하는 항 - 플래그 항체를 사용하여 면역 침전 법을 수행한다.
      1. 단백질 분해물 (10 ~ 20 mg의 총 단백질)에 구슬 아가로 오스 복합 안티 - 플래그 항체의 200 ~ 300 μl를 추가합니다.
      2. 일정한 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 품어.
      3. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 immunoprecipitates를 수집합니다.
      4. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 펠렛을 10 ml의 용해 버퍼 5 회 반복한다. 각 세척 한 후, 비드 펠렛 및 버퍼 A.으로 뜨는 교체
    19. (프로테아제 억제제 칵테일 1 PBS에서 μm의 TSA 포함) 1 배 플래그 펩타이드 솔루션을 준비합니다.
    20. 1 배 플래그 peptid 500 μl를 추가아가로 오스 비즈에 전자 솔루션 및 일정 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    21. 4 ℃에서 2 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 상층 액을 수집합니다.
    22. 앞의 두 단계를 반복합니다.
    23. 4 ° C에서 1 분 동안 15,000 XG에 필터 튜브와 원심 분리를 이용하여 상층 액에서 구슬을 제거합니다.
    24. 최종 단백질 농도를 1 μg의 때까지 / 한외 여과막을 사용하여 용출 μL 샘플을 농축시킨다.
    25. 용출 된 시료의 1 μg의를 사용하여 수행하는 전기 영동으로 정제 과정을 확인합니다.
    26. 시중에서 판매하는 염색 액에 얼룩 젤 SIRT2 정화를 확인합니다.
    27. -80 ° C에서 정제 SIRT2을 유지합니다.
  2. 아세틸 단백질 기판의 정제
    1. 약 70 %의 합류 다음날로 HEK의 293T 세포를 10 ㎝의 배양 접시를 준비합니다.
    2. 국기의 5 μg의와 다음 날, 공동 트랜 세포는 플라스미드 벡터 expressin 태그g 단백질 기질뿐만 아니라 3 μL PEI / μg의 DNA의 비율로 PEI를 사용하여 단백질의 아세틸 화 수 특정 아세틸 트랜스퍼 5 μg의.
      주 : 특정 아세틸 트랜스퍼 라제는 공지되어 있지 않은 경우, 예컨대 P300, CBP, GCN5, Tip60과 PCAF 공지 히스톤 아세틸 트랜스퍼 (HAT들)의 혼합물로 공동 트랜.
    3. 12 시간 후 매체를 변경합니다.
    4. 일 세포를 용해시키기 전에, 아세틸 라제를 억제하여 단백질 - 기재의 아세틸 화 수준을 극대화하는 TSA / NAM을 포함하는 배지로 배양액을 대체하여 밤새 1 μM의 TSA 2 mM의 니코 티나 마이드 (NAM)로 세포를 처리한다.
    5. 48 시간 형질 전환 한 후, 배지를 제거 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 트립신으로 세포를 PBS로 두 번 세포를 씻어 수집합니다.
    6. 접시 당 500 ㎕의 용해 완충액에 세포를 Lyse 펠릿 (20 mM의 HEPES pH가 7.9, 18 mM의 KCl을 0.2 mM의 EGTA, 1.5 mM의 MgCl2를, 20 % 글리세롤, 0.1 % NP-40) 프로테아제 I을 포함nhibitors 칵테일, 1 μM의 TSA와 일정한 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 2 MM의 NAM.
    7. 새로운 튜브 15 4 ° C에서 최소 및 전송 상층 액 14,000 XG에 원심 분리기.
    8. 후술하는 바와 같이 아가 로스 비드를 결합하는 항 - 플래그 항체를 사용하여 면역 침전 법을 수행한다.
