Deacetylering Analyser å greie samspillet mellom sirtuins (SIRT2) og spesifikt protein-substrater

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. In Vitro Deacetylering analyse

  1. Rensing av SIRT2
    1. Forbered en 10 cm kultur rett av HEK 293T celler dyrket i 8 ml DMEM med 10% FBS og antibiotika og dyrket i en 37 ° C, 5% CO 2 vevsdyrkningsinkubator å være ca 70% konfluent neste dag.
    2. Neste dag, co-transfeksjon 4 mikrogram pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector gjort i vår lab), 4 mikrogram pCMV- dR8.2 dvpr (emballasje vektor) og 0,5 mikrogram pCMV-VSV-G (konvolutt vektor) 18 ved hjelp av polyetylenimin (PEI) ved et forhold på 3 ul PEI / ug DNA.
    3. Endre media etter 12 timer.
    4. Samle supernatanten etter 36-48 timer.
    5. Fjern avfall ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 min ved 4 ° C.
    6. Etter filtrering gjennom 0,22 um filter, lage 1 ml alikvoter av SIRT2 lentivirus og hold ved -80 ° C.
    7. Tine SIRT2 lentivirus på is (det er viktig å lagre viruset ved -80 ° C når viruset ikke benyttes).
    8. Infisere en 6-brønns plate av 80-90% sammenflytende HEK-293T-celler sammen med 1 ml av lentivirus i nærvær av 8 mikrogram / ml polybren.
    9. Plasser virus-infiserte celler i 37 ° C inkubator inntil den neste dag (24 timer).
    10. Erstatt medium etter 24 timer.
    11. 48 timer etter infeksjon, kontrollere infeksjon effektivitet ved påvisning av GFP-positive celler under et fluorescerende mikroskop.
    12. Hvis infeksjonen effektivitet er god (minst 40-50% infiserte celler), erstatte mediet med dyrkningsmedium inneholdende 2 ug / ml puromycin for å selektere for stabil SIRT2 spissen uttrykkende celler.
      Merk: Dette tar ca 2 uker, og mediet endres hver 3-4 dager. Ikke-infiserte celler dør i løpet av dette valget periode og bare infiserte celler med SIRT2 lentivirus vokse.
    13. Analysere ekspresjon av Flag-tagged SIRT2 ved Western blotting ved å bruke et anti-Flag-antistoff (1: 1000 fortynning) etter å ha kjørt 40 ug av total-protein på en 10% SDS-PAGE-gel før man starter Purification prosess (anbefales) 19,20.
    14. Å rense aktiv SIRT2, dele celler i 1: 3 ved trypsinering for å ha nok retter av HEK 293T celler som stabilt overuttrykker Flag-SIRT2 (ti 10 cm retter vil tillate rensing av nok protein for senere eksperimenter).
      1. Å trypsineres cellene, fjerner kulturmedium og eliminere gjenværende serum ved å skylle celler med sterile DPBS. Tilsett langsomt 2,5 ml av en 0,25% Trypsin-EDTA-løsning for å dekke cellemonolaget, inkuber ved romtemperatur i 30-45 sek. Etter fjerning av Trypsin-EDTA-løsning, inkuberes ved 37 ° C inntil cellene begynner å løsne. Deretter legger kultur medium og overføre celler til nye retter.
    15. Fjerne dyrkningsmediet, vaskes cellene to ganger i PBS og samle celler ved trypsinering, etterfulgt av sentrifugering ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    16. Lyse cellepelleten i 500 ul lyseringsbuffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glyserol, 0,1% NP-40) som inkluderer en protease-inhibitorer cocktail og en uM TSA i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotasjon.
    17. Sentrifuger ved 14000 x g i 15 min ved 4 ° C og overføring supernatanten til et nytt rør.
    18. Utføre immunoutfelling ved å bruke et anti-Flag-antistoff konjugert til agarosekuler som beskrevet nedenfor.
      1. Legg 200-300 ul av anti-Flag-antistoff konjugert til agarosekuler til proteinet lysat (10-20 mg totalprotein).
      2. Inkuber over natten ved 4 ° C med konstant omrøring.
      3. Samle immunopresipitater ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 min ved 4 ° C.
      4. Vask pelleten 5 ganger med 10 ml lyseringsbuffer A ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C. Etter hver vask, pellet perlene og erstatte supernatanten med buffer A.
    19. Forbered 1x Flag peptidløsning (inkludert en proteasehemmere cocktail og en uM TSA i PBS).
    20. Legg 500 mL av 1x Flag peptide løsning på agarosekuler og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotasjon.
    21. Samle supernatanten ved sentrifugering ved 6000 x g i 2 min ved 4 ° C.
    22. Gjenta to foregående trinn.
    23. Fjerne perlene fra supernatanten ved hjelp av filterrørene og sentrifugering ved 15.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
    24. Konsentrer eluerte prøven før den endelige proteinkonsentrasjonen er 1 mikrogram / mikroliter ved anvendelse av en ultrafiltreringsmembran.
    25. Sjekk renseprosess ved å utføre elektroforese ved bruk av 1 ug av den eluerte prøven.
    26. Flekk-gel med en kommersielt tilgjengelig fargeløsning for å bekrefte SIRT2 rensing.
    27. Hold renset SIRT2 ved -80 ° C.
  2. Rensing av acetylert Protein-substrat
    1. Forbered 10 cm x 10 cm kultur retter med HEK 293T celler til å være ca 70% konfluent neste dag.
    2. Den neste dag, co-transfektere celler med 5 mikrogram av et flagg merket plasmid vektor expressing protein-substrat, så vel som 5 ug av den spesifikke acetyl-transferase som kan acetylere proteinet ved bruk av PEI i et forhold på 3 ul PEI / ug DNA.
      Merk: Hvis den spesifikke acetyl-transferase ikke er kjent, co-transfeksjon med en blanding av kjente histone acetyltransferaser (HATS) som p300, CBP, GCN5, Tip60 og PCAF.
    3. Endre medium etter 12 timer.
    4. Dagen før lysering av celler, behandling av cellene med 1 uM TSA og 2 mM nikotinamid (NAM) over natten ved å erstatte kulturmedium med medium som inneholdt TSA / NAM å maksimere acetylering nivåer av protein-substrat ved å hemme deacetylases.
    5. 48 timer etter transfeksjon, fjerne dyrkningsmediet, vaskes cellene to ganger i PBS og samle celler ved trypsinering, etterfulgt av sentrifugering ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    6. Lyse cellepelleten i 500 ul lyseringsbuffer A pr tallerken (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) som inkluderer en protease inhibitors cocktail, 1 uM TSA og 2 mM NAM i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotasjon.
    7. Sentrifuger ved 14000 x g i 15 min ved 4 ° C og overføring supernatanten til et nytt rør.
    8. Utføre immunoutfelling ved å bruke et anti-Flag-antistoff konjugert til agarosekuler som beskrevet nedenfor.
      1. Legg 200-300 ul av anti-Flag-antistoff konjugert til agarosekuler til proteinet lysat (10-20 mg totalprotein).
      2. Inkuber over natten ved 4 ° C med konstant omrøring.
      3. Samle immunopresipitater ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 min ved 4 ° C.
      4. Vask pelleten 2 ganger med 10 ml lyseringsbuffer A ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C. Etter hver vask, pellet perlene og erstatte supernatanten med lysis buffer A.
      5. Vask pelleten 3 ganger med 10 ml lyseringsbuffer A uten NAM ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C. Etter hver vask, pellet perlene og erstatte supernatanten med lysis buffer A. Det er important ikke å bære over en hvilken som helst NAM til deacetyleringsreaksjon.
    9. Forbered 1x Flag peptidløsning (inkludert proteasehemmere og 1 pM TSA i PBS).
    10. Legge til 500 ul av 1 x Flag peptid løsning på agarosekuler og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotasjon.
    11. Samle supernatanten ved sentrifugering ved 6000 x g i 2 min ved 4 ° C.
    12. Gjenta to foregående trinn.
    13. Fjerne perlene fra supernatanten ved hjelp av filterrørene og sentrifugering ved 15.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
    14. Ved hjelp av en ultrafiltreringsmembran, konsentrer eluert prøven inntil proteinkonsentrasjonen er 1 ug / ul.
    15. Utføre elektroforese ved å kjøre 1 pl av den eluerte prøve på en 4-12% SDS-PAGE-gel.
    16. Bekrefte acetylering av protein-substrat ved hjelp av Western-blotting ved å bruke antistoffer mot Ac-K (1: 1000 fortynning) og protein-substrat (fortynning avhenger av det spesifikke antistoff som brukes).
    17. Hold purisert acetylert protein-substrat ved -80 ° C.
  3. In Vitro deacetyleringsreaksjon
    1. Klargjør deacetyleringen buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 0,5 uM TSA)
    2. Forbered 3 forskjellige reaksjoner i forskjellige rør i 20 ul endelig volum (tabell 1).
    3. Omfatte ytterligere reaksjoner for å bekrefte deacetylering av proteinet-substratet ved SIRT2 (valgfritt). Tilsett 2 mikrogram av renset deacetylering null mutant SIRT2 (dette kan gjøres ved hjelp av protokollen beskrevet i 1.1 etter å ha brukt en pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag lentivector) til reaksjonen i stedet for deacetylase aktiv SIRT2 eller legge til 10 mM nikotinamid (NAM ) til reaksjonsblandingen for å hemme deacetyleringen aktiviteten av SIRT2 (tabell 1).
    4. Inkuber reaksjoner i 3 timer ved 30 ° C under konstant omrøring.
    5. Stopp reaksjonen ved å tilsette 20 ul av 2x prøvebuffer og koke prøvene feller 10 min ved 95 ° C.
    6. Utføre elektroforese ved å kjøre reaksjonsblandingen på en 4-12% SDS-PAGE-gel og detektere acetylering status for protein-substrat ved hjelp av Western-blotting ved anvendelse av en anti Ac-K-antistoff (1: 1000 fortynning) 19,20.