      1. 단백질 분해물 (10 ~ 20 mg의 총 단백질)에 구슬 아가로 오스 복합 안티 - 플래그 항체의 200 ~ 300 μl를 추가합니다.
      2. 일정한 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 품어.
      3. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 immunoprecipitates를 수집합니다.
      4. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 펠렛을 10 ml의 용해 버퍼 2 회 반복한다. 각 세척 한 후, 비드 펠렛 및 용해 버퍼 A.으로 뜨는 교체
      5. 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에서 NAM없이 펠렛을 10 ml의 용해 버퍼 3 회 반복한다. 각 세척 한 후, 비드 펠렛 및 그것은 importa이다 용해 버퍼 A.으로 뜨는 교체NT를 탈 아세틸 화 반응에 대한 NAM를 이월 할 수 없습니다.
    9. (단백질 분해 효소 억제제와 PBS에서 1 μM TSA 포함) 1 배 플래그 펩타이드 솔루션을 준비합니다.
    10. 아가로 오스 비즈로 1 배 플래그 펩티드 용액 500 μl를 추가하고 일정한 회전에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    11. 4 ℃에서 2 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 상층 액을 수집합니다.
    12. 앞의 두 단계를 반복합니다.
    13. 4 ° C에서 1 분 동안 15,000 XG에 필터 튜브와 원심 분리를 이용하여 상층 액에서 구슬을 제거합니다.
    14. 단백질 농도를 1 μg의 / UL 때까지 한외 여과막을 사용하여 용출 샘플을 농축시킨다.
    15. 4-12 % SDS-PAGE 겔상에서 용출 시료 1 μL를 실행하여 전기 영동을 수행한다.
    16. (1,000 희석 1) 단백질 기판 (희석 사용되는 특정 항체에 따라 다름) 서부 AC-K에 대한 항체를 사용하여 블로 팅에 의해 단백질 기판의 아세틸 화를 확인합니다.
    17. 푸리 유지들이었다는 -80 ° C에서 단백질 기판을 아세틸.
  3. 체외 탈 아세틸 반응
    1. 탈 아세틸 버퍼 B를 준비 (에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 1 ㎜의 MgCl 2 0.5 μM TSA)
    2. 20 ㎕의 최종 부피 (표 1)에 서로 다른 튜브에 3 개의 다른 반응을 준비합니다.
    3. (선택 사항) SIRT2에 의해 단백질 기판의 탈 아세틸를 확인하기 위해 추가 반응을 포함합니다. (NAM 대신 아세틸 라제 활성 SIRT2의 반응 (pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 H187Y -flag의 lentivector 사용 후이 1.1에 기술 된 프로토콜을 사용하여 수행 할 수 있습니다) 정제 탈 아세틸 널 (null) 돌연변이 SIRT2의 2 μg의 추가 또는 10 밀리미터에게 니코틴을 추가 ) SIRT2의 탈 아세틸 화 활성을 억제하는 반응 (표 1).
    4. 일정하게 교반하면서 30 ℃에서 3 시간 동안 반응을 품어.
    5. F 배 샘플 완충액 20 μl를 첨가하여 반응을 정지하고, 샘플을 비등또는 95 ℃에서 10 분.
    6. 4-12 % SDS-PAGE 겔상에서 반응 혼합물을 실행하여 전기 영동을 수행하고 항 AC-K 항체 (1 : 1000 희석)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 단백질 기판의 아세틸 화 상태를 검출 19,20한다.