2. I Vivo Deacetylering analyse

  1. SIRT2 Overuttrykte i dyrkede celler
    1. Forbered 10 cm kultur retter med HEK 293T celler som stabilt overuttrykker pCDH-puro-GFP-tom vektor, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag og pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (som beskrevet i 1.1) til å være om 70 % sammenflytende.
    2. Alternativt fremstille 10 cm kulturskåler med celler i omtrent 70% konfluens og utføre transient over-ekspresjon under anvendelse av 5 pg av vektorer som er nevnt ovenfor ved bruk av PEI i et forhold på 3 ul PEI / ug DNA.
    3. Utføre Western-blotting av de totale cellulære ekstrakter ved hjelp av et anti-Flag-antistoff (1: 1000 fortynning) for å påvise overekspresjon av Flag-tagged SIRT2 19.
  2. RNA interferens til knockdown SIRT2 i dyrkede celler
    1. Forbered en 10 cm kultur rett av HEK 293T celler til å være ca 70% konfluent neste dag.
    2. Neste dag, co-transfeksjon 4 mikrogram pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 mikrogram pCMV- dR8.2 dvpr (emballasje vektor) og 0,5 mikrogram pCMV-VSV-G (konvolutt vektor) 18 bruker polyetylenimin (PEI) ved et forhold på 3 ul PEI / ug DNA.
      Merk: For å slå ned SIRT2, bruker vi enkle hårnål shRNAs i pLKO.1 lentiviral vektor designet av The RNAi Consortium (TRC).
    3. Følg prosedyren som beskrevet i 1.1 til produsere shSIRT2 lentivirus og infisere målceller for å knockdown SIRT2.
    4. Utføre Western-blotting av de totale cellulære ekstrakter ved hjelp av et anti-SIRT2-antistoff (1: 1000 fortynning) for å demonstrere effektiv SIRT2 knockdown etter å ha kjørt 40 ug av total-protein på en 10% SDS-PAGE-gel.
    5. Alternativt,forberede 10 cm kultur retter med celler ca 70% sammenflytende og utføre forbigående knockdown av SIRT2 hjelp sirnas følgende produsentens instruksjoner.
    6. Utføre Western-blotting av de totale cellulære ekstrakter ved hjelp av et anti-SIRT2-antistoff (1: 1000 fortynning) for å demonstrere effektiv SIRT2 knockdown etter å ha kjørt 40 ug av total-protein på en 10% SDS-PAGE-gel.
  3. Immunpresipitasjon og Immunoblotting å oppdage acetylert Levels i dyrkede celler
    1. 12 timer før innsamling av cellepelletene fra celler som overuttrykker enten SIRT2 (se 2.1 ovenfor) eller SIRT2 slås ned celler (se 2.2 ovenfor), tilsett 1 um TSA til kulturmediet for å hemme uten klasse III histon deacetylases.
    2. Fjerne dyrkningsmediet, vaskes cellene to ganger i PBS og samle celler ved trypsinering, etterfulgt av sentrifugering ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    3. Tilsett 10 ml lyseringsbuffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 1,5mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40) som inkluderer en protease inhibitorer cocktail, 1 uM TSA og 2 mM NAM.
    4. Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter under konstant rotasjon.
    5. Samle supernatanter ved sentrifugering ved 20.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C.
    6. Beregne proteinkonsentrasjon ved hjelp av en Bradford proteinanalyse.
    7. Overføring 1 mg totalt protein til nye rør i et sluttvolum på 1 ml ved hjelp av lyseringsbuffer A. Bruk tabell 2 som en referanse for å fremstille proteinprøver fra celler som overuttrykker enten SIRT2 eller etter SIRT2 knockdown.
    8. Utføre en immunoutfelling ved å bruke et antistoff mot det spesifikke protein-substrat sammen med protein A / G (40 ul perle slurry anbefales). Alternativt kan du bruke en anti Ac-K antistoff konjugert til agarose perler (20 ul perle slurry er vanligvis nok) til å immunpresipitere alle acetylert proteiner.
    9. Inkuber prøver ved 4 ° C under constant rotasjon over natten.
    10. Samle immunopresipitater ved sentrifugering ved 1000 x g i 2 min ved 4 ° C.
    11. Vask kulene 5 ganger med 1 ml buffer A ved 1000 xg i 2 min ved 4 ° C.
    12. Resuspender perler i 40 ul av 2x prøvebuffer.
    13. Koke prøvene i 10 minutter ved 95 ° C.
    14. Utfør elektroforese ved å kjøre eluerte prøvene (40 ul fra trinn 2.3.12) på en 4-12% SDS-PAGE gel uten å forstyrre perlene ved overføring av de eluerte prøvene.
    15. Detektere acetylerte nivåer av protein-substrat ved hjelp av Western blotting ved å bruke et anti-Ac-K-antistoff (1: 1000 fortynning) dersom et protein-substrat spesifikt antistoff ble anvendt for immunopresipitering, eller et spesifikt antistoff mot protein-substrat (følge anbefalingene for den spesifikke antistoff angående fortynning) hvis anti Ac-K-glassperlene ble anvendt for immunopresipitering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at et protein skal betraktes som et legitimt deacetylering mål for hvilket som helst enzym med deacetylering aktivitet, både in vitro og in vivo analyser deacetylering må utføres for å etablere sammenhengen mellom deacetylase og dets substrat. For in vitro-deacetylase-analysen, er rensing av både deacetylase og det acetylerte proteinsubstrat nødvendig før analysen kan skje. Her bruker vi cytoplasma Sirtuin SIRT2 som den spesifikke deacetylase å bli undersøkt. SIRT2 er en deacetylase enzym og anvendelse av en mutant som mangler deacetylase aktivitet er sterkt anbefalt som en negativ kontroll for deacetyleringen analysen. Ved bruk av renseprosedyren som er beskrevet i 1.1, kan både SIRT2 og SIRT2 H187Y med hell renset ved en sluttkonsentrasjon på 1 pg / pl. Dette kan bekreftes etter å ha kjørt rensede proteiner på en gel, etterfulgt av farging(Figur 1A, øvre del) samt etter western blotting ved å bruke et anti-Flag-antistoff, siden både SIRT2 og SIRT2 H187Y er merket med et flagg peptid (figur 2A, lavere). Den samme renseprosedyre kan følges for rensing av proteinet substratet med noen modifikasjoner. Proteinet må være acetylert før det kan brukes for deacetyleringen assay som betyr at den må renses i celler som overuttrykker den spesifikke acetyl transferase eller en blanding av hatter i stand til å acetylere proteinet. Ved bruk av renseprosedyren som er beskrevet i 1,2, kan det acetylerte proteinet renses (figur 1B, øverst). For å bekrefte at proteinet faktisk acetylert og kan anvendes for in vitro-deacetyleringen assay er nødvendig for western blotting ved å bruke et anti Ac-K-antistoff for å vise økt acetylerte nivåer av det rensede protein i celler som overuttrykker den acetyl-transferaser (figur 1B, lower).