생체 탈 아세틸 분석 2.

  1. 배양 된 세포에서 과발현 SIRT2
    1. HEK의 293T 세포와 10cm 배양 접시 안정적으로 pCDH - 순수하지 않아-GFP-빈 벡터를 과발현을 준비 pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 - 플래그 및 pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 H187Y -flag는 (1.1에서 설명) 70 일합니다 %의 합류.
    2. 대안 적으로, 세포를 약 70 % 합류로 10cm 배양 접시를 준비하고, 3 μL PEI / μg의 DNA의 비율로 PEI를 사용하여 상기 언급 한 벡터 5㎍을 사용하여 일시적 과발현을 수행한다.
    3. 국기-t의 과발현을 입증 (1,000 희석 1) 안티 - 플래그 항체를 이용하여 총 세포 추출물의 서쪽 블로 팅을 수행SIRT2 19 agged.
  2. 배양 된 세포의 최저 SIRT2에 RNA 간섭
    1. 약 70 % 합류 다음날으로 HEK 293T 세포에의 10㎝ 배양 플레이트를 준비한다.
    2. 다음 날, 공동 트랜 4 μg의 pLKO1 - 순수하지 않아 - 쉬 SIRT2 (lentivector) 19, 4 μg의 pCMV- dR8.2 dvpr (포장 벡터) 0.5 μg의을 pCMV-VSV-G (봉투 벡터) 18 사용 폴리에틸렌 이민 (PEI) 3 μL PEI / μg의 DNA가 비율.
      참고 : SIRT2을 쓰러 뜨린를 들어, 우리가 RNAi의 컨소시엄 (TRC)가 설계 한 pLKO.1의 렌티 바이러스 벡터에 간단한 머리핀 shRNA를 사용합니다.
    3. shSIRT2의 렌티 바이러스를 생산하고 SIRT2를 넉다운하는 표적 세포를 감염 1.1에 설명 된대로 절차를 따르십시오.
    4. 10 % SDS-PAGE 겔에 총 단백질의 40 μg의를 실행 한 후 효율적인 SIRT2 최저를 보여 (1,000 희석 1) 항 SIRT2 항체를 이용하여 총 세포 추출물의 웨스턴 블로 팅을 수행합니다.
    5. 또한,세포를 약 70 %의 합류로 10cm 문화 요리를 준비하고 제조업체의 지침에 따라 siRNA를를 사용 SIRT2의 과도 최저를 수행합니다.
    6. 10 % SDS-PAGE 겔에 총 단백질의 40 μg의를 실행 한 후 효율적인 SIRT2 최저를 보여 (1,000 희석 1) 항 SIRT2 항체를 이용하여 총 세포 추출물의 웨스턴 블로 팅을 수행합니다.
  3. 면역 및 면역 블 롯팅은 배양 세포에서 아세틸 레벨을 감지하는
    1. 12 시간 SIRT2를 과발현하거나 세포에서 세포 펠렛을 수집하기 전에 비 클래스 III 히스톤 아세틸 라제를 억제하는 배양 배지에 1 ㎛ TSA를 추가, (위의 2.1 참조) SIRT2 세포 (위 2.2 참조)를 무너 뜨렸다.
    2. 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 트립신 처리하여 세포를 PBS로 두 번 세포를 씻어 수집, 배지를 제거합니다.
    3. 10 ml의 용해 완충액 (20 mM의 HEPES pH가 7.9, 18 mM의 KCl을 0.2 mM의 EGTA, 1.5 추가밀리미터의 MgCl 2, 20 % 글리세롤, 프로테아제 억제제 칵테일, 1 μM의 TSA 2 MM의 NAM을 포함하여 0.1 % NP-40).
    4. 일정한 회전에서 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
    5. 4 ℃에서 15 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 상층 액을 수집합니다.
    6. 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 계산한다.
    7. 참고로 용해 완충액 A를 사용하여 표 2를 사용하여 1 ㎖의 최종 부피에서 새로운 전송 튜브 전체 단백질 1 mg의 하나 또는 과발현 SIRT2 SIRT2 최저 후의 세포로부터 단백질 샘플을 제조 하였다.
    8. 단백질 A / G와 함께 특정 단백질 기판에 대한 항체를 사용하여 면역 침전을 수행합니다 (40 μl의 비드 슬러리 권장). 또한, 모든 아세틸 화 단백질을 면역 침전에 구슬을 아가로 오스 복합 항 AC-K 항체 (20 μl의 비드 슬러리는 일반적으로 충분하다)를 사용합니다.
    9. 정전류 회로에서 4 ° C에서 샘플을 품어NT를 회전 하룻밤.
    10. 4 ℃에서 2 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 immunoprecipitates를 수집합니다.
    11. 4 ° C에서 2 분 동안 1,000 XG에 구슬 1 ml의 버퍼와 5 회 반복한다.
    12. 배 샘플 버퍼의 40 μL에 재현 탁 구슬.
    13. 95 ° C에서 10 분 동안 삶아 샘플.
    14. 용출 샘플을 전송하는 동안 구슬을 방해하지 않고 4-12 % SDS-PAGE 겔에 용출 된 샘플 (단계 2.3.12에서 40 μl를) 실행하여 전기 영동을 수행합니다.
    15. 단백질 기질에 특이적인 항체는 면역에 사용 된 경우 (1000 희석 1), 또는 단백질이 기판에 대해 특정 항체 (위한 권장 사항을 방지 AC-K 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 단백질 기판의 아세틸 화 수준을 감지 안티 AC-K 비드 면역에 사용 된 경우에 대하여 특이 적 항체 희석).

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Representative Results

단백질을 위해 시험 관내 및 생체 내 탈 아세틸 분석 모두에서 탈 아세틸 화 활성을 갖는 임의의 효소를 탈 아세틸 적법한 대상으로서 취급 할 아세틸 라제 및 기판 사이의 상호 작용을 확립하기 위해 수행 될 필요가있다. 분석이 완료되기 전에 시험 관내 아세틸 라제 분석을 위해, 아세틸 라제 및 아세틸 단백질 기질 모두의 정제가 필요하다. 여기에서 우리는 특정 아세틸 라제 공부 할로 세포질 시르 투 SIRT2를 사용합니다. SIRT2 고도로 아세틸 화 분석을위한 음성 대조구로 추천 아세틸 라제 효소 및 아세틸 라제 활성이 결여 변이주의 사용이다. 1.1에 기재된 정제 과정을 사용하여, SIRT2 및 SIRT2 H187Y 모두 성공적 1 μg의 / μL의 최종 농도로 정제 할 수있다. 이는 염색 하였다 겔상에서 정제 된 단백질을 실행 한 후에 확인할 수있다뿐만 아니라 SIRT2와 SIRT2 H187Y 모두 플래그 펩타이드 (그림 2A, 낮은) 태그 때문에 서쪽 블로 팅 후 안티 - 플래그 항체를 이용하여 (위 그림 1A). 같은 정제 과정을 일부 수정을 단백질 기질의 정제 하였다 될 수있다. 단백질이 그것이 특정 아세틸 트랜스퍼 또는 단백질 아세틸 수 모자 혼합물을 과발현하는 세포를 정제 할 필요가 있다는 것을 의미 탈 아세틸 화 분석에 사용될 수 있기 전에 아세틸 화 될 필요가있다. 1.2에 기재된 정제 방법을 사용하여 아세틸 화 단백질 (상부도 1b)로 정제 할 수있다. 단백질이 실제로 아세틸 및 체외 탈 아세틸 화 분석에 사용될 수 있음을 확인하기 위해, 항 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블 롯팅은 아세틸 트랜스퍼 (도 1b를 과발현하는 세포의 정제 된 단백질의 증가 된 아세틸 화 수준을 표시 할 필요가 있고, 로우아르 자형).

성공적인 단백질 정제 후, 탈 아세틸 화 시험 관내 분석을 수행 할 수있다. SIRT2 포함 시르 투 인은, 그들이 효소 기능을 위해 NAD +를 필요로 다른 아세틸 라제 구별되는 클래스 III 히스톤 라이신 아세틸 라제입니다. 이와 일관되게, 더 탈 아세틸 화는, NAD +의 부재 하에서 안티 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출 할 수없는 관계없이 촉매 활성 SIRT2의 존재 (도 2 대, 2 레인 1). 반대로 SIRT2 및 NAD + 모두 반응에 존재 단백질 SIRT2위한 탈 아세틸 타겟으로 간주 될 수 있다는 제안 아세틸 단백질의 아세틸 화 수준을 감소시켰다. 이러한 결과를 검증하기 위하여, 다른 음성 대조군이 이용 될 수있다. 예를 들어 단백질의 아세틸 화 수준에 차이가 검출되지 않을 때 탈 아세틸 결핍 SIRT2 (SIRT2 H187Y))은 4 대 대신에 촉매 활성 야생형 SIRT2 (도 2, 레인 5 사용된다. 노포 시르 투 억제제 NAM은 단백질의 아세틸 화 수준의 감소가 SIRT2 아세틸 라제의 활성에 의해 매개되는 것을 암시 반응 혼합물에 첨가시 동일한 효과를 볼 수있다.

비정상적인 탈 아세틸 화는 여러 세포 프로세스 및 노화 관련 질병에 참여하고있다. 따라서, 아세틸 라제 및 기판 사이의 상호 작용에 관한 우리 지식을 심화 중요한 단계는 이러한 현상이 생리적 영향을 미칠 수있다 셀이 상호 접속을 확립하는 것이다. 또한, 생체 내에서 세포 배양 시스템에서의 탈 아세틸 화를 확인하기 쉽게 특정 표현형 결과에 연결될 수있다 세포 또는 조직에 특정 콘텍스트 탈 아세틸 이벤트의 조사를 허용한다. 이 시험 관내에서 검출 딕 가능성을 배제etylation 활동으로 인한 정상 세포의 생리 학적 조건하에 발생하지 않을 수있다 아세틸 라제 동시에 튜브 기질 모두의 존재 인공이다. 생체 내 탈 아세틸 분석 들어 SIRT2 및 SIRT2 H187Y뿐만 아니라 단백질 기질 모두 과발현 세포를 2.1 및 2.2에 기술 된 절차에 따라 사용될 수있다. 이들 세포로부터 제조 된 세포 추출물을 SIRT2, SIRT2 H187Y 표현 확인 될 수 있고, 웨스턴 블 롯팅에 의해 단백질 기질은 특이 적 항체를 사용. 여기에 설명 된 분석에서 모든 외생 발현 된 단백질은 (HA-태그 SIRT2가 / SIRT2 H187Y 및 중간 패널의 국기 태그가 단백질 기판을 감지하는 감지하는 그림 3, 낮은 패널)의 실험의 편의를 위해 태그가 지정됩니다. 표적 단백질의 탈 아세틸 SIRT2 기판인지를 결정하기 위해 면역 대상 단백질 (F)를 풀다운 방지 플래그 항체를 사용하여 수행안티 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 ollowed. SIRT2를 발현하는 세포에서의 단백질의 아세틸 화 수준을 감소하는 것이 제안 (3 대도 3 상판, 레인 4) (도 3 상판, 레인 3 대 2) 세포에서 아세틸 화 수준에 영향을 미치는 고장 아세틸 라제 결손 SIRT2 변이체를 발현 아세틸 화 단백질은 생체 내에서 특정의 탈 아세틸 라제의 대상이 될 수있다. SIRT2 매개 탈 아세틸이 연구 셀 (도 3 상판 레인 5 대 3)과 NAM 특정 아세틸 라제 기판 축을 설정을 처리 한 후 세포를 저해 때 더 확인할 수있다.

그림 1
도 1 및 아세틸 라제 단백질 기질 모두 정제 관내 탈 아세틸 화 분석에 사용될. (A) 및 SIRT2 SIRT2 H187Y (탈 아세틸 결함 돌연변이) 모두 1 μg의 1.1에 기재된 바와 같이 정제 프로토콜 다음 겔상에서 실행 하였다. 겔 시판 염색 액으로 탈색 및 염색 한 후, 정제 된 단백질 양 (위)를 검출 할 수있다. 단백질은 항 - 플래그 항체 (저급)를 사용하여 PVDF 막 및 웨스턴 블롯에 전사 한 후 검출 될 수있다. (B) 단백질 기판 하이퍼 아세틸 화 된 단백질 기질 1 μg의 1.2에 기재된 바와 같이 정제 프로토콜 다음 겔상에서 실행 하였다 (알파 -에 놀라 우리 실험실에서 생성 된 질량 분석 미발표 데이터에 기초 SIRT2 기판으로 사용 하였다). 겔 시판 염색 액으로 염색하고, 탈색 후 정제 된 단백질 기판 (위)를 검출 할 수있다. 아세틸 화는 안티 AC-K 항체 (중간)을 사용하여 PVDF 막 및 웨스턴 블롯에 전사 한 후 검출 될 수있다. 총 페이지 roteins이 방지 플래그 항체 (아래)를 사용하여 검출 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 탈 아세틸 관내 분석에서 정제 된 단백질의 아세틸 화 된 기판 (알파 -에 놀라 제)를 NAD +의 존재 또는 SIRT2 SIRT2 H187Y (탈 아세틸 결함 돌연변이)로 배양된다 (레인 4 및 5). 감소 아세틸 레벨 SIRT2의 존재하지만 SIRT2 H187Y의 존재 (레인 4 대 5)에 반 AC-K 항체를 사용하여 웨스턴 블 롯팅에 의해 검출된다. NAD +는 반응 혼합물에 포함되어 있지 않은 경우 어떠한 탈 아세틸 화 활성이 관찰되지 않는다 (레인 2 대 4) 또는 NAM을 반응 혼합물에 첨가되는 경우 (레인 6 대 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
3. 안정적 SIRT2 또는 SIRT2 H187Y를 과발현하는 생체 탈 아세틸 분석 HEK293T 세포 단백질 (레인 2 대 1)의 아세틸 화 수준을 증가시키는 단백질, 기판 (알파 -에 놀라 제)와 모자와 공동 형질 감염시켰다. 탈 아세틸 화는 안티 AC-K 항체를 이용하여 단백질 기판과 서쪽 블로 팅을 끌어 방지 플래그 항체를 이용하여 면역 침전 후 생체 내에서 조사 하였다. 아세틸 상당히 과발현 세포 SIRT2 H187Y에 비해 SIRT2 과발현 세포에서 감소된다 (레인 3 대 4). SIRT2 매개 탈 아세틸 화세포 NAM. (3 대 레인 5)로 처리하면 단백질 기판이 억제된다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

반응 1 (2) 4 (선택 사항) 5 (선택 사항)
정제 된 아세틸 화 단백질 기판 (10 μg의) + + + + +
버퍼 B + + + + +
정제 SIRT2 (2 μg의) - + + - +
NAD + (1 mΜ) - - + + +
정제 SIRT2의 H187Y (2 μg의) - - - + -
NAM (10 밀리미터) - - - - +

표 1 : 반응 재료입니다.

견본 과발현 다운
1 pCDH - 순수하지 않아-GFP-빈 벡터 pLKO1 빈 벡터 또는시의 클릭률 (CTR)
(2) pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2-국기 pLKO1 쉬 SIRT2 1시 SIRT2 1
pCDH - 순수하지 않아-GFP-SIRT2 H187Y -flag pLKO1 쉬 SIRT2 2시 SIRT2 2

표 2 : 단백질 샘플.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

우리는하고 싶은 AV로 Lefkofsky 가족 재단 / 리즈와 에릭 Lefkofsky 혁신 연구 상 - 여기에 설명이 프로젝트는 NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1)에서 부여에 의해뿐만 아니라 로버트 H. 루리 종합 암 센터 지원 중요한 읽기와이 원고를 편집하기위한 실험실의 구성원 (캐롤 O'Callaghan와 엘리자베스 앤 웨인) 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

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