Etter vellykket proteinrensing, kan den in vitro-analyse deacetyleringen utføres. Sirtuins, inkludert SIRT2, er klasse III histone lysin deacetylases som er forskjellig fra andre deacetylases som de krever NAD + for deres enzymatisk funksjon. I samsvar med dette, kan ikke deacetylering bli detektert ved Western-blotting ved anvendelse av en anti Ac-K-antistoff i fravær av NAD +, uavhengig av tilstedeværelse av katalytisk aktivt SIRT2 (figur 2, spor 2 vs 1). Tvert imot, redusert acetylerte nivåer av acetylerte proteiner når både SIRT2 og NAD + er tilstede i reaksjons tyder på at proteinet kan betraktes som et mål for deacetylering SIRT2. For å bekrefte disse resultater, kan forskjellige negative kontroller anvendes. For eksempel kan påvises noen forskjell i deacetyleringen nivåer av proteinet når en deacetylering mangelfull SIRT2 (SIRT2 H187Y) brukes i stedet for den katalytisk aktive villtype SIRT2 (figur 2, spor 5 vs 4). Lignende effekt kan ses når en veletablert Sirtuin inhibitor, NAM, tilsettes til reaksjonsblandingen, noe som tyder på at nedgangen i de acetylerte nivåer av proteinet er mediert av deacetylase aktiviteten av SIRT2.

Avvikende deacetylering er involvert i flere cellulære prosesser og aldersrelaterte sykdommer. Dermed er et viktig skritt i å utdype vår kunnskap om samspillet mellom en deacetylase og underlaget for å etablere denne samtrafikk i cellene der dette fenomenet kan ha en fysiologisk effekt. Videre sjekker deacetylering i cellekultursystemer in vivo tillater studiet av deacetylering arrangementet i en celle eller vev bestemt kontekst som lettere kan kobles til en spesifikk fenotype eller utfall. Dette utelukker muligheten for at det påvises in vitro Deacetylation aktivitet er kunstig på grunn av nærværet av både den deacetylase og dets substrat i røret på samme tid, som aldri kan skje under normale fysiologiske betingelser i celler. For in vivo-deacetyleringen assay, kan celler som overuttrykker både SIRT2 og SIRT2 H187Y samt proteinsubstratet benyttes ifølge fremgangsmåtene beskrevet i 2.1 og 2.2. Celleekstrakter fremstilt fra disse cellene kan bekreftes å uttrykke SIRT2, SIRT2 H187Y, og proteinet underlaget ved western blotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. I analysen beskrevet her, alt eksogent uttrykte proteiner blir kodet for å lette de utførte forsøkene (figur 3, nedre panel for å detektere HA-merket SIRT2 / SIRT2 H187Y og midtpanelet for å detektere Flag-merket protein-substrat). For å avgjøre om målet protein er en deacetylering substrat av SIRT2 er immunoprecipitation utføres ved hjelp av en anti-Flag antistoff til å trekke ned målet protein followed av western blotting ved hjelp av en anti Ac-K antistoff. Nedgang i de acetylerte nivåer av protein i celler som uttrykker SIRT2 (figur 3 øvre panel, spor 3 vs 2) og unnlatelse av å påvirke acetylerte nivåer i celler som uttrykker den deacetylase mangelfull SIRT2 mutant (figur 3 øvre panel, spor 4 vs 3) antyder at det acetylerte protein kan være et mål deacetylering av den spesifikke deacetylase in vivo. Dette kan bekreftes ytterligere ved SIRT2-mediert deacetylering blir inhibert etter behandling av celler med NAM (figur 3 øvre panel, spor 5 vs 3) opprettelse av de spesifikke deacetylase-substrat-aksen i de undersøkte celler.

Figur 1
Figur 1: Rensing av både deacetylase og det acetylerte protein-substrat som skal anvendes for in vitro assay deacetyleringen. (A) 1 ug av både SIRT2 og SIRT2 H187Y (deacetylering defekt mutant) ble kjørt på en gel etter renseprotokoll som er beskrevet i 1.1. Gelen ble farget med en kommersielt tilgjengelig fargeløsning og etter avfarging, både rensede proteiner kan påvises (øvre). Proteiner kan påvises etter overføring på PVDF-membran og western blotting ved å bruke et anti-Flag-antistoff (lavere). (B) 1 ug protein-substrat og hyper acetylert proteinsubstrat (alfa-enolase ble anvendt som en SIRT2 substrat basert på massespektrometri upubliserte data som er generert i vårt laboratorium) ble kjørt på en gel etter renseprotokoll som er beskrevet i 1.2. Gelen ble farget med en kommersielt tilgjengelig fargeløsning og etter avfarging, kan det rensede protein substratet påvises (øvre). Acetylering kan påvises etter overføring på PVDF-membran og western blotting ved å bruke et anti-Ac-K-antistoff (i midten). Total p roteins kan oppdages ved hjelp av en anti-Flag antistoff (lavere). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: In vitro-assay deacetylering Renset acetylert proteinsubstrat (alfa-enolase) blir inkubert med SIRT2 eller SIRT2 H187Y (deacetylering defekt mutant) i nærvær av NAD + (søyle 4 og 5). Redusert acetylerte nivåer blir detektert ved Western-blotting ved anvendelse av en anti Ac-K-antistoff i nærvær av SIRT2, men ikke i nærvær av SIRT2 H187Y (felt 4 vs 5). Ingen deacetylering aktivitet er observert når NAD + er ikke inkludert i reaksjonsblandingen (kolonne 2 vs 4) eller når NAM tilsettes til reaksjonsblandingen (felt 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: In vivo-analyse deacetylering HEK293T celler som stabilt overuttrykker enten SIRT2 eller SIRT2 H187Y ble ko-transfektert med proteinsubstratet (alfa-enolase) og hatter for å øke de acetylerte nivåer av protein (spor 2 vs 1). Deacetylering ble sjekket in vivo etter immunpresipitering hjelp av en anti-Flag antistoff til å trekke ned protein underlaget og western blotting ved hjelp av en anti Ac-K antistoff. Acetylering er betydelig redusert i SIRT2 overekspresjon celler sammenlignet med den SIRT2 H187Y overekspresjon-celler (kolonne 3 vs 4). Den SIRT2-mediert deacetyleringav proteinet underlaget hemmes når cellene behandles med NAM (spor 5 vs 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

reaksjoner 1 2 3 4 (valgfritt) 5 (valgfritt)
renset acetylert protein-substrat (10 mikrogram) + + + + +
buffer B + + + + +
renset SIRT2 (2 mikrogram) - + + - +
NAD + (1 um) - - + + +
renset SIRT2 H187Y (2 mikrogram) - - - + -
NAM (10 mM) - - - - +

Tabell 1: Reaksjons ingredienser.

prøver overekspresjon slå ned
1 pCDH-puro-GFP-tom vektor pLKO1 tom vektor eller si ctr
2 pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag pLKO1 sh SIRT2 en eller si SIRT2 1
3 pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -Flag pLKO1 sh SIRT2 to eller si SIRT2 2

Tabell 2: Proteinprøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Prosjektet er beskrevet her ble støttet av en bevilgning fra NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) samt av Robert H. Lurie Omfattende Cancer Center - The Lefkofsky Family Foundation / Liz og Eric Lefkofsky Innovation forskningspris til AV Vi ønsker å takke medlemmene av laboratoriet (Carol O'Callaghan og Elizabeth Anne Wayne) for kritisk lesing og redigering av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. e51682 (2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